Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung
Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng rộng rãi và hiệu quả do
tải về 450.48 Kb.
|
Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng rộng rãi và hiệu quả do:- Số bản sao của gen được chuyển vào tế bào thực vật thấp. Do vây, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao. - Tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm. - Kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện.
Việt Nam là một nước có nền kinh tế phụ thuộc rất nhiều vào nông nghiệp, tuy nhiên, trong điều kiện biến đổi khí hậu toàn cầu như hiện nay, cây trồng ở Việt nam đang phải hứng chịu những tác động nặng nề do vấn đề hạn hán. Hạn đang được xem là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và làm cho sản lượng lương thực không ổn định. Hạn được xem là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và làm cho sản lượng lương thực không ổn định. Vì vậy đã từ lâu, rất nhiều phòng thí nghiệm quan tâm đến việc chọn tạo giống chịu hạn. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu tập trung vào phương pháp truyền thống như lai tạo, chọn lọc cá thể, quần thể... và kết quả là nhiều giống chịu hạn đã được áp dụng trong sản suất. Gần đây, chọn giống chịu hạn theo định hướng di truyền phân tử như việc sử dụng các chỉ thị phân tử, lập bản đồ QTL liên kết với một số tính trạng chịu hạn đang được các nhà khoa học Việt Nam đặc biệt quan tâm. Phòng Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã lập bản đồ QTL liên kết với các tính trạng ở rễ lúa liên quan đến tính chịu hạn ở các giống vùng cao Việt nam và gần đây đã thiết lập phương pháp đánh giá tính chịu hạn bằng xử lý PEG và phân tích chỉ thị SSR liên kết với các tính trạng liên quan đến chịu hạn của các giống lúa Việt nam. Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long cũng có nhiều nghiên cứu chọn tạo giống chịu hạn, chịu mặn nhưng tập trung chủ yếu vào việc lai tạo truyền thống và các phương pháp chọn giống phân tử (83). Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam có thể nói là đang khá mới mẻ và đang ở giai đoạn ban đầu. Hiện tại, phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học cũng đã nghiên cứu phân lập gen và chọn dòng lúa chống chịu lạnh, nhân bản và phân tích các đoạn ADN pBC442 và pBC591 ở một số giống và dòng lúa có tính chịu lạnh khác nhau. Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đang thiết kế vector chuyển gen nhằm loại bỏ gen kháng sinh trong cây chuyển gen và đang tiến hành chuyển gen DREB1D/CBF4, DREB2A và TPS1 vào đậu tương nhằm tăng cường tính kháng với điều kiện hạn. Phòng Bệnh học Phân tử và chống chịu bất lợi ngoại cảnh-Viện Di truyền Nông nghiệp đang triển khai các thí nghiệm phân lập các gen mã hóa các nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn, thiết kế các vector chuyển gen và nghiên cứu biểu hiện của các yếu tố phiên mã trên cây mô hình lúa chuyển gen. Tập đoàn giống lúa Việt nam gồm 59 giống đã được khảo sát khả năng hình thành callus, tái sinh và tiếp nhận gen lạ. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn: OsNAC1, OsNAC6, ... đã được phân lập và đang được thử nghiệm khả năng biểu hiện trên các giống lúa Việt Nam.
2.1.1. GIỐNG LÚA Hạt của giống lúa Pusa Basmati do trung tâm kỹ thuật gen và công nghệ sinh học quốc tế (ICGEB) Ấn Độ cung cấp. Basmati là giống lúa dạng hạt dài được trồng phổ biến ở Ấn Độ và Pakistan. Đặc điểm nổi bật của giống lúa này là có mùi thơm, dẻo và hương vị tinh tế. Ấn Độ là nước trồng và xuất khẩu nhiều nhất loại gạo này, tiếp theo là Pakistan. Giống lúa Basmati là nguồn phát triển chủ yếu trong lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa ở khu vực Punjab. Hạt gạo basmati dài hơn hầu hết các loại gạo khác, khi đã nấu chín có đặc điểm đặc trưng là hạt gạo rời chứ không dính. Cơm nấu bằng gạo basmati có thể được xác định bởi mùi thơm của nó. Gạo Basmati hiện nay có hai loại: trắng và nâu. Hiện nay có một số dòng lúa basmati như: các dòng truyền thống bao gồm Basmati-370, Basmati-385 và Basmati-Ranbirsinghpura (RSPura), và các dòng lai giống bao gồm Pusa Basmati 1 (còn được gọi là 'Todal', bởi vì hạt có râu ở đầu), các dòng gạo thơm có nguồn gốc từ giống basmati cổ nhưng không được xem là giống basmati thật, như PB2 (còn gọi là sugandh-2), PB3 và RH-10. Giống lúa Pusa Basmati-1(PB1) đã được các nhà khoa học tại Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ, New Delhi đưa vào nghiên cứu và chứng minh khả năng nhận gen tốt và trở thành giống mô hình của Ấn độ trong lĩnh vực chuyển gen thực vật. Đây cũng là giống lúa có đặc tính di truyền tốt (hạt gạo dài, thơm, chứa kiềm) và cây dạng hơi thấp lùn. PB1 có năng suất cây trồng cao hơn so với các giống truyền thống (có thể cao gấp đôi). Tuy có nguồn gốc từ Ấn Độ nhưng khi được gieo trồng trong điều kiện được tưới tiêu bình thường ở Việt Nam, giống lúa Pusa Basmati 1sinh trưởng và phát triển tốt, có tiềm năng về năng suất và chất lượng. 2.1.2. CHỦNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM VÀ VECTOR Thư viện cDNA chịu hạn của lúa, các vector nhân dòng pSK II, pUC19-Ubi, chủng vi khuẩn E.coli DH5α, chủng vi khuẩn A. tumerfaciens: EHA105 được cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Vector chuyển gen pBCKH được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của GS. Shinozaki, Trung tâm quốc tế Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản. Bộ kit Gateway LR Clonase II enzym mix, các trình tự mồi (bảng1) và các hóa chất được mua của các hãng Merk, Sigma và Invitrogen... Bảng 3. Trình tự các cặp mồi đã được sử dụng trong nghiên cứu
2.1.3. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ a. Hóa chất Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen bao gồm: MS, LB, YEM. Bảng 4. Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được dùng trong thí nghiệm
Bảng 5. Thành phần môi trường LB (Luria-Bertani medium)
Bảng 6. Thành phần môi trường YEM (Yeast-extract-manitol medium)
Các hoá chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật như: Triptone, cao nấm men, agar được mua từ hãng Difco; hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô như: 2,4-D, BAP, kinetine, casein,…mua từ hãng Sigma; thang chuẩn ADN 1kb và enzym Taq ADN polymerase mua từ hãng Invitrogen. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu Sinh học Phân tử. b. Thiết bị Các máy móc thiết bị chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: tủ cấy vô trùng (Daikin & Envirco), tủ sinh trưởng (Binder), máy PCR ABI 9700, máy giải trình tự ADN tự động ABI 3100, máy quang phổ kế (Jasco V530), máy đo pH (Horiba), máy ly tâm (Heraus), bể ổn nhiệt (Lauda) và các thiết bị khác. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.PHÂN LẬP GEN OsNAC6 TỪ THƯ VIỆN cADN CHỊU HẠN Ở LÚA 2.2.1.1. Nhân gen OsNAC6 từ thư viện bằng kỹ thuật PCR Dựa vào trình tự nucleotide của gen OsNAC6 được công bố trên ngân hàng gen, chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu OsNac6-F/OsNac6-R (bảng 1) để nhân trình tự nucleotide mã hóa gen OsNAC6. Mồi OsNac6-F gồm 27 nucleotide; gồm trình tự nhận biết của enzym giới hạn BamHI ở đầu 5’, 15 nucleotide ở vùng không mã hóa gen đầu 5’ và 5 nucleotide ở vùng mã hóa gen bắt đầu từ trình tự khởi đầu dịch mã (ATG) ở đầu 3’. Mồi OsNac6-R dài 27 nucleotide; gồm trình tự nhận biết của enzym giới hạn BamHI ở đầu 5’, 7 nucleotide ở vùng không mã hóa gen đầu 5’ và 13 nucleotide ở vùng mã hóa gen bắt đầu từ trình tự kết thúc dịch mã (CTA). Kỹ thuật PCR nhân gen OsNAC6 được thực hiện với tổng thể tích là 50 μl bao gồm các thành phần với tỷ lệ như sau:
Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt: khởi đầu 940C trong 5 phút, 30 chu kỳ nhiệt tiếp theo (mỗi chu kỳ gồm nhiệt độ biến tính ADN là 940C trong 45 giây, nhiệt độ gắn mồi là 550C trong 45 giây và nhiệt độ kéo dài chuỗi là 720C trong 60 giây), kéo dài 7 phút ở 720C. Sản phẩm PCR lần một được dùng làm khuôn cho PCR lần 2 với chu trình nhiệt như trên. Sản phẩm PCR lần 1 và lần 2 được điện di trên gel Agarose 1% để kiểm tra băng kích thước khoảng gần 1000bp. Sản phẩm PCR lần 2 được tinh sạch bằng cột GeneluteTM Minus EtBr (Sigma Cat G-2199)
Băng ADN sau khi điện di xác định đúng kích thước sẽ được cắt và chạy qua kim tiêm 1ml để làm nhỏ trước khi chuyển qua cột. Để thu được ADN, cột đã chứa agarose và ADN sẽ được ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Sản phẩm thu được chính là ADN đã được tinh sạch có thể sử dụng cho các phản ứng tiếp theo. 2.2.1.3. Gắn sản phẩm PCR vào vector nhân dòng pSK II Sản phẩm PCR và vector nhân dòng được xử lý bởi enzym giới hạn BamH I với thành phần phản ứng như sau:
Phản ứng cắt được tiến hành ở 37oC trong 1 giờ, sau đó sản phẩm của phản ứng được chạy kiểm tra trên gel Agarose để xác định băng có kích thước tương ứng và được tinh sạch bằng phương pháp phenol lạnh với các bước như sau : Bước 1: Cắt lấy mẩu gel có chưa đoạn AND có kích thước cần kiểm tra cho vào ống tiêm 1 ml, dùng áp lực đẩy gel agarose chứa ADN qua ống tiêm 1 ml và thu sản phẩm trong ống eppendorf 1,5 ml. Bước 2: Bổ sung 800 µl phenol (pH = 8,0), trộn đều bằng vortex, ủ ở -80oC trong khoảng 1 giờ. Bước 3: Hỗn hợp được làm tan ở nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút. Bước 4: Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung một lượng tương đương dung dịch chloroform : isoamyl alcohol tỷ lệ 24 : 1. Lắc đều và tiếp tục hút pha trên chuyển sang ống eppendorf mới. Bước 5: Bổ sung 1/10 thể tích CH3COOK, pH = 5,2 và 2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối giữ lạnh. Ủ hỗn hợp ở -20oC trong thời gian 1 giờ. Bước 6: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 30 phút, thu kết tủa và làm sạch ADN bằng cồn 70%. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút, thu kết tủa, làm khô và hoà tan ADN trong thể tích nước hợp lý. Vector pSK II sau khi cắt bởi BamH I được tiếp tục xử lý bởi enzym CIAP (alkaline phosphatase) để loại bỏ một nhóm PO4 ở đầu 5’ để tránh hiện tượng tự gắn lại của vector khi tiến hành phản ứng gắn với sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR và vector pSK II sau khi được xử lý với BamH I đều có đầu dính (GATC) của enzym BamH I ở hai đầu. Vì vậy, sản phẩm PCR sẽ được gắn vào vector pSK II khi có mặt enzym T4 ligase với thành phần phản ứng như sau :
Phản ứng gắn được tiến hành ở 250C trong thời gian 1 giờ.
Dịch tế bào DH5a giữ ở -800C được cấy trải trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C, sau đó chọn một khuẩn lạc đơn để nuôi lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC trong 5 ml môi trường LB lỏng. 500 ml môi trường LB lỏng được bổ sung vào 5 ml dung dịch nuôi qua đêm và tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C khoảng 2 giờ (OD600=0,4 - 0,6). Dịch khuẩn được đem ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, thu cặn tế bào và hoà tan trong 20 ml CaCl2 0,1M lạnh. Tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 0,1M; giữ hỗn hợp trên đá trong khoảng 2 giờ, tiếp tục ly tâm ở tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Cặn tế bào được hòa tan trong 20 ml dung dịch CaCl2 0,1M và 10% glycerol. Tế bào khả biến DH5a vừa chuẩn bị được chia thành từng lượng nhỏ 80 - 100 µl vào các ống eppendorf và bảo quản ở -80oC.
10 μl vector nhân dòng pSK II mang gen OsNAC6 đã chuẩn bị ở trên (mục 2.2.1.3) được bổ sung vào tế bào khả biến DH5α. Hỗn hợp được trộn nhẹ và ủ trong đá 20 phút tạo điều kiện cho các vector bám lên thành tế bào. Sau đó, phản ứng sốc nhiệt được thực hiện bằng việc chuyển hỗn hợp phản ứng trên vào bể ổn nhiệt ở 420C trong 60 giây, ngay lập tức ủ hỗn hợp vào đá trong 5 phút. Hỗn hợp phản ứng sau đó được trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 100 μg/ml ampicilin, nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm.
Sản phẩm PCR và vector pSK II chỉ được gắn với nhau bởi một vị trí enzym giới hạn BamH I nên sản phẩm PCR có thể gắn vào vector theo chiều xuôi (forward) hoặc ngược (reverse). Vì vậy, phản ứng PCR đặc hiệu với mồi xuôi là mồi của promoter T3 (T3-F) và mồi ngược là mồi đặc hiệu của gen OsNAC6 (OsNAC6-R) được tiến hành để xác định sự có mặt xuôi chiều của gen OsDREB2A tái tổ hợp với vector pUC19-Ubi trong khuẩn lạc. Các khuẩn lạc cho sản phẩm PCR là các băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước của gen OsNAC6 được tiếp tục nuôi để tách plasmid. 2.2.1.5. Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E. coli DH5α Phương pháp tách chiết ADN plasmid được cải tiến dựa trên phương pháp của Sambrook và cộng sự (1989) [66]. Gồm các bước sau: Bước 1 : Nuôi cấy lắc 1 khuẩn lạc đơn trong 2ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 370C. Bước 2 : Chuyển dung dịch nuôi qua đêm vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm ở tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút. Bước 3 : Thu cặn tế bào, hòa tan trong 150 μl dung dịch I để lạnh (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH = 8,0) và 10 mM EDTA). Bước 4 : Bổ sung 300 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ. Bước 5 : Tiếp tục bổ sung 200 µl dung dịch III để lạnh (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml axit acetic đậm đặc; 28,5 ml nước), đảo nhe. Bước 6 : Dung dịch tế bào được ủ trong đá khoảng 10 phút và ly tâm 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Bước 7 : Thu dịch trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml sạch và bổ sung 2 µl enzym RNase (10 µg/ml). Bước 8: Bổ sung một lượng tương đương dung dịch phenol : chloroform : isoamyl alcohol theo tỷ lệ 25 : 24 : 1, ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 9 : Chuyển pha trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới rồi bổ sung một lượng dung dịch chloroform : isoamyl alcohol theo tỷ lệ 24 : 1 với thể tích tương đương. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 10 : Thu pha trên cùng và chuyển sang một ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung CH3COOK 3M (pH = 5,2) với tỷ lệ 1/10 thể tích. Bổ sung 2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối giữ lạnh, kết tủa ADN ở -80oC trong 1 giờ. Ly tâm 12.000 vòng/phút khoảng 30 phút ở 4oC. Bước 11 : Rửa ADN bằng cồn 70%, sấy khô, hòa tan ADN trong 50 µl nước hoặc TE.
Gen OsNAC6 gắn với vector nhân dòng pSK II cùng với cặp mồi T3, T7 được gửi đi để đọc trình tự hai chiều nhờ máy giải trình tự ABI 3100.
Gen OsNAC6 trong vector tách dòng pSK II-OsNAC6 được thu nhận lại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu OsNac6-F/OsNac6-R (bảng 1) để nhân trình tự nucleotide mã hóa gen OsNAC6. Phản ứng PCR được tiến hành như mô tả ở phân phân lập gen OsNAC6 (mục 2.2.1.1), chỉ khác là thành phần phản ứng sử dụng sợi khuôn là 50 ng plasmid pSK II-OsNAC6. Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agarose 1%, tinh sạch bằng cột GeneluteTM Minus EtBr (mục 2.2.1.2), xử lý enzym giới hạn Bam HI, gắn vào vector pUC19-Ubi đã xử lý Bam HI và loại gốc phosphate trước đó (mục 2.2.1.3) để tạo vector trung gian pUC19-Ubi-OsNAC6. Chiều gắn của gen OsNAC6 trong vector pUC19-Ubi được kiểm tra bằng cặp mồi Ubi-F/OsNac6-R (bảng 1). Vector pUC19-Ubi-OsNAC6 có chiều gắn xuôi được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α, nuôi lỏng thu sinh khối, tách plasmid và giải trình tự trước khi gắn vào vector chuyển gen.
Việc gắn cấu trúc gen gồm promoter Ubiquitin, OsNAC6 và trình tự kết thúc phiên mã trong vector pUC19-Ubi-OsNAC6 vào vector nhận pBCKH để tạo ra vector chuyển gen pBCKH-Ubi-OsNAC6 được thực hiện theo quy trình Gateway kit (Invitrogen). Phản ứng gateway được tiến hành trong hỗn hợp phản ứng 5 μl với các thành phần phản ứng như sau :
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 250C trong thời gian 1giờ, sau đó bổ sung 0,5 μl proteinase K ủ ở 370C trong 10 phút để loại bỏ protein. 1,5 μl hỗn hợp phản ứng được dùng để biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α như trình bày ở mục 2.2.1.4. Các khuẩn lạc mọc trên môi trường LB chứa 50 μg/ml kanamycine được kiểm tra sự có mặt của gen OsNAC6 trong vector chuyển gen pBCKH bằng phản ứng PCR với các cặp mồi: OsNac6-F/Out-R, Ubi-F/OsNac6-R, Ubi-F/Nos-RT50, OsNac6-F/OsNac6-R (bảng 1). Các khuẩn lạc chứa vector chuyển gen pBCKH mang gen OsNAC6 được sàng lọc trong môi trường LB lỏng chứa 50 μg/ml kanamycin. Plasmid được tách như trình bày ở mục
Dựa trên phương pháp của Shen và Forde (1989), Mersereau và CS (1990) với một số cải tiến và cụ thể như sau: Bước 1: Cho 5ml dịch chứa chủng A. tumefacines bão hoà vào 500 ml YEM. Nuôi khuẩn lắc 200 vòng/phút ở 280C khoảng 8 giờ đến khi đo OD600 = 0,5 - 0,8. Bước 2: Dịch khuẩn để lạnh rồi ly tâm 6000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở 40C. Bước 3: Thu cặn tế bào và bổ sung 5 - 10 ml nước lạnh, dùng pipet nhẹ nhàng hút lên xuống làm tan cặn tế bào. Bổ sung thêm nước lạnh đến thể tích 500 ml, ly tâm 6.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở 40C. Bước 4: Thu cặn tế bào và bổ sung 250 ml nước đá và ly tâm 6.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở 40C. Bước 5: Thu cặn và bổ sung 5 ml glycerol 10%. Bước 6: Hoà tan dịch tế bào và chia tế bào khả biến Agrobacterium ra thành từng lượng nhỏ 80 - 100 µl và xử lý qua nitơ lỏng trước khi bảo quản ở -800C.
Gen OsNAC6 trong vector pBCKH được chuyển vào tế bào khả biến Agrobacterium EHA105 bằng xung điện với các bước như sau: Bước 1: Thêm 100 ng plasmid tái tổ hợp vào các tế bào khả biến Agrobacterium EHA105 và trộn đều, để hỗn hợp trong đá khoảng 30 phút. Bước 2: Chuyển hỗn hợp vào cuvet điện đã giữ lạnh và ủ trong đá từ 5 - 10 phút. Tiến hành chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào Agrobacterium EHA105 bằng máy xung điện với các thông số như sau:
Bước 3: Ngay lập tức sau khi xung điện truyền qua cuvet bổ sung thêm 1ml môi trường LB lỏng vào cuvet và chuyển dịch huyền phù vi khuẩn sang ống falcon 15 ml. Ủ có lắc nhẹ (70 - 80 vòng/phút) trong khoảng 4 giờ ở 28ºC. Bước 4: Kết tủa các tế bào bằng cách ly tâm nhẹ (3.000 vòng/ phút), đổ bỏ dịch phía trên chứa môi trường và giữ lại 50 - 100 µl, sau đó cấy trải dung dịch chứa vi khuẩn đã cô đặc lên môi trường LB đặc có bổ sung 50 mg/l kanamycin. Bước 5: Nuôi các tế bào đã biến nạp ở 280C trong thời gian 2 ngày . Bước 6: Nuôi khuẩn lạc đơn trong môi trường YEB lỏng chứa 50 mg/l kanamycin ở 28ºC, lắc ở tốc độ 200 vòng/phút qua đêm. Tiến hành tách chiết plasmid tái tổ hợp từ các vi khuẩn sinh trưởng trên môi trường YEB lỏng có chứa kanamycin theo phương pháp tách chiết plasmid (đã trình bày ở trên) sau đó sử dụng phản ứng cắt enzym giới hạn và điện di kiểm tra trên agarose 1% hoặc sử dụng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt của ADN mong muốn trong plasmid của vi khuẩn. Bước 7: Các khuẩn lạc có kết quả dương tính được nuôi trong môi trường YEB lỏng và giữ trong dung dịch glycerol 15% ở -70ºC.
Hạt lúa được bóc vỏ và được xử lý bằng cách rửa nước cất một lần khử trùng 4 -5 lần, ngâm và lắc nhẹ trong cồn 70% thời gian 1 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng trước khi ngâm trong dung dịch Javen 50% có bổ sung tween 20 trong thời gian 20 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng từ 4 - 5 lần. Hạt khử trùng được thấm khô và đặt trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D, BAP, casein, L-proline , giữ trong tối ở 280C. Sau 15 ngày, callus được tạo thành.
Trước khi chuyển gen 3 ngày, các callus có màu vàng, khô và có đường kính khoảng 1- 3 mm được chọn để chuyển gen. Các callus được cắt ra, tập hợp lại và trải đều trên môi trường tạo callus có ngăn bởi giấy lọc và nuôi ở 280C trong 3 ngày. Chủng Agrobacterium EHA105 chứa gen OsNAC6 được nuôi trong môi trường YEM lỏng có bổ sung 50 mg/l kanamycin, lắc 200 vòng/phút ở 280C trong thời gian 24 giờ.
Callus được nhiễm với Agrobacterium EHA105 mang gen OsNAC6 theo các bước như sau: Bước 1: Tế bào Agrobacterium EHA105 chứa gen OsNAC6 được nuôi qua đêm và đo OD600, sau đó được đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa và hòa tan vào môi trường MS lỏng, sau đó pha loãng tới nồng độ OD600 = 0,5. Bổ sung Acetosyringone ở nồng độ 30 μg/ml. Bước 2: Các callus được cho vào ống fancol chứa dung dịch MS đã được hòa Agrobacterium EHA105 được chuẩn bị ở bước trên. Hỗn hợp được cho vào máy lắc nhẹ trong 30 phút. Bước 3: Sau khi được lắc đều trong dịch khuẩn, callus được đổ ra tấm lưới đã khử trùng và được làm khô bằng cách đặt lên giấy thấm khử trùng để loại bỏ Agrobacterium còn lại, sau đó callus được chuyển lên môi trường Đồng nuôi cấy có ngăn bởi giấy lọc. Các callus sau khi được nhiễm Agrobacterium EHA105 chứa gen OsNAC6 được nuôi trong tối ở nhiệt độ 280C trong thời gian 3 ngày.
Sau quá trình lây nhiễm, các callus được rửa nhiều lần bằng nước đường khử trùng hai lần có bổ sung 500 mg/l cefotaxim, sau đó được làm khô bằng cách đặt lên giấy thấm khử trùng để loại bỏ Agrobacterium EHA105. Callus được chuyển sang môi trường chọn lọc có chứa 50 mg/l hygromycin và nuôi trong tối thời gian 2 tuần ở 280C, mỗi tuần chuyển sang đĩa mới một lần. Những callus phát triển trên môi trường chọn lọc được chuyển sang môi trường tái sinh có bổ sung 50 mg/l hygromycin và được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 250C, độ ẩm từ 50 - 70%, quang chu kỳ 16 giờ/ngày, 3.000 Lux.
Cây lúa sau khi tái sinh được trên môi trường có chứa hygromycin sẽ được dùng làm mẫu để tách chiết ADN tổng số phục vụ cho việc kiểm tra sự có mặt của gen OsNAC6 theo quy trình sau: Qui trình tách nhanh và đơn giản ADN từ lúa Để đơn giản hoá quy trình tinh sạch ADN tổng số, chúng tôi sử dụng quy trình CTAB theo Rajendrakumar và CS (2007) [48] và được tiến hành như sau: Bước 1: Cắt 0,2 mg lá lúa non còn tươi cho vào ống eppendorf 2 ml, cho 600 µl dịch tách ADN (100 mM Tris-Cl (pH = 8,0); 25 mM EDTA (pH = 8,0); 1,25 M NaCl, 2% CTAB và 3% PVP) đã được khử trùng, ngâm trong 30 - 45 phút ở 370C. Bước 2: Dùng chày nhỏ nghiền nát lá đã ngâm để giải phóng ADN. Bổ sung 600 µl chloroform, đảo ống nhẹ nhàng trong 2 phút (không vortex, tránh đứt gãy ADN). Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 3: Chuyển phần dung dịch bên trên chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung thể tích tương đương isopropanol đã làm lạnh (để ở -20 trong 30 phút). Bước 4: Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để thu tủa ADN. Loại bỏ dung dịch phía trên. Rửa kết tủa bằng 500 µl cồn 70% (búng nhẹ để làm bong kết tủa nhưng không phá vỡ ADN), ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại bước này 2 lần). Bước 5: Hoà tan kết tủa trong 50 µl đệm TE/ nước cất loại ion đã khử trùng. Các mẫu ADN tổng số sau đó sẽ được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang phổ hấp thụ (OD) để kiểm tra hàm lượng và chất lượng ADN tổng số thu được.
Các mẫu ADN tổng số tách chiết từ các mẩu lá non như mô tả ở mục 2.2.6.1 được pha loãng về nồng độ 10 ng/µl để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Ba cặp mồi đặc hiệu có thể được sử dụng để xác định sự tồn tại của gen OsNAC6 trong các cây lúa chuyển gen là Ubi-F/NOS-TR; Ubi-F/OsNAC6-R; OsNAC6-F/NOS-TR Phản ứng PCR được tiến hành như mô tả ở mục 2.2.1.1. Các cây chuyển gen có phản ứng PCR cho sản phẩm dương tính được chuyển sang môi trường ra rễ. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Gen OsNAC6 được phân lập từ thư viện cADN chịu hạn của lúa Japonica bằng kỹ thuật PCR lồng với 2 cặp mồi đặc hiệu (OsNac6 và OsNac6-1, bảng 3) đã được chúng tôi thiết kế dựa trên trình tự ADN đặc hiệu của gen OsNac6 có mã số (AB028185.1). Phản ứng PCR lần 1 sử dụng khuôn là thư viện cADN chịu hạn của lúa Japonica với cặp mồi là OsNac6 R-F và chu trình nhiệt như sau: 950C 5 phút; 30 chu kỳ: 940C 1 phút, 520C 1 phút, 720C 1 phút, kết thúc 720C 10 phút. Sản phẩm ADN khuếch đại khi điện di trên gel agarose 1% cho một băng mờ có kích thước xấp xỉ hơn 1 kb (Hình 7, giếng 1,2). 
1 2 M 4 5 926 bp 
Hình 7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen OsNAC6 từ thư viện. M- Thang ADN chuẩn 1kb (invitrogen); Giếng 1, 2 - Sản phẩm ADN khuếch đại lần 1; Giếng 4, 5 - Sản phẩm ADN khuếch đại lần 2 với khuôn là sản phẩm PCR lần 1. Phản ứng PCR lần 2 được tiến hành nhằm thu được sản phẩm ADN khuếch đại có chất lượng đủ đáp ứng cho phản ứng nhân dòng tiếp theo. Sản phẩm ADN khuếch đại lần 1 được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2 với cặp mồi OsNac6 R-F1 và chu trình nhiệt như sau: 950C 5 phút; 30 chu kỳ: 940C 45 giây, 550C 45 giây, 720C 45 giây, kết thúc 720C 10 phút thu được kết quả là một băng ADN đặc hiệu kích thước khoảng gần 1kb, tương đương với kích thước lý thuyết tính toán cho cả khung đọc mở (ORF) của gen OsNac6 và vùng gắn vị trí cắt của enzyme giới hạn là 926 bp (hình 7, giếng 4, 5).Sản phẩm PCR lần 2 được tinh sạch bằng cột GeneluteTM Minus EtBr (Sigma Cat G-2199) (mục 2.2.1.2) trước khi được gắn vào vector nhân dòng pSK II.
Sản phẩm ADN khuếch đại lần 2 được gắn vào vector nhân dòng pSK II tại vị trí enzym giới hạn BamH I theo phương pháp đã mô tả trong mục 2.2.1.3. Vector tái tổ hợp tiếp đó được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α và được sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung ampicillin (Amp.), IPTG và X-gal. Quá trình nhân dòng gen OsNac6 vào vector pSK II được sơ đồ hóa như trên hình 8. Khuẩn lạc trắng mang vector tái tổ hợp được nuôi cấy, tách plasmid cho việc giải trình tự. 
Hình 8. Sơ đồ tách dòng gen OsNAC6 trong vector nhân dòng pBluescript II ( PSK II)
Plasmid pSK II tái tổ hợp mang sản phẩm PCR lần 2 được giải trình tự cả hai chiều trên hệ thống ABI3100 với mồi T3 và T7 (nằm trên vector). Ở chiều xuôi, sử dụng mồi T3 của vector pSK II, đoạn trình tự ADN có chiều dài 580 nucleotide có thể đọc chính xác , còn ở chiều ngược lại sử dụng mồi T7 của vector pSK II, trình tự ADN có chiều dài 550 nucleotide cũng đã được xác định. Phân tích kết quả giải trình tự ADN từ hai chiều cho thấy sản phẩm PCR lần 2 có chiều dài 912 nucleotide (không kể chiều dài vị trí enzyme cắt giới hạn BamH I). Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen phân lập được với các trình tự gen có sẵn trên ngân hàng gen bằng phần mềm Blast chúng tôi nhận thấy gen phân lập được chính là gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 ở lúa có chiều dài 1529 nucleotide gồm phần mã hóa gen có chiều dài 912 nucleotide mã hóa 304 axit amin, phần không mã hóa gen đầu 5’ có chiều dài 112 nucleotide và phần không mã hóa gen đầu 3’ có chiều dài 505 nucleotide (Hình 9). 
Hình 9. Trình tự gen OsNAC6 có chiều dài 1529 nucleotide mã hóa 304 acid amin, vùng không mang mã đầu 5` dài 15 nucleotide, vùng không mang mã đầu 3` dài 7 nucleotide. Trình tự không mã hóa đầu 5` (1-96) và đầu 3` (1031- 1529) được trích dẫn từ ngân hàng gen. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và axit amin của gen phân lập được với trình tự nucleotide và axit amin trong ngân hàng gen bằng phần mềm Blast và Genetyx 6.0 cho thấy gen phân lập được có sự tương đồng rất cao với các nhân tố phiên mã NAC ở lúa mỳ, bạc hà đắng và ngô. Ở mức độ nucleotide, gen OsNAC6 phân lập được có mức độ tương đồng là 100% với OsNAC6 lúa Japonica (mã số: AB028185.1), 93% với nhân tố phiên mã NAC ở ngô (mã số: EU956242.1) và 91% với nhân tố phiên mã NAC ở bạc hà đắng (mã số: AM500854.1) .
Ở mức độ axit amin, gen OsNAC6 phân lập được có mức độ tương đồng là 94% với nhân tố phiên mã NAC ở lúa mỳ (mã số: ADE 34581.1), 94% với nhân tố phiên mã NAC ở bạc hà đắng (mã số: CAM57978.1) và 87% với nhân tố phiên mã NAC ở ngô (mã số: ACG28360.1), (hình 10A). Mức độ tương đồng của các nhân tố phiên mã trong nhóm gen NAC ở lúa Japonica, lúa mỳ, ngô và bạc hà đắng cũng được thể hiện bởi biểu đồ quan hệ phát sinh hình cây thông qua phần mềm Genetyx 6.0 (hình 10B). Khi phân tích trình tự gen OsNAC6 trong phần mềm Blast chúng tôi không thấy trình tự nào của gen OsNAC6 của giống lúa Indica. Ngoài ra, thí nghiệm phân lập gen của chúng tôi khi sử dụng sợi khuôn là thư viện cADN chịu hạn của giống lúa Indica trong PCR cũng cho kết quả âm tính. Rất có thể gen OsNAC6 chỉ có ở giống lúa Japonica và là gen chỉ có một bản gen trong hệ gen lúa Japonica. Các kết quả nghiên cứu khẳng định chúng tôi đã phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 điều khiển tính chịu hạn, mặn ở lúa. Kết quả này là cơ sở quan trọng trong việc nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn, mặn trên các đối tượng cây trồng khác nhau theo định hướng chuyển gen
Vector biểu hiện gen OsNAC6 dưới sự điều khiển promoter Ubiquitin được thiết kế theo hệ thống Gateway dựa trên phản ứng tái tổ hợp của enzym LR clonase. Gen OsNAC6 được gắn vào vector pUC19-Ubi tại vị trí enzym giới hạn BamHI để tạo thành vector cho pUC19-Ubi-OsNAC6 (hình 11A) trong phản ứng sử dụng enzym tái tổ hợp LR clonase. Vector nhân dòng pUC19-Ubi được thiết kế dựa trên bộ khung của vector pUC19 có gắn thêm một cấu trúc (cassette) bao gồm promoter Ubiquitin, enhancer Ω, vùng trình tự đa điểm cắt giới hạn (MCS) và vùng kết thúc phiên mã (Nos-Ter). Hai đầu của cấu trúc này được giới hạn bởi hai vị trí enzym tái tổ hợp LR clonase attL1 và attL2 cho phép chuyển cả cấu trúc vào vector chuyển gen trong phản ứng tái tổ hợp sử dụng enzyme LR clonase. Promoter Ubiquitin và enhancer Ω trước vùng MCS cho phép điều hòa biểu hiện của gen lạ được chèn vào vị trí MCS ở thực vật. Với cấu trúc này biểu hiện của gen OsNAC6 trong vector chuyển gen được điều khiển bởi promoter Ubiquitin (Hình 11A). Trong phản ứng gắn gen OsNAC6 vào vector pUC19-Ubi, chúng tôi chỉ sử dụng một vị trí enzyme giới hạn BamHI nên hoàn toàn có thể xảy ra trường hợp gen OsNAC6 bị gắn ngược chiều trong vector pUC19-Ubi. Để có thể loại bỏ trường hợp này, chúng tôi đã tiến hành PCR v Vector nhận (Destination vector) (Hình 12A) có bộ khung là vector pBI101 được gắn vào một cấu trúc gồm promoter 35S, gen ccdB (gen của virut, rất độc cho vi khuẩn) và gen CmR (gen kháng thuốc kháng sinh cloramphenicol) và được giới hạn hai đầu bởi trình tự chứa hai vị trí đặc hiệu attR1/attR2. Khi phản ứng tái tổ hợp bởi enzym LR clonase xảy ra thì cấu trúc gồm promoter Ubi, OsNAC6 và trình tự kết thúc phiên mã trong vector cho pUC19-Ubi-OsNAC6 sẽ được chuyển vào vector nhận pBCKH để tạo ra vector chuyển gen pBCKH-OsNAC6 thông qua phản ứng clonase. Gen ccdB là gen của virut, rất độc cho vi khuẩn nên khi vector tồn tại gen này mà biến nạp vào vi khuẩn sẽ không xuất hiện khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường LB. Do vậy, chỉ có vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gồm promoter Ubi, OsNAC6 và trình tự kết thúc phiên mã khi được chuyển vào E. coli mới xuất hiện các khuẩn lạc khi nuôi trên môi trường LB có chứa kháng sinh kanamycin. Ngoài ra, năm khuẩn lạc được chọn để kiểm tra sự tồn tại của cấu trúc mang gen OsNAC6 thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Ubi-F/NosT-R. Kết quả kiểm tra cho thấy chỉ có khuẩn lạc số 3 cho kết quả âm tính, còn các khuẩn lạc số 1, 2, 4 và 5 cho kết quả dương tính là các băng ADN có kích thước hơn 1 kb đúng với dự toán. Khuẩn lạc số 1 cho kết quả khếch đại tốt nhất được lựa chọn và được kiểm tra sự tồn tại xuôi chiều của gen quan tâm/ cấu trúc trong vector chuyển gen bằng việc sử dụng các cặp mồi OsNac6-F/Out-R (mồi đặc hiệu ngoài cấu trúc) và Ubi-F/OsNac6-R, Ubi-F/NosT-R, OsNac6-F/OsNac6-R (mồi đặc hiệu trong cấu trúc). Kết quả cho thấy sản phẩm PCR có kích thước chính xác như thiết kế (hình 12B). Cụ thể, với cặp mồi OsNac6-F/Out-R, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1336 pb, với cặp mồi Ubi-F/OsNac6-R sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1018 bp, với cặp mồi Ubi-F/NosT-R, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1102 bp, với cặp mồi OsNac6-F/OsNac6-R, sản phẩm PCR có kích thước 912 bp. Như vậy, khuẩn lạc số 1 chắc chắn mang vector chuyển gen pBCKH-OsNAC6, và được chọn để nuôi cấy, tách plasmid. 
Hạt sau khi bóc vỏ được đem xử lí với các loại chất khử trùng khác nhau, với thời gian và nồng độ khác nhau. Các loại chất khử trùng và thời gian xử lý được chúng tôi khảo sát trong nghiên cứu này bao gồm: thủy ngân (HgCl) 0.1% trong 10 phút, javen (NaOCl) 5% có bổ sung tween 20 (một loại chất hoạt động bề mặt) trong 30 phút, javen (NaOCl) 50% có bổ sung tween 20 trong 20 phút và oxi già (H2O2) 15% trong 15 phút. Các thí nghiệm đều được thực hiện 3 lần, mỗi lần sử dụng 100 hạt lúa cho mỗi cách khử trùng khác nhau, kết quả cụ thể thu được như sau:
Bảng 7. Số liệu thống kê tỉ lệ tạo callus sau khi sử dụng các phương pháp khử trùng khác nhau
H  ình 13. Biểu đồ so sánh hiệu quả của các phương pháp khử trùng lên hạt lúa Pusa Basmati
A B 
C D 
Hình 14. Hình ảnh so sánh hiệu quả của các cách khử trùng hạt khác nhau. A – Khử trùng bằng thủy ngân 0,1% trong 10 phút, B – Khử trùng bằng Javen 5% trong 30 phút, C – Khử trùng bằng Javen 50% trong 20 phút, D – Khử trùng bằng Oxi già 15% trong 15 phút Sau quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy với phương pháp khử trùng bằng Javen 50% có bổ sung tween 20, callus lên nhanh, đẹp, không có nấm khuẩn, tỉ lệ tạo callus cao. Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp khử trùng này để sử dụng trong việc tạo nguồn vật liệu sạch ban đầu cho nghiên cứu tiếp theo. Quy trình khử trùng như sau: Hạt lúa sau khi bóc vỏ được tráng với nước cất 1 lần khử trùng khoảng 4-5 lần, sau đó lắc và ngâm trong cồn 700 với thời gian 1 phút, tráng lại với nước cất 1 lần khử trùng 3-4 lần trước khi ngâm và lắc nhẹ trong Javen 50% có bổ sung tween 20 trong 20 phút. Sau khi khử trùng, hạt được tráng lại với nước cất 1 lần khử trùng 4-5 lần, sau đó được rải lên đĩa có lót giấy thấm khử trùng để làm khô trước khi đặt vào môi trường tạo callus.
Hạt lúa sau khi bóc vỏ và khử trùng được đặt lên môi trường tạo callus. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 3 loại môi trường tạo callus với thành phần cụ thể như sau:
Với mỗi loại môi trường, chúng tôi sử dụng 100 hạt lúa được bóc vỏ và khử trùng theo quy trình giống nhau (thí nghiệm được lặp lại 3 lần). Kết quả thu được như sau:
Bảng 8. Số liệu thống kê tỉ lệ tạo callus trên các môi trường khác nhau
Hình 15. Biểu đồ so sánh hiệu quả của các loại môi trường khác nhau lên khả năng hình thành callus của giống lúa Pusa Basmati 
A B C  
Hình 16. Hình ảnh so sánh callus trên các môi trường khác nhau. A – Môi trường MS1, B – Môi trường MS2, C – Môi trường MS3
Tái sinh cây là một giai đoạn hết sức quan trọng trong quá trình chuyển gen, để các callus chuyển gen có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh đòi hỏi phải có môi trường với những thành phần phù hợp cho việc phát triển của cây. Vì vậy chúng tôi tiến hành tối ưu môi trường tái sinh cho giống lúa Pusa Basmati trước khi tiến hành chuyển gen quan tâm vào giống lúa này. Các loại môi trường tái sinh được chúng tôi sử dụng để nghiên cứu là TS1, TS2 và TS3 với thành phần cụ thể như sau:
Ở mỗi loại môi trường chúng tôi đặt 100 callus chưa chuyển gen để nghiên cứu sự phát triển của callus và hiệu suất tái sinh của mỗi loại môi trường. Sau 3 tuần tái sinh, kết quả thu được như sau:
Bảng 9. Số liệu thống kê tỉ lệ tái sinh cây trên các môi trường tái sinh khác nhau
Hình 17. Biểu đồ so sánh hiệu quả của các môi trường tái sinh giống lúa Pusa Basmati 
A B C  
Hình 18. Hình ảnh so sánh mức độ tái sinh của giống lúa Pusa Basmati trên các loại môi trường. A- Môi trường TS1 B- Môi trường TS2, C- Môi trường TS3 Do hiệu suất tái sinh của môi trường TS2 là lớn nhất, vì vậy chúng tôi chọn môi trường TS2 làm môi trường tái sinh cây chuyển gen.
Để chuyển gen OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati chúng tôi tiến hành lây nhiễm callus với vi khuẩn Agrobacterium EHA105 mang gen OsNAC6. Toàn bộ quá trình lây nhiễm được tiến hành như ở mục 2.2.5.3. Từ 100 hạt lúa được đem vào nuôi cấy ở môi trường MS2, chúng tôi thu được 95 callus và sử dụng số lượng callus này để tiến hành lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium đã được li tâm và hòa tan lại trong 30ml môi trường MS lỏng (bảng 10) có bổ sung 30µl acetosyringone 10mg/ml, sau đó callus được đặt trên môi trường đồng nuôi cấy (bảng 10) và được giữ trong tối ở nhiệt độ 280C trong vòng 3 ngày. Sau 3 ngày, callus được rửa với 800 ml nước đường có bổ sung 0,8ml kháng sinh cefotaxim 1mg/ml để loại bỏ vi khuẩn còn lại và được đặt lên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Hyromycine (bảng 10) Bảng 10. Thành phần các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu
Sau 15 ngày trên môi trường chọn lọc, có 20 callus sống sót và được chuyển sang môi trường tái sinh. 20 callus sống sót sau giai đoạn chọn lọc được đưa vào tái sinh trên môi trường TS2 có bổ sung kháng sinh Hygromycine. Sau 4 tuần tái sinh, chúng tôi thu được 12 cụm callus có chồi sinh trưởng bình thường. Các cây lúa non phát triển tốt được chuyển sang môi trường ra rễ (bảng 10). Sau 10 ngày, cây được chuyển sang các cốc đất và nuôi trong điều kiện phòng nuôi cấy có phủ nilon trong 2 tuần rồi lại chuyển tiếp sang các xô to được trồng ở điều kiện bên ngoài môi trường. 
A E D D C B     
F F F  
Hình 19. Hình ảnh callus qua các giai đoạn từ giai đoạn đặt hạt đến giai đoạn chọn lọc. A – Callus trên môi trường tạo callus, B - Callus trên môi trường Đồng nuôi cấy, C - Callus sống sót trên môi trường chọn lọc, A A D – Callus trên môi trường tái sinh, E – Cây chuyển gen trên môi trường ra rễ, F – Cây chuyển gen đưa ra ngoài môi trường 3.3.5. KIỂM TRA CÂY CHUYỂN GEN 3.3.5.1. Tách chiết ADN tổng số Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ thực vật nói chung và cây lúa nói riêng là công việc đầu tiên và cơ bản nhất đối với mọi thao tác trong công nghệ ADN thưc vật. Tuy nhiên, mỗi đối tượng thực vật lại có những phương pháp tách chiết ADN khác nhau. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã khảo sát hai phương pháp tách chiết ADN tổng số ở lúa đang được sử dụng phổ biến: (1) phương pháp của Saigai-Maroof và CS, 1994 [50]; (2) phương pháp của Rajendrakumar và CS, 2007 [48]. Kết quả cho thấy, cả hai phương pháp tách chiết đều cho sản phẩm ADN tổng số có chất lượng tương tự nhau (Số liệu không minh hoạ). Tuy nhiên phương pháp của Rajendrakumar và CS tiết kiệm được hoá chất và thời gian. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp này cho các thí nghiệm tách chiết ADN tổng số. Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung Hygromycine, 12 dòng lúa còn sống sót và được tiến hành lấy mẫu lá non để tiến hành tách chiết ADN tổng số. Hình 20 là kết quả ADN tổng số được tách chiết bằng phương pháp Rajendrakumar và CS, được điện di trên gel agarose 0,8%. Mười hai mẫu ADN tổng số quan sát được trên gel agarose được tiến hành đo nồng độ ADN bằng máy quang phổ hấp phụ ở bước sóng OD260 sau đó pha loãng để đưa về nồng độ chuẩn 20 ng/μl.
Hình 20. Hình ảnh ADN tổng số từ các dòng lúa chuyển gen trên agarose 1% 1 - 12: ADN của Các dòng lúa Pusa Basmati chuyển gen 3.3.5.2. Kiểm tra sự xuất hiện gen OsNAC6 trong các dòng lúa chuyển gen bằng phản ứng PCR Về nguyên tắc, 12 dòng lúa sinh trưởng tốt trên môi trường chọn lọc chứa hygromycine là các dòng lúa đã được chuyển gen OsNAC6. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác sự tồn tại của gen OsNAC6 trong các dòng lúa chuyển gen này, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết được từ các dòng lúa chuyển gen và cặp mồi đặc hiệu Ubi-F/NOS-T50. Khi sử dụng cặp mồi này, sản phẩm PCR dự kiến có kích thước khoảng 1,3 kb vì cả hai mồi đều cách xa vùng mã hoá gen OsNAC6 khoảng 150-bp. Phản ứng PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 25 µl chứa 20 ng ADN tổng số, 10 pmol mỗi primer, 10 mM dNTPs, 1x đệm và 0,3 µl Taq ADN polymerase với chu kỳ nhiệt như sau: 940C - 5 phút, 30 chu kỳ ( 940C - 45 giây, 550C - 45 giây, 720C - 60 giây), kéo dài 7 phút ở 720C. Kết quả ở hình 24 là sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra sự tồn tại của gen OsNAC6 trong 12 dòng lúa chuyển gen. Trong số 12 dòng lúa chuyển gen, chỉ có 1 dòng không cho sản phẩm PCR, còn lại 11 dòng cho sản phẩm PCR là các băng ADN có kích thước khoảng gần 1300-bp, đúng với kích thước dự đoán (hình 21). Từ kết quả kiểm tra sự xuất hiện gen OsNAC6 trong các dòng lúa chuyển gen bằng phản ứng PCR cho phép chúng tôi đi đến kết luận là có ít nhất 11 dòng lúa Pusa Basmati đã được chuyển gen OsNAC6.  
Hình 21. Điện di sản phẩm nhân gen mã hoá nhân tố phiên mã OsNAC6 ở các dòng lúa Pusa Basmati chuyển gen M: Thang ADN chuẩn 1kb; 1: Đối chứng dương; 2: Đối chứng âm; 3 - 14: Các dòng lúa chuyển gen Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 450.48 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
ới các khuẩn lạc đã được chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung ampicillin sử dụng cặp mồi Ubi-F/OsNac6-R. Nếu gen được gắn đúng chiều thì sản phẩm khuếch đại trong phản ứng PCR sẽ phải có kích thước của gen OsNAC6 và kích thước tính từ mồi Ubi-F tương ứng khoảng 1018 bp. Ngược lại, nếu gen gắn ngược chiều thì PCR sẽ không cho sản phẩm khuếch đại. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy trong số 5 khuẩn lạc được chọn để kiểm tra sự gắn xuôi chiều của gen trong vector nhân dòng thì có khuẩn lạc số 1, 2, 4, 5 cho kết quả dương tính là băng ADN có kích thước tính toán là 1018 bp. Khuẩn lạc số 3 không cho sản phẩm khếch đại có thể là khuẩn lạc có mang gen nhưng bị gắn ngược chiều (hình 11B). Khuẩn lạc số 5 được chọn để nuôi cấy, tách plasmid để làm vector cho trong phản ứng RT clonase.