Trình tự tắt hệ thống như sau

Các mẫu thử dương tính ở mức vết và các mẫu bổ sung thuốc thú y có chứa các ionophore không dự kiến cần được khẳng định để xác nhận việc nhận biết chính xác các pic. Có thể áp dụng một trong hai quy trình sau đây, tuy nhiên quy trình dùng thuốc thử DMAB là tốt nhất. Việc chiết bằng hexan không thể áp dụng đối với các mẫu premix khoáng hoặc mẫu dạng lỏng và các kết quả khi sử dụng hexan ít có giá trị định lượng (chỉ khoảng 90 %), nhưng với mẫu phức tạp thì sắc đồ được cải thiện đáng kể (ít các pic nhiễu). Xem 10.5 về cách diễn giải các kết quả.

Quy trình này có thể áp dụng cho tất cả các loại mẫu thức ăn chăn nuôi ^[6].

Tiến hành các bước từ 8.1 đến 8.4 và các điều kiện HPLC (8.3.1), nhưng sử dụng các thông số phản ứng sau cột như sau:

a) Thông số phản ứng sau cột:

- vừa khuấy nhẹ vừa thêm 20 ml axit sulfuric (4.3) vào 950 ml metanol (4.2)

- để nguội, vừa khuấy vừa thêm 30 g DMAB (4.7)

- tránh ánh sáng, chuẩn bị mới trong ngày sử dụng.

Quy trình này không áp dụng đối với mẫu chứa khoáng hoặc mẫu dạng lỏng.

Cân chính xác 20 g mẫu vào bình nón 250 ml. Thêm 100 ml hexan (4.8). Đậy nắp và lắc qua đêm bằng máy lắc (5.3). Lọc dung dịch mẫu qua giấy lọc Whatman No. 42 (5.6) vào bình nón 125 ml. Dùng pipet lấy 10 ml dịch chiết vào ống nghiệm và cho bay hơi đến khô sử dụng thiết bị thổi khí bằng nitơ (5.2). Hòa tan phần còn lại trong 10 ml dung môi chiết (4.9). Lọc dịch chiết trước khi tiến hành phân tích bằng HPLC (8.3).

10. Tính kết quả

10.1. Yêu cầu chung

Tính hàm lượng ionophore trong mẫu bằng cách so sánh diện tích pic của mỗi mẫu với diện tích pic trung bình của dung dịch chất chuẩn trước và sau khi bơm mẫu (phương pháp một điểm chuẩn). Đối với monensin và narasin thì các kết quả được tính theo hoạt tính kháng khuẩn bằng cách dùng các hệ số hiệu quả sinh học. Kết quả đối với salinomycin được biểu thị theo tỉ lệ khối lượng.

Hàm lượng monensin (mg/kg) tương đương với giá trị sinh học của monensin A + B.

Giá trị sinh học, B, của mỗi thành phần, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

B_M =

Trong đó:

F­_A = 1,00

F_B = 0,28

Hoạt tính tổng số của monensin bằng B_A+ B_B, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg).

Để tính độ thu hồi của monensin trong mẫu bổ sung chuẩn, không sử dụng hệ số F_M trong công thức.

Đối với mẫu dạng vết, có thể không xác định được monensin B.

Nồng độ của monensin B trong dung dịch thử được tính theo chuẩn monensin A. Xem ví dụ cụ thể và cách tính.

VÍ DỤ:

Khối lượng phần mẫu thử (m)	= 20,00 g
Thể tích chiết (V)	= 100 ml
Hệ số pha loãng (D)	= 4
Nồng độ monensin A trong dung dịch chuẩn HPLC (pAS)	=5,05 g/ml
Diện tích pic trung bình của monensin A trong dung dịch chuẩn HPLC (AAS)	= 1 479 566
Diện tích pic monensin A trong dung dịch mẫu thử (AA)	= 1 450 878
Diện tích pic monensin B trong dung dịch mẫu thử (AB)	= 67 091

B_A = mg/kg

B_B = mg/kg

Tổng hàm lượng monensin = 99,0 + 1,3 = 100,3 mg/kg

Hàm lượng salinomycin trong mẫu, w_s, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

w_s =

hoặc:

x

Trong đó:

VÍ DỤ:

Khối lượng phần mẫu thử (m)	= 20,00 g
Thể tích chiết (V)	= 100 ml
Hệ số pha loãng (D)	= 1
Nồng độ salinomycin trong dung dịch chuẩn HPLC (pS)	=10,55 g/ml
Diện tích pic salinomycin trong dung dịch chuẩn (As)	= 1 575 475
Diện tích pic salinomycin trong dung dịch chuẩn (A)	= 1 568 882

w_s = mg/kg

10.4. Narasin

Hàm lượng narasin (mg/kg) tương đương với giá trị sinh học của narasin [A + (D + l)].

Giá trị sinh học của mỗi thành phần, B, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

B_N =

hoặc:

x

Trong đó:

F_D+l được tính theo công thức sau:

F_(D+l) =

Trong đó:

c_Ds là hàm lượng narasin D trong chuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);

c_is là hàm lượng narasin l trong chuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);

và hệ số hiệu quả sinh học đối với từng đồng phân là:

F_D = 1,510;

F_l = 0,012.

Xem phần Hồ sơ chất chuẩn đối chứng về phần trăm của các đồng phân A, D và l trong chuẩn đối chứng sử dụng.

Nồng độ của các đồng phân (D + l) trong dịch chiết mẫu được tính theo đồng phân A trong dung dịch chuẩn. Xem ví dụ về cách tính.

VÍ DỤ 1: Đối với lô chuẩn đối chứng RS0302, c_Ds = 1,9 % và c_is = 0,7 %

F_D+l =

Để tính tỷ lệ phần trăm thu hồi của narasin trong mẫu bổ sung chuẩn, không sử dụng hệ số F_n trong công thức tính. Đối với mẫu dạng vết, có thể không xác định được narasin (D + l).

VÍ DỤ 2

Khối lượng phần mẫu thử (m)	= 20,00 g
Thể tích dung môi (V)	= 100 ml
Hệ số pha loãng (D)	= 1,0
Nồng độ narasin trong dung dịch chuẩn HPLC (pAs)	= 10,60 g/ml
Diện tích pic trung bình narasin A trong chuẩn HPLC (AAS)	= 1 559 626
Diện tích pic narasin A trong dung dịch mẫu (AA)	= 1 539 393
Diện tích pic narasin (D + l) trong dung dịch mẫu (AD+l)	= 77 376

B_N = mg/kg

B_N = mg/kg

Hàm lượng narasin tổng số = 56,3 + 2,9 = 59,2 mg/kg

Báo cáo các kết quả cuối cùng đến hai chữ số có nghĩa nếu < 10 mg/kg và đến ba chữ số có nghĩa nếu > 10 mg/kg. Các mẫu thử dương tính ở mức vết và các mẫu bổ sung thuốc thú y nghi ngờ có chứa các ionophore không dự kiến cần được khẳng định. Xem Điều 9.

10.5. Diễn giải kết quả khẳng định mẫu dương tính

Khi khẳng định bằng cách dùng DMAB làm thuốc thử sau cột, các kết quả đối với các ionophore phải phù hợp với những kết quả thu được khi dùng vanilin. Tuy nhiên, kích cỡ pic của từng ionophore khi dùng DMAB phải lớn hơn 1,3 lần đến 1,5 lần so với kết quả thu được khi dùng vanilin. Tỷ lệ cỡ pic đối với DMAB/vanilin đối với mẫu thử phải phù hợp với chất chuẩn.

Nếu nghi ngờ có maduramicin ở thời gian lưu giống với salinomycin thì kết quả thu được sử dụng DMAB phải thấp hơn đáng kể vì maduramicin kém nhạy hơn salinomycin khoảng 6 lần. Một mẫu chứa maduramicin với hàm lượng 5 mg/kg sẽ cho một pic có tín hiệu tương đương với mẫu chứa salinomycin với hàm lượng 1 mg/kg; nghĩa là thấp hơn giới hạn định lượng salinomycin.

Nếu có mặt semduramicin thì phải có một pic ngay trước monensin B. Khi dùng vanilin để khẳng định thì semduramicin kém nhạy hơn khoảng 13 lần so với cả monensin A và B. Khi dùng DMAB thì semduramicin kém nhạy hơn monensin khoảng 28 lần.

Khi khẳng định bằng cách chiết với hexan, các kết quả đối với ba loại ionophore chỉ được sai lệch trong vòng 10 % so với kết quả khi chiết bằng metanol 90 %. Nếu có mặt maduramicin hoặc semduramicin, phương pháp chiết bằng hexan cho kết quả từ 40 % đến 50 % so với kết quả thu được khi chiết bằng metanol.

Các thông tin nói trên cần được thẩm định lại đối với mỗi hệ thống HPLC cụ thể.

Việc định tính pic được khẳng định bằng quy trình ở Điều 8 nếu thời gian lưu của chuẩn và mẫu khác nhau không quá 0,2 min và kết quả định lượng nằm trong khoảng ± 5 % (vanilin so với DMAB) và ± 10 % (chiết bằng 90 % metanol so với chiết bằng hexan).

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Chi tiết về phép thử liên phòng nghiệm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác.

Chêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ lặp lại (r) thu được bằng công thức sau ⁽⁹⁾;

trong đó RSD(r) là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại.

Các giá trị độ lặp lại giống nhau đối với cả 3 chất phân tích, xem ở Bảng 2.

11.3. Độ tái lập

Chêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ tái lập (R) thu được bằng công thức sau ^[9];

Trong đó RSD(R) là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập đối với mẫu bổ sung thuốc thú y (> 10 mg/kg), chế phẩm bổ sung và các premix khoáng chất theo các bảng A.1, A.2 và A.3, được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2

Thông số	Monensin	Narasin	Salinomycin
RSD(r), tối đa	5,23	4,46	4,31
RSD(r), trung bìnha	4,01	3,99	4,77
r, %, tối đa	14,6	12,5	12,1
r, %, trung bìnha	11,2	11,2	9,46
RSD(R), tối đa	6,75	6,54	5,67
RSD(R), trung bìnha	5,21	5,65	4,72
R, %, tối đa	18,9	18,3	15,9
R, %, trung bìnha	14,6	15,8	13,2
a Các giá trị trung bình được xác định bằng phân tích biến sai. Số liệu nghiên cứu cho thấy sự dao động của phép phân tích không phụ thuộc vào nồng độ của chất phân tích và loại mẫu thử.

Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập tương tự cũng thu được ở mẫu thức ăn chăn nuôi dạng vết, trừ các mẫu chứa hàm lượng monensin 3 mg/kg (có thể do mẫu kém đồng nhất).

11.4. Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng thực nghiệm là 1 mg/kg đối với monensin và 2 mg/kg đối với narasin và salinomycin. Có thể đạt được giới hạn định lượng thấp hơn tùy thuộc hệ thống HPLC được sử dụng và phải được người sử dụng phương pháp đánh giá hiệu lực.

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;

- phương pháp thử đã dùng, cũng như viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được;

- kết quả cuối cùng thu được nếu kiểm tra độ lặp lại.

(Tham khảo)

CÁC KẾT QUẢ THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

A.1. Cách tiến hành

Một phép thử liên phòng thử nghiệm được tổ chức và thực hiện theo Hướng dẫn thử liên phòng thử nghiệm của AOAC quốc tế ^[9.10] năm 2002. Các mẫu thử được chuẩn bị bằng cách nghiền một lượng thích hợp từ nguyên liệu thử dạng khô bằng thiết bị Retsch ZM1 (lỗ sàng 0,75 mm) hoặc Retsch SR3 (lỗ sàng 1,0 mm). Nguyên liệu sau khi nghiền được trộn đều bằng tay sau đó chia làm nhiều phần trên thiết bị chia mẫu Retsch rotary PTZ, mỗi phần khoảng 50 g. Độ đồng nhất của mẫu con được đánh giá bằng cách phân tích 6 mẫu chọn ngẫu nhiên: nguyên liệu thử được coi là đồng nhất nếu độ lệch chuẩn tương đối lặp lại nhỏ hơn 2 %.

Các phòng thử nghiệm tham gia được lựa chọn dựa trên các kết quả từ nghiên cứu thành thạo phương pháp bao gồm cả tính phù hợp của hệ thống và phân tích 2 mẫu trong đó 1 mẫu có chứa monensin và 1 mẫu chứa salinomycin. Phạm vi nghiên cứu của phương pháp là trên mẫu thử dạng vết (1 mg/kg) đến premix bổ sung thuốc thú y (200 g/kg). Hai mươi lăm mẫu bổ sung thuốc thú y, chín mẫu dạng vết và các mẫu chuẩn đối chứng của ba loại kháng sinh được gửi đến các phòng thử nghiệm tham gia. 10 phòng thử nghiệm đã gửi lại số liệu được chấp nhận trong khoảng thời gian phù hợp. Số liệu từ một phòng thử nghiệm bị loại do không đảm bảo một số yêu cầu của phép thử nghiệm đặt ra.

Các mẫu được thử như sau: