LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng
Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens
tải về 369.54 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- 1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm
- 1.2.2.1. Ti plasmid
- 1.2.2.2. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
- 1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens
- 1.2.3.2. Thuận lợi và khó khăn
- 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium
1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens1.2.1. Giới thiệu về nấm mốcNấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên. Ước tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài thuộc chi Aspergillus. Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và sống hoại sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22]. Aspergillus là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ: A. niger, A. oryzae... Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A. niger sinh bảo tử có màu đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33]. A. niger gây ảnh hưởng đến các sản phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho con người so với một số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A. flavus, A. fumigatus. A. niger cũng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33]. Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A. niger được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản xuất công nghiệp [10, 13]. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong sản xuất bánh, rượu, bia. Dựa trên lịch sử ứng dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men, A. niger đã được coi là vi sinh vật an toàn và thân thiện với con người, mặc dù một số chủng (chiếm khoảng 3 – 10%) có thể sản xuất ra một số chất chuyển hóa thứ cấp gây độc trong điều kiện lên men như mycotoxin nhưng với hàm lượng rất thấp. Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực vật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất lượng sản phẩm [22]. Chuyển gen vào A. niger đã được khai phá từ những năm cuối thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90, trong gen mã hóa enzyme là một trong những mục tiêu được quan tâm nhất. Hiện nay, nhiều loại enzyme được sử dụng trong các ngành sản xuất công nghiệp, đặc biệt là các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền bởi đặc tính của chúng đã được cải thiện [31]. A. niger là loài có khả năng sinh enzyme với hàm lượng cao và ổn định, do đó chúng trở thành vật chủ để biểu hiện các loại enzyme mong muốn [9, 10, 31]. Chuyển gen vào nấm thường được tiến hành theo hai cách: trực tiếp và gián tiếp. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp được thực hiện bằng xung điện, polyethylene glycol (PEG), và bom vi tiêu để chuyển gen vào thể nguyên sinh, bào tử, hay thể sợi nấm. Ngoài các kỹ thuật trên, một số các kỹ thuật chuyển gen khác được áp dụng ví dụ: chuyển gen nhờ các transposon hay nhờ các enzyme giới hạn. Tuy nhiên, các kỹ thuật này bộc lộ nhiều nhược điểm, chẳng hạn như tần suất tái tổ hợp tương đồng thấp; có thể chuyển nhiều loại gen, kể cả những gen không mong muốn [11, 16]; có thể tạo ra những vùng gen không mã hóa hoặc sau khi chuyển gen thường xảy ra hiện tượng sắp xếp lại genome hoặc tồn tại những trình tự có tốc độ sao mã cao [12]. Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Phương pháp này đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc [1, 9, 12]. 1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm1.1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciensTrong tự nhiên, chúng ta thường gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm một loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức. Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống như tế bào ung thư ác tính ở động vật. 
Hình 1. 2: Khối u thực vật do Agrobacterium [18] Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai có tính hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài khác của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica. Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên [1]. Agrobacterium là chi vi khuẩn Gram âm (–), bao gồm các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [12, 18]. Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [18]. A. tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums [18, 19]. Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A. tumefaciens cũng đã được áp dụng để chuyển gen vào tế bào người [26]. Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing) [12, 26]. T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [19, 29].
Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [12, 26]. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường [1, 22]. Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine [12, 26]. Hợp chất này không được tổng hợp trong Agrobacterium mà chỉ được tổng hợp trong tế bào vật chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn [2]. Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào chủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [12, 26]. Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và gen sinh tổng hợp opine. Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác nhau cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [11]. Khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào chủ và khối u được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin. Đây là các chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục [2, 12], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình thành các khối u. Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình thái khối u. Bên cạnh những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine. Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin [1].
.
Hình 1. 3: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật [19] VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với biên phải của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid. Ngay lập tức trình tự này liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tượng tự bắt cặp lại. VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã được bao bọc bởi T – DNA dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [12, 26]. Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này [26]. Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ hòa nhập vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự gen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tương cao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưng hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [26]. Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách cắt bỏ hấu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và phần T – DNA tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang được sử dụng rất hiệu quả trong việc đưa DNA lạ vào tế bào vật chủ [1]. 1.2.2.2. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium* Vector liên hợp (cointegrate) Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A. tumefaciens. Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli; ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1].
Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA [1, 19]. Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1]. Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau [1, 9, 11].
1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. nigerNhờ khả năng chuyển DNA sang tế bào vật chủ và phổ vật chủ rộng mà chuyển gen nhờ A. tumefaciens trở thành kỹ thuật thông dụng để chuyển gen vào nhiều đối tượng khác nhau, ví dụ: thực vật, vi sinh vật [22, 26]. Nhiều loài thực vật chuyển gen nhờ Agrobacterium, trong đó chiếm số lượng lớn là các cây nông nghiệp, chẳng hạn như khoai tây, cà chua, đậu tương, cây bông và cây lúa đã mang lại năng suất và chất lượng cao, chống chịu với sâu bệnh [3, 9]. Đối với vi sinh vật, nấm men Saccharomyces serevisiae là đối tượng được sử dụng phổ biến nhưng lại không phải là vật chủ tối ưu để chuyển gen nhờ Agrobacterium. Hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium vào nấm men thấp hơn so với chuyển gen vào thực vật và thấp hơn so với các phương pháp truyền thống, ví dụ: xung điện [9]. Chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được Nyilasi ứng dụng để chuyển gen kháng hygromycin B vào Zygomycetes [15]. Agrobacterium cũng được sử dụng để chuyển gen vào nấm sợi, chẳng hạn như: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderm, Neurospora, trong đó phổ biến nhất là các loài Aspergillus, bao gồm: A. awamori, A. nidulans, A. niger [22]. Bảng 1. 1: Các loài nấm được dùng trong chuyển gen thông qua Agrobacterium [9] 
Ngành Phân ngành Lớp Bộ Họ Loài
Myxomycota Eumycota Mastigomycoina Zygomycotina Ascomycotina Ascomycetes Eurotiales Eurotiaceae Aspergillus nidulans Sphaeriales Sordariaceae Neurospora crassa Basidiomycotina Homobasidiomycetes Agaricales Agaricaceae Agaricus bisporus Tricholomataceae Pleurotus ostreatus Deuteromycotiana Deuteromycetes Hyphomycetes Aspergillus niger
Coelomycetes Melanconiaceae Colletotrichuni gloeosporioides
Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A. tumefaciens gồm một số bước sau: i) trước hết gen cần chuyển phải được nối ghép với một vector tách dòng của A. tumefaciens; ii) gen mong muốn phải được nối ghép vào giữa biên phải và biên trái của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này; iii) vector tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens có mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng; iv) chủng vi khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn lọc và phân biệt với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNA được chuyển vào nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển. Nấm chuyển gen tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn gen [11, 22]. Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật. Đó là chúng đều cần một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn gen mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá trình chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi chung (nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việc chuyển màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9].
1.2.3.2. Thuận lợi và khó khăn* Thuận lợi Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm và thuận lợi so với các các phương pháp truyền thống ví dụ: xung điện, PEG, bởi các lý do sau:
Ngoài ra, chuyển gen nhờ Agrobacterium là phương pháp thuận lợi để nghiên cứu chức năng của gen, nghiên cứu tạo gen đột biến [11, 29]. * Khó khăn Bên cạnh những thuận lợi trên, chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens cũng có bất lợi đó là không thích hợp để tạo ra chủng vi sinh vật nhằm thu lượng lớn sản phẩm protien do chỉ hòa nhập một sao duy nhất T – DNA trong khi cần nhiều bản sao để biểu hiện ra sản phẩm của gen. Tuy nhiên, nhược điểm này có thể khắc phục dễ dàng nhờ chuyển lượng lớn phân tử T – DNA có mang gen mong muốn hoặc thay đổi điều kiện khi nuôi nhiễm hoặc thay đổi gen chọn lọc [11]. Như vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấm mốc [9, 11, 12, 16].
Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium là nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng. Nguyên liệu để nuôi chung với A. tumefaciens có thể là bào tử, thể nguyên sinh, thể sợi nấm… đều có thể chuyển gen thành công và hiệu suất chuyển gen ở các trường hợp này là ngang nhau. Trong khi một số loài nấm lại yêu cầu các nguyên liệu rất cụ thể. Một số loài thuộc zygomycetes chẳng hạn như Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, chỉ xuất hiện thể chuyển gen nếu nguyên liệu ban đầu là thể nguyên sinh; với loài Coccidioides immitis chuyển gen chỉ có thể sử dụng bào tử mầm; hiệu suất chuyển gen ở Agaricus bisporus khi dùng bào tử mầm làm nguyên liệu ban đầu sẽ cao hơn so với dùng thể sợi nấm [12]. Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gian bảo quản bào tử nấm. Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ giảm hiệu quả chuyển gen trong quá trình nuôi nhiễm hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của bào tử so với nguyên liệu mới [12].
Chủng giống sử dụng cho cho chuyển gen thông qua Agrobacterium cũng rất đa dạng, ví dụ: LBA 4404, EHA 105, LBA 1100. Hiệu suất chuyển gen khi sử dụng các chủng trên là như nhau nên thật khó để kết luận được sử dụng chủng nào là tốt nhất. Mỗi chủng nấm mang lại hiệu quả khác nhau với tế bào chủ khác nhau. Ngoài ra, với cùng một hiệu suất chuyển gen cũng rất đa dạng khi chuyển gen vào nấm được phân lập theo những cách khác nhau. Bởi vậy, không thể đưa ra kết luận chủng Agrobacterium nào thích hợp để chuyển gen vào nấm [12].
Trong hầu hết các nghiên cứu, AS được bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm bởi đây là hợp chất cảm ứng gen vir cần thiết cho việc chuyển T – DNA. Nhưng trong quá trình nuôi cấy Agrobacterium không cần thiết bổ sung AS, nhiều trường hợp còn dẫn đến giảm hiệu suất biến nạp, chẳng hạn như đối với vật chủ là Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [11, 12].
Yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển gen là tỷ lệ nuôi nhiễm giữa vi khuẩn Agrobacterium và nấm mốc. Cần xác định tỷ lệ thích hợp cho mỗi chủng nấm [11]. Tăng tế bào Agrobacterium hoặc nấm có thể làm tăng hiệu suất chuyển gen. Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên đều phải có những giới hạn nồng độ nhất định. Nếu bổ sung quá nhiều A. tumefaciens, hiệu suất chuyển gen có thể giảm do cạnh tranh dinh dưỡng và mật độ vi khuẩn quá dày, hơn nữa sẽ gặp khó khăn trong việc giết chết Agrobacterium khi chuyển sang môi trường chọn lọc thể nấm chuyển gen. Ngược lại, quá nhiều bào tử nấm, việc phân lập từng tế bào sau quá trình nuôi nhiễm sẽ gặp nhiều khó khăn [12]. Do vậy, quá trình nuôi nhiễm có thể thử nghiệm nhiều tỷ lệ khác nhau để chọn được tỷ lệ phù hợp sao cho hiệu suất cao nhất [11].
Điều kiện cùng nuôi nhiễm là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen. Điều kiện nuôi nhiễm nấm và Agrobacterium bao gồm thời gian, nhiệt độ và màng lọc. Nhiệt độ nuôi nhiễm có thể từ 22° – 37°C, song nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm từ 22° – 25°C, trong thời gian từ 2 – 3 ngày. Ngoài ra, nhiều loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose, Hybond N+ cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [11, 12]. Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể do Quy trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ. Do vậy, để đạt hiệu suất chuyển gen cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12]. Каталог: jspui -> bitstream -> 123456789 -> 4150 123456789 -> Vò Quúnh Thu Cao häc K18 123456789 -> Khoa Báo chí Đhkhxh&NV 123456789 -> Acknowledgements 123456789 -> Danh mục chữ viết tắT 123456789 -> Chương TỔng quan vật liệu mao quản trung bình (mqtb) trật tự 1 Giới thiệu chung 123456789 -> Khoa hóa họC (141 142 báo cáo) 4150 -> LỜi cảM Ơn trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới pgs. Ts. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ adn ứng dụng tải về 369.54 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|
