Publications

type of control as evolved in C. glutamicum appears to be ef
fi-
cient for a balanced
flux toward
L
-lysine and prevents the
wasting of this valuable metabolic building block.
L
-Lysine
synthesis in the cell is increased only if the regulation of the
kinase or synthase is overcome arti
ficially (
Cremer et al., 1991
).
This results in an intracellular accumulation of
L
-lysine (
Broer
et al., 1993
), accompanied by an ef
flux of this amino acid.
The simple fact that four NADPH are required for synthesis
of one lysine has stimulated metabolic engineering of the
NADPH supply in C. glutamicum (
Marx et al., 1999
). As
a prerequisite for successful modi
fication of the NADPH
metabolism, the key pathways supplying NADPH for lysine
production in C. glutamicum were identi
fied by different
approaches. Stoichiometric investigation of the lysine network
in the early 1990s already predicted that an increased lysine
yield is linked to an increased
flux through the PPP and
a decreased
flux through the TCA cycle (
Kiss and Stephano-
poulos, 1992
). The importance of the PPP for ef
ficient lysine
production was later shown by metabolic
flux analysis and
genetic experiments (
Georgi et al., 2005
).
Knowing the importance of PCx for lysine production, the
point mutation C1372T, identi
fied in a classically derived
producer, was introduced into the pyc gene and resulted in
a strong increase of lysine production (
Ohnishi et al., 2002
).
Overexpression of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene
ppc, however, also is bene
ficial for the formation of amino acids
of the aspartate family (
Sano et al., 1987
). Other targets for
strain development focus on the reduction of by-product
formation (
Wolf et al., 2003
) and redirection of central carbon
metabolism (
Koffas et al., 2002
). Analyzing the anaplerotic
enzymes phosphoenolpyruvate carboxylase encoded by the ppc
gene and PCx encoded by the pyc gene demonstrated that the
anaplerotic CO
2
incorporation via PCx is a major bottleneck
for amino acid production in C. glutamicum (
Peters-Wendisch
et al., 2001
). Overexpression of the pyc gene and thus an
increase in the PCx activity in an
L
-lysine
–producing strain of
C. glutamicum resulted in approximately 50% higher
L
-lysine
accumulation in the culture supernatant.
Other Genes for Enhanced Lysine Production and Regulation
De
fined improvements were added to strains generated by
random mutagenesis. These improvements usually involved
the introduction of feedback resistant biosynthetic genes or the
additional ampli
fication of feedback resistant biosynthesis
genes like lysC. These genes together with asd encoding the
aspartate semialdehyde constitute an operon (
Cremer et al.,
1991
). The aspartate kinase encoded by lysC was considered
very early to be the key enzyme for the fermentative
L
-lysine
production using C. glutamicum, and a number of mutations
are now localized that in
fluence the allosteric control of the
enzyme in addition to the ampli
fication of a feedback-resistant
aspartate kinase, the enhancement of dihydrodipicolinate
synthase encoded by the dapA gene is considered to be
a promising target for strain improvement strategies (
Hanke
et al., 2001
;
Kreutzer et al., 2001
).
Table 1
summarizes some of
the key genes and the gene product (enzymes) involved in
lysine biosynthesis. In addition to increasing the copy number
of the dapA gene, there was a strategy to increase the synthase
activity by introducing single nucleotide exchanges in the
extended

10 region of the dapA promoter (
de Graaf et al.,
2001
). This way, the enzyme activity was enhanced up to
2.5-fold compared with the wild-type enzyme. Overexpression
of the two genes dapF and dapC (
Hartmann et al., 2003
) coding
for diaminopimelate epimerase and succinyl-amino keto-
pimelate transaminase in an industrial C. glutamicum strain
resulted in increased
L
-lysine production, indicating that both
genes might be relevant targets for the development of
improved production strains. A striking discovery with respect
to lysine production was the discovery of the lysine exporter
(LysE) and the subsequent overexpression of the LysE gene,
which resulted in an increased lysine secretion rate (
Bellmann
et al., 2001
). It also was revealed that there is no alternative
function to substitute the LysE mediated
L
-lysine export.
Although the improvement strategies already listed often
were applied, implementing de
fined changes in a conven-
tionally developed production strain
Ohnishi et al. (2002)
impressively demonstrated the effect of a limited number
of mutations in the central carbon metabolism on a wild-type
C. glutamicum background. By introducing alleles of the
genes coding for aspartate kinase (lysCT311I), pyruvate
carboxylase (pycP458S), and homoserine dehydrogenase
(homV59A), production of 80 g l

1
L
-lysine with a productivity
of 3.0 g l

1
h

1
was achieved. The key driver for this devel-
opment is the availability of whole genome analysis of
wild-type and numerous conventional production strains
in
combination
with
well-established
postgenomic
technologies.
Table 1
Key genes involved in lysine biosynthesis
Gene
Enzyme
Enzyme number
Transcription unit
Reference
lysC
Aspartate kinase
2.7.2.4
lysC
(
Kalinowski et al., 1991
)
asd
Aspartate semialdehyde dehydrogenase
1.2.1.11
asd
(
Cremer et al., 1988
)
dapA
Dihydrodipicolinate synthase
4.2.1.52
dapB-orf2-dapA-orf4
(
Patek et al., 1997
)
dapB
Dihydrodipicolinate reductase
1.3.1.26
dapB-orf2-dapA-orf4
(
Patek et al., 1997
)
dapD
Tetrahydrodipicolinate succinylase
2.3.1.117
dapD
(
Wehrmann et al., 1998
)
dapC
Succinyl-amino-keto- pimelate transaminase
2.6.1.17
dapC
(
Hartmann et al., 2003
)
dapE
Succinyl-diamino- pimelate desuccinylase
3.5.1.18
dapE
(
Wehrmann et al., 1998
)
ddh
Meso-diaminopimelate dehydrogenase
1.4.1.16
ddh
(
Cremer et al., 1988
)
dapF
Diaminopimelate epimerase
5.1.1.7
dapF
(
Hartmann et al., 2003
)
lysA
Diaminopimelate decarboxylase
4.1.1.20
lysA
(
Cremer et al., 1988
)
lysE
Lysine permease
–
lysE
(
Vrljic et al., 1996
)
512
Corynebacterium glutamicum
Encyclopedia of Food Microbiology, Second Edition, 2014, 504–517

tải về 1 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: