Vât liệu và phương pháp nghiên cứu

P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 
34 
Các mồi RAPD thuộc 2 nhóm OPA và OPC được cung cấp từ hãng Fermentas (Lithuania). 
Bảng 2. Danh sách các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 
Mồi 
Trình tự mồi 
Mồi 
Trình tự mồi 
OPA1 
5’- CAGGCCCTTC -3’ 
OPA19 
5’- CAACGTCGGT -3’ 
OPA7 
5’-GAAACGGGTC -3’ 
OPA20 
5’- GTTGCGATCC -3’ 
OPA12 
5’- TCGGCGATAG -3’ 
OPC1 
5’-TTCGAGCCAG -3’ 
OPA13 
5’- CAGCACCCAC -3’ 
OPC3 
5’- GGGGGTCTTT -3’ 
OPA15 
5’- TTCCGAACCC -3’ 
OPC12 
5’- TGTCATCCCC -3’ 
OPA17 
5’- GACCGCTTGT -3’ 
OPC20 
5’- TTCCCCCCAG -3’ 
H 
Các thang chuẩn kích thước ADN: marker 
1kb của hãng Fermentas (Mỹ) 
Các hóa chất khác được dùng trong tách 
chiết ADN và phản ứng RAPD-PCR đảm bảo 
chất lượng và độ tinh sạch gồm đệm CTAB, 
chloroform, isoamyl acohol, EDTA, ethanol, 
agarose, các thành phần PCR (MgCl
2
, đệm và 
enzyme Taq DNA polymerase, dNTPs), thuốc 
nhộm ethidium bromide (EtBr), được cung cấp 
bở những hãng uy tín như Sigma (Mỹ), Merk 
(Đức), Fluka (Thụy Sỹ).
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
* Tách chiết ADN tổng số 
+ Quy trình tách chiết ADN tổng số được 
thực hiện dựa trên nguyên tắc sử dụng dung 
môi hữu cơ theo phương pháp Mini-CTAB 
được Sanghai-Maroof và cộng sự mô tả đầu 
tiên năm 1984 [4], sau đó được Edwards và 
cộng sự cải tiến (năm 1991) [5] gồm các bước 
cơ bản sau: Cân 50 mg mẫu thực vật đã nghiền 
trong nitơ lỏng và chuyển vào ống eppendorf 
1,5 ml. Bổ sung 900 µL dung dịch đệm nghiền 
(200 mM Tris HCl, pH 7,5; 25mM EDTA, pH 
7,5; 250 mM NaCl; 2% CTAB và 2%
-mecaptoethanol). Ủ mẫu ở 65
o
C trong 90 
phút. Làm nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung 
450 µL phenol/chlorofom/ isoamylalcohol (tỷ lệ 
thể tích: 25/24/1), ủ trong 10 phút. Ly tâm 
10.000 vòng/ phút ở 4ºC trong 10 phút; rồi 
dùng pipet hút phần dịch nổi sang ống 
eppendorf 1,5ml. Bổ sung 600 µL isopropanol. 
Ủ ở 4ºC qua đêm.Ly tâm 10.000 vòng /phút ở 
nhiệt độ phòng trong 10 phút; rồi dùng 
pipetman loại bỏ dịch nổi và rửa tủa ADN hai 
lần bằng ethanol lạnh (100%), kết hợp ly 
tâm.Để tủa khô tự nhiên (hoặc dùng máy cô 
ADN), rồi hòa tan ADN kết tủa trong 100 µL 
đệm 1x TE (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM 
EDTA); bảo quản ở 4ºC. 
ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm 
tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 
0.8%. Thực hiện điện di trong môi trường đệm 
1x TBE, ở hiệu điện thế 90 V trong khoảng 45 
phút. Kích thước tương đối của sản phẩm ADN 
tổng số được xác định bằng cách so sánh với 
thang ADN 1kb (Fermentas). 
Độ tinh sạch của ADN đồng thời được kiểm 
tra và định lượng bằng phương pháp đo quang 
phổ hấp thụ (OD) ở bước sóng 260 nm và 280 
nm. Dịch chiết được pha loãng 100 lần (10 µl 
ADN tổng số + 990 µl dd H
2
O), tiến hành đo 3 
lần ở mỗi mẫu, kết quả lấy trung bình của 3 lần 
đo. Mức độ tinh sạch của ADN (mức độ lẫn 
ARN và protein) phản ánh qua tỷ số OD
260/280
. 
Các mẫu được coi là tinh sạch khi có tỷ số 
nàyxấp xỉ 1,8. Nồng độ dung dịch gốc được 
tính dựa trên hệ số 1,0 OD
260 
= 50 µg/µl 
dsADN. 
* Kỹ thuật RAPD-PCR được tiến hành qua 
hai bước:
- Bước 1: ADN hệ gen được nhân bản 
(khuếch đại) bằng các mồi ngẫu nhiên RAPD 
với thành phần phản ứng và điều kiện (chu trình 
nhiệt của phản ứng) PCR được mô tả ở Bảng 3 
và 4. 

P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 
35 
L 
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR sử dụng 
cho Đảng sâm Việt Nam 
Bảng 4. Chu trình nhiệt của PCR sử dụng cho Đảng 
sâm Việt Nam 
Thành phần phản ứng 
Thể tích (µL) 
Bước phản ứng 
Nhiệt 
độ (˚C) 
Thời gian 
(phút) 
Số chu 
kỳ 
H
2
O (siêu sạch) 
16,8 
Biến tính bước đầu 
94 
5 
1 
ADN khuôn (50 ng/µL) 
0,5 
Biến tính 
94 
1 
Đệm Taq ADN pol (10x) 
2,5 
Gắn mồi 
37 
1 
dNTPs (2mM) 
2,5 
Kéo dài chuỗi 
72 
2 
35 
Mồi RAPD (10 µM) 
2,5 
Kéo dài bổ sung 
72 
7 
1 
Taq ADN pol (5u/ µL) 
0,2 
Bảo quản 
4 
∞ 
Tổng thể tích PCR: 25 µL 
; 
- Bước 2: Sản phẩm ADN sau PCR được 
phân tích trên gel điện di agarose 1,0 - 1,5% 
chạy ở hiệu điện thế 60 - 80 V trong 45 phút 
bằng phương pháp nhuộm với EtBr. Kích thước 
tương đối của các băng khuếch đại được so 
sánh với thang chuẩn kích thước ADN 1kb 
(Fermentas, 1kb DNA Ladder). 
* Phân tich di truyền bằng RAPD - PCR 
Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR được 
chuyển thành ma trận nhị phân trong phần mềm 
NTSYSpc 2.02h (Applied Biotstatistics, New 
York) theo nguyên tắc: sự có mặt của mỗi băng 
được ghi là 1, sự vắng mặt được ghi là 0. Từ ma 
trận nhị phân, hệ số tương quan DICE (SD), ma 
trận tương đồng theo từng cặp được thiết lập. 
Hệ số SD được tính bằng hai lần số băng chung 
của hai mẫu chia cho tổng số băng thu được của 
hai mẫu đó (S = 2N
AB
/ (N
A
+ N
B
)). Hệ số thu 
được là 1,0 có nghĩa là hai mẫu hoàn toàn giống 
nhau, trong khi 0,0 có nghĩa là hai mẫu không 
có điểm chung nào. Cuối cùng, cây quan hệ di 
truyền giữa các mẫu được xây dựng theo 
phương pháp UPGMA (Unweighted Pair-
Group Method with Arithmetical Averages).

tải về 346.07 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: