Bµi 1: thùc nghiÖm vÒ protein vµ amino acid
I. C¸c ph¶n øng mµu
Ph©n tö protein cã mét sè ph¶n øng hãa häc ®Æc trng nh ph¶n øng Biure, ph¶n øng Xanthoprotein, ph¶n øng Pauli, ph¶n øng Xacaguchi…Trong sè c¸c ph¶n øng kÓ trªn cã ph¶n øng dïng ®Ó ph¸t hiÖn sù cã mÆt cña liªn kÕt peptide, cã ph¶n øng dïng ®Ó ph¸t hiÖn c¸c acid amin chøa nh©n th¬m trong ph©n tö protein…ChÝnh nhê nh÷ng ph¶n øng ®ã mµ ngêi ta cã thÓ ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh lîng protein trong dung dÞch.
1. Ph¶n øng Biure
a. Nguyªn lý
Trong m«i trêng kiÒm, c¸c chÊt cã liªn kÕt pepitide sÏ t¸c dông víi Cu2+ t¹o thµnh phøc chÊt cã mµu tÝm hång. Cêng ®é mµu cña ph¶n øng phô thuéc vµo lîng Cu2+ vµ sè lîng c¸c liªn kÕt peptide cã trong ph©n tö protein. Ph¶n øng nµy gièng nh phøc hîp 2 ph©n tö ure víi 1 ion Cu2+ nªn cã tªn lµ ph¶n øng Biure.
C¬ chÕ ph¶n øng
b. TiÕn hµnh
+ èng 1: cho vµo èng nghiÖm khoảng 0,1g ure. Đun trªn ngän löa ®Ìn cån đến khi ure nãng ch¶y; ®Ó nguéi sẽ ®îc biure.
+ èng 2: 1 ml lßng tr¾ng trøng
+ èng 3: 1 ml dung dÞch gelatin 1%
+ èng 4: khoảng 1 ml s÷a t¬i
Cho thªm vµo mçi èng 1 ml NaOH 10%, 1-2 giät CuSO4 1%.
L¾c ®Òu, quan s¸t, so s¸nh vµ gi¶i thích kÕt qu¶.
c. øng dông
- Ph¸t hiÖn protein trong vËt phÈm
- Trong m«i trêng kiÒm m¹nh, phøc hîp mµu ë díi d¹ng anion. Ph¶n øng nµy t¹o phøc hîp cã mµu bÒn, æn ®Þnh, ®îc dïng ®Ó ®Þnh lîng protein.
2. Ph¶n øng Xantoprotein
a. Nguyªn lý
C¸c protein cã chøa amino acid m¹ch vßng nh: phenylanaline, tyrosine, tryptophan, vv… díi t¸c dông cña HNO3 ®Æc, nh©n th¬m cña c¸c amino acid bÞ g¾n nitro sÏ t¹o thµnh dÉn xuÊt nitro cã mµu vµng. NÕu gÆp m«i trêng kiÒm m¹nh th× dÉn xuÊt nµy sÏ t¹o thµnh muèi cã cÊu t¹o d¹ng quinoid cã mµu vµng da cam.
C¬ chÕ ph¶n øng:
b. TiÕn hµnh
Cho vµo 3 èng nghiÖm
- èng 1: 1 ml dung dÞch lòng trắng trứng
- èng 2: khoảng 1 ml sữa tươi
- èng 3: 1 ml dung dÞch gelatin 1%
Cho vµo 3 èng nghiÖm, mçi èng 1 ml HNO3 ®Æc , ®un trªn ngän löa ®Ìn cån, ®Õn khi xuÊt hiÖn mµu vµng. Sau khi đÓ nguéi, cho tõ tõ tõng giät NaOH 20% (kho¶ng 1-2 ml) cho ®Õn khi èng nghiÖm xuÊt hiÖn mµu vµng da cam.
NhËn xÐt vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.
c. øng dông
- Ph¸t hiÖn protein trong vËt phÈm
- KiÓm tra chÊt lîng protein
II. C¸c ph¶n øng sa l¾ng protein
Protein hßa tan trong níc thµnh dung dÞch keo a níc. Trong dung dÞch c¸c tiÓu phÇn protein cïng lo¹i tÝch ®iÖn cïng dÊu, xung quanh tiÓu phÇn protein cã líp vá thñy hãa (ph©n tö lìng cùc liªn kÕt víi nhãm ph©n cùc nh – OH, - COOH, - NH2, ...). Nhê hai yÕu tè trªn, protein tån t¹i díi d¹ng dung dÞch keo bÒn v÷ng. Protein sÏ kÕt tña nÕu lµm mÊt hai yÕu tè hßa tan trªn nh sau :
- Lµm mÊt ®iÖn tÝch cña tiÓu phÇn protein b»ng c¸ch :
+ §a pH cña dung dÞch protein vÒ pH ®¼ng ®iÖn (pHi) cña protein ®ã, khi pH cña dung dÞch b»ng víi pHi cña protein, ®a sè c¸c protein ë d¹ng lìng cùc, kh«ng mang ®iÖn tÝch.
+ Thªm chÊt ®iÖn gi¶i NaCl, (NH4)2SO4…c¸c ion nµy sÏ trung hßa ®iÖn tÝch cña tiÓu phÇn protein.
- Lµm mÊt líp vë thñy hãa b»ng c¸ch :
+ G©y biÕn tÝnh protein, cÊu tróc cña protein sÏ bÞ ®¶o lén b»ng c¸ch ®un s«i, thªm muèi kim lo¹i nÆng, thªm acid, base m¹nh vµ c¸c t¸c nh©n lý häc...
+ Thªm c¸c chÊt hót níc nh rîu etylic, tanin…
Nh÷ng biÕn ®æi nµy ®îc ph©n lµm 2 lo¹i:
+ BiÕn ®æi thuËn nghÞch: tøc lµ dung dÞch keo cã thÓ trë l¹i tr¹ng th¸i ban ®Çu sau khi khö t¸c nh©n ®i. Thuéc lo¹i biÕn ®æi nµy gåm cã c¸c ph¶n øng: ph¶n øng diªm tÝch, t¸c dông nhÑ cña cån, axeton ë nhiÖt ®é thÊp...
+ BiÕn ®æi kh«ng thuËn nghÞch: protein bÞ biÕn ®æi hoµn toµn, bÞ hñy ho¹i, mµ râ nhÊt lµ mÊt tÝnh hßa tan trong níc. Thuéc lo¹i biÕn ®æi nµy gåm: ph¶n øng g©y sa l¾ng bëi c¸c muèi kim lo¹i nÆng, ph¶n øng cña c¸c alkaloit, acid hoÆc kiÒm m¹nh, ®un s«i...
1. Ph¶n øng diªm tÝch (ph¬ng ph¸p dïng muèi)
a. Nguyªn lý
Diªm tÝch lµ ph¬ng ph¸p dïng c¸c muèi nh: NaCl, (NH4)2SO4... ®Ó kÕt tña protein. Nguyªn nh©n kÕt tña lµ do c¸c tiÓu phÇn protein bÞ trung hßa ®iÖn tÝch. C¸c protein kh¸c nhau sÏ tña ë nh÷ng nång ®é muèi kh¸c nhau. V× vËy cã thÓ t¸ch riªng c¸c protein ra khái hçn hîp. VÝ dô globulin cã trong lîng ph©n tö lín h¬n albumin, trong níc globulin tÝch ®iÖn (-) Ýt h¬n albumin, globulin bÞ kÕt tña ë nång ®é amoni sulfat b¸n b·o hßa, cßn albumin kÕt tña ë nång ®é b·o hßa. Sù kÕt tña nµy thuËn nghÞch, khi gi¶m nång ®é muèi b»ng c¸ch pha lo·ng víi níc hay thÈm tÝch th× globuline vµ albumine sÏ hßa tan trë l¹i.
b. TiÕn hµnh
- èng 1: lÊy 3 ml lßng tr¾ng trøng, 3 ml dung dÞch (NH4)2SO4 b·o hßa l¾c ®Òu ta ®îc dung dÞch b¸n b·o hßa, ë nång ®é nµy globulin bÞ sa l¾ng, ®Ó 5 phót, läc sang èng nghiÖm 2.
- èng 2: Cho vào ống 2 bét (NH4)2SO4, vừa cho vừa lắc, ®Õn khi b·o hßa. Ở nång ®é sulfate amon bão hòa, albumin sẽ sa l¾ng. Để 5 phút. Lọc sang èng nghiÖm 3.
- èng 3: thu được sẽ mang thử bằng ph¶n øng biure.
c. øng dông
- KÕt tña b»ng c¸ch nµy c¸c protein kh«ng bÞ biÕn tÝnh nghÜa lµ c¸c tÝnh chÊt lý hãa, sinh vËt häc kh«ng bÞ thay ®æi. Ngêi ta thêng dïng ph¬ng ph¸p nµy ®Ó chiÕt suÊt c¸c protein ho¹t tÝnh.
2. Sa l¾ng b»ng cån
a. Nguyªn lý
Protein bÞ kÕt tña b«ng hoÆc vÈn trong dung m«i h÷u c¬ nh : cån, aceton, eter,... Ph¶n øng tña do protein bÞ mÊt líp vá thñy hãa, tña cµng dÔ nÕu cã thªm c¸c chÊt ®iÖn gi¶i NaCl. KÕt tña b»ng cån cã thÓ lµ kÕt tña thuËn nghÞch nÕu tiÕn hµnh ë nhiÖt ®é thÊp (O0 ®Õn – 150C) vµ tña ®îc t¸ch khái cån mét c¸ch nhanh chãng.
b. TiÕn hµnh
- èng 1 : 1 ml cån 96o
- èng 2: 1 ml cån 96o, thªm vµo 1-2 giät NaCl b·o hßa
Cho vµo mçi èng nghiÖm 1 ml dung dÞch lßng tr¾ng trøng.
- èng 3: 1ml cån 96o, 1ml dung dÞch gelatin 1%.
NhËn xÐt vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.
c. øng dông
- Dïng cån s¸t trïng khi tiªm hoÆc phÉu thuËt
- Dïng ®Ó t¸ch chiÕt enzyme
3. Sa l¾ng bëi nhiÖt ®é cao
a. Nguyªn lý
Protein khi ®un nãng sÏ bÞ x¸o trén vÒ mÆt ph©n tö, mÊt líp vá thñy hãa nªn mÊt tÝnh hßa tan vµ bÞ ®«ng vãn. HiÖn tîng nµy x¶y ra m¹nh ë ®iÓm ®¼ng ®iÖn. NÕu sù biÕn tÝnh nµy x¶y ra ë pH kh¸c nhau (trong m«i trêng kiÒm m¹nh, hoÆc acid m¹nh), ph©n tö protein vÉn ë tr¹ng th¸i tÝch ®iÖn nªn kh«ng bÞ ®«ng vãn mµ ë d¹ng dung dÞch.
b. TiÕn hµnh
- LÊy 5 èng nghiÖm, cho vµo mçi èng 2 ml dung dÞch lßng tr¾ng trøng.
+ èng 1: ®un s«i vµ theo dâi sù kÕt tña dÇn dÇn protein.
+ èng 2: thªm 1 giät acetic acid 1% ®Ó t¹o ®iÓm ®¼ng ®iÖn, ®un s«i.
+ èng 3: thªm 0,5 ml acetic acid 10%, ®un s«i.
+ èng 4: thªm 0,5 ml NaOH 10%, ®un s«i.
+ èng 5: thªm 0,5 ml acetic acid 10%, 3-4 giät NaCl b·o hßa, ®un s«i.
NhËn xÐt vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.
c. øng dông
- Dïng nhiÖt ®é ®Ó hÊp, sÊy tiÖt trïng…c¸c dông cô.
Bµi 2: thùc nghiÖm vÒ enzyme
1. Thuû ph©n tinh bét bëi amylase
a. Nguyªn lý
Tinh bét lµ polysaccharide, gåm nhiÒu glucose liªn kÕt víi nhau bëi liªn kÕt - 1,4 glycoside vµ -1,6 glycoside, v× vËy tinh bét kh«ng cã nhãm aldehyde tù do ®Ó thÓ hiÖn c¸c ph¶n øng ®Æc hiÖu cña nhiÒu lo¹i ®êng ®¬n vµ ®êng kÐp, nh ph¶n øng Tromer. Amylase cña níc bät cã kh¶ n¨ng c¾t c¸c m¹ch nèi vµ biÕn ®a ®êng thµnh nh÷ng chÊt cã ph©n tö nhá h¬n (d¹ng dextrin) cho ®Õn d¹ng ®êng kÐp maltose. Níc bät cßn chøa mét Ýt mantase thuû ph©n maltose thµnh glucose. Nhê sù cã mÆt cña nhãm aldehyde tù do nªn glucose cho ph¶n øng tromer dương tính.
b. TiÕn hµnh
- Sóc miÖng b»ng níc cÊt. NgËm mét Ýt níc cÊt khoảng 1-3 phót, khÏ cö ®éng lìi ®Ó trén ®Òu níc bät víi níc cÊt, råi cho qua phÔu läc vµo èng nghiÖm được dd chứa amylase.
- Nhá lªn phiÕn sø hai d·y dung dÞch lugol 1% : một dãy TN và 1 ĐC.
- LÊy hai èng nghiÖm
+ èng A: cho 3 ml tinh bét 1%, 2 ml dung dịch amylase (èng TN)
+ èng B: cho 3 ml tinh bét 1%, 2 ml níc cÊt (èng ĐC)
L¾c ®Òu hai ống, nhá vài giọt từ ống TN vào 1 lỗ ở dãy TN, vài giọt từ ống ĐC vào 1 lỗ ở dãy ĐC. Sau khoảng 2 phút lại nhỏ vào lỗ tiếp theo. Quan s¸t sù ®æi mµu vµ nhËn xÐt.
- PhÇn cßn l¹i cña 2 èng thö b»ng ph¶n øng Tromer. Nhận xét kÕt qu¶.
2. ¶nh hëng cña nhiÖt ®é
a. Nguyªn lý
PhÇn lín c¸c enzyme cã ho¹t lùc m¹nh ë th©n nhiÖt. NÕu nhiÖt ®é qu¸ thÊp th× enzym sÏ ho¹t ®éng rÊt yÕu, ngù¬c l¹i nÕu nhiÖt ®é cao th× enzyme sÏ bÞ tª liÖt vµ bÞ huû ho¹i.
b. TiÕn hµnh
LÊy 3 èng nghiÖm
+ èng 1: cho 1 ml dung dÞch amylase, ng©m vµo chËu níc ®¸ 15 phót.
+ èng 2: cho 1 ml dung dÞch amylase, ®un s«i , ®Ó nguéi
+ èng 3: cho 1 ml dung dÞch amylase
Sau ®ã cho mçi èng 1 ml dung dÞch tinh bét 1% l¾c ®Òu, ®Ó yªn trong 5-10 phót råi thö b»ng ph¶n øng Tromer hoặc dd lugol 1%. Quan s¸t mµu cña c¸c èng vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.
3. T¸c dông ®Æc hiÖu
a. Nguyªn lý
Amylase vµ sucrase lµ hai enzyme thñy ph©n liªn kÕt glycoside, nhng amylase chØ thñy ph©n liªn kÕt , 1-4 glycoside cña tinh bét, cßn sucrase chØ thñy ph©n liªn kÕt , 1-2 glycoside cña sucrose.
b. TiÕn hµnh
LÊy 4 èng nghiÖm
+ èng 1: cho 1 ml dung dÞch tinh bét 1%, 1 ml dung dÞch amylase
+ èng 2: cho 1 ml dung dÞch sucrose 1%, 1 ml dung dÞch amylase
+ èng 3: cho 1 ml dung dÞch sucrose 1%, 1 ml dung dÞch sucrase
+ èng 4: cho 1 ml dung dÞch tinh bét 1%, 1 ml dung dÞch sucrase
L¾c ®Òu råi thö b»ng ph¶n øng Tromer, quan s¸t mµu cña c¸c èng nghiÖm vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶.
4. ¶nh hëng cña pH
a. Nguyªn lý
V× cã bản chất protein, nªn enzyme rÊt mÉn c¶m víi pH cña m«i trêng. Mçi lo¹i enzyme cã mét pH tèi u trong ho¹t ®éng cña mình, vÝ dô pepsin cã ho¹t lùc m¹nh ë pH 1,5-2,5. pH m«i trêng cµng gÇn pH tèi u, tèc ®é ph¶n øng cµng cao, nghÜa lµ enzyme ho¹t ®éng cµng m¹nh. Do ®ã sù thay ®æi pH dï nhá còng ¶nh hëng ®Õn ho¹t ®é cña enzyme, do ¶nh hëng ®Õn tr¹ng th¸i ion hãa cña enzyme.
b. C¸ch tiÕn hµnh
LÊy thËt chÝnh x¸c vµo c¸c èng nghiÖm ®¸nh sè tõ 1- 8 theo chØ dÉn díi ®©y:
Sè èng
pH (ml)
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
5,4
|
1
|
|
|
|
|
|
|
|
5,8
|
|
1
|
|
|
|
|
|
|
6,2
|
|
|
1
|
|
|
|
|
|
6,6
|
|
|
|
1
|
|
|
|
|
6,8
|
|
|
|
|
1
|
|
|
|
7,2
|
|
|
|
|
|
1
|
|
|
7,6
|
|
|
|
|
|
|
1
|
|
8
|
|
|
|
|
|
|
|
1
|
Tinh bét 1%
|
1 ml
|
1ml
|
1 ml
|
1 ml
|
1 ml
|
1 ml
|
1 ml
|
1 ml
|
Amylase
|
0,5ml
|
0,5ml
|
0,5ml
|
0,5ml
|
0,5ml
|
0,5ml
|
0,5ml
|
0,5ml
|
L¾c ®Òu, ®Ó 10 phót råi thö b»ng ph¶n øng Tromer hoặc dung dịch Lugol 1% cho biÕt kÕt qu¶ vµ nhËn xÐt.
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |