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carboxylase (PCx) is responsible for the remaining 30%
(
Delaunay et al., 1999
). This is in agreement with the fact that
almost no PCx protein was detectable under glutamate-
producing conditions, and it agrees furthermore with the fact
that PCx is a biotin-binding enzyme (
Shiio et al., 1962
), never-
theless, biotin limitation can be used for ef
ficient glutamate
production. It is interesting that
L
-glutamate production by wild-
type C. glutamicum in response to detergent or penicillin is more
or less comparable to biotin-limiting conditions, even though
PC might be active in the former case in which an adequate
biotin level is present. This shows the robustness of the ana-
plerotic reactions. One of the important issues in the over-
production of glutamate by C. glutamicum is the anaplerotic
pathway of the PEP
–pyruvate–oxaloacetate node (
Sauer and
Eikmanns, 2005
) because glutamate is synthesized from
2-oxoglutarate (a member of TCA cycle) and carbon is released
as CO
2
in the TCA cycle. Peters-Wendisch et al. (2001) charac-
terized the importance of the anaplerotic pathways of
C. glutamicum. Corynebacterium glutamicum possesses both PEPCx
and PCx as anaplerotic enzymes for growth on carbohydrates.
Overexpression of the pyc gene and thus increasing the PCx
activity in a lysine-producing strain of C. glutamicum resulted in
approximately 50% higher lysine accumulation in the culture
supernatant, whereas inactivation of the pyc gene led to
a decrease by 60%. In a threonine-producing strain of C. gluta-
micum, the overexpression of the pyc gene led to only a 10
–20%
increase in threonine production; however, it led to a more than
150% increase in the production of the threonine precursor
homoserine. PCx is an important target for breeding hyper-
producing strains to be used in large-scale fermentation
processes, such as the industrial glutamate and lysine produc-
tion. Single or combined overexpression or disruption of genes
coding for (in some cases deregulated) enzymes involved in
amino acid biosynthetic pathways enabled the redirection of the
carbon
flux toward a given amino acid in response to elevation
or removal of the respective enzyme activity (
Cremer et al., 1991
;
Eggeling et al., 1998
;
Ikeda and Katsumata, 1992
;
Katsumata and
Ikeda, 1993
;
Morbach et al., 1995
). Malic enzyme, that catalyzes
the reversible decarboxylation of malate to pyruvate with
simultaneous reduction of NADP (
Fraenkel, 1975
) is another
key anaplerotic enzyme present in C. glutamicum (
Cocain-
Bousquet et al., 1996
), and it has been suggested that the enzyme
may play an important role in NADPH generation on substrates
other than glucose (
Dominguez et al., 1998
).
Metabolic Flux Distribution during Glutamate
Synthesis
The
flux analysis over the EMP pathway and the pentose
phosphate pathway (HMP) has been done with C 13-labeled
substrate, because the latter supplies the reducing power for
biosynthesis, including production of glutamate. It was
shown that the
flux into the HMP decreases during glutamate
overproduction (
Ishino et al., 1991
). The EMP/HMP ratio
was estimated to be 80/20 during glutamate production, in
sharp contrast to lysine production, in which this ratio is
30/70 to 40/60. From these results, it is supposed that regu-
lation of the EMP/HMP ratio has an important role in
maintaining the balance of the metabolic network under
L
-
glutamate overproduction. The
flux distribution at the key
branch point, 2-oxoglutarate, was investigated by changing
activities of ICDH, GDH, and 2-oxoglutarate dehydrogense
complex (ODHC) (
Shimizu et al., 2003
). Even though both
GDH and ICDH activities were enhanced, the
flux distribu-
tion was not changed signi
ficantly. When the ODHC activity
was attenuated, however, the
flux through ODHC decreased,
and
L
-glutamate production was increased markedly. Thus,
the factor with the greatest impact on
L
-glutamate production
in the metabolic network is attenuation of ODHC activity
(
Shimizu, 2002
). The details of the metabolic
flux change
model
accommodating
the
various
observations
and
dynamic
flux changes have been described (
Kimura et al.,
1997
;
Wendisch et al., 2000
). Regulation mechanisms of
ODHC enzyme activity in C. glutamicum was reported by
(
Niebisch et al., 2006
). They found a novel protein kinase,
PknG, regulating ODHC activity via the phosphorylation of
OdhI protein. The regulatory mechanism in ODHC activity
by the phosphorylation state of OdhI establishes one clue for
understanding the mechanism of glutamate overproduction
by C. glutamicum.
Leakage Model for Glutamate Efflux by C. glutamicum
Although C. glutamicum requires biotin for growth,
L
-glutamate
is not accumulated in the medium when cultured in the pres-
ence of excess biotin (
Carlsson and Hederstedt, 1989
). In the
presence of excess biotin, glutamate overproduction can be
induced by the addition of detergents, such as polyoxyethylene
sorbitan monopalmitate (Tween 40) or polyoxyethylene sor-
bitan monostearate (Tween 60) (
Carlsson and Hederstedt,
1989
). Monolaurate or monooleate esters (Tween 20 and
Tween 80, respectively) are not effective for unknown reasons.
It is also known that some b-lactam antibiotics, particularly
penicillin and ethambutol, induce
L
-glutamate production
similar to the detergents (
Radmacher et al., 2005
). Since these
conditions that induce
L
-glutamate overproduction seem to
affect the cell surface,
L
-glutamate secretion by coryneform
bacteria was once interpreted as a passive process caused by
enhanced membrane permeability (
Eikmanns et al., 1994
;
Eikmanns, 1992
). According to this
‘leakage model’,
L
-gluta-
mate passively leaks out through the damaged membrane
(
Dominguez et al., 1998
) and accumulates in the culture
medium. Under biotin-limited conditions, membrane perme-
ability was thought to be higher than that under normal
conditions, so that the intracellular concentration of
L
-gluta-
mate would remain low due to the ef
flux by diffusion. Under
such conditions; it was thought that the
L
-glutamate biosyn-
thetic pathway was also free from feedback inhibition, thereby
contributing to the overproduction of
L
-glutamate. When
ODHC activity is reduced, the metabolic
flux is thought to
proceed toward
L
-glutamate production from the tricarboxylic
acid cycle (
Hirasawa et al., 2000
). Historically, in coryneform
bacteria, only the weak activity of ODHC that catalyzes the
oxidation of 2-oxoglutarate, the direct precursor of
L
-glutamate,
to succinyl-CoA has been detected (
Figure 4
) (
Shiio and
Ujigawa, 1978
). Therefore, in these bacteria, it was considered
that the cellular concentration of 2-oxoglutarate remains high,
and the metabolic
flux was directed toward
L
-glutamate
Corynebacterium glutamicum
509
Encyclopedia of Food Microbiology, Second Edition, 2014, 504–517

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