ChuyêN ĐỀ: Ứng dụng di ruyền họC
Kỹ thuật tạo cADN – Xây dựng thư viện gen
tải về 1.11 Mb. Chế độ xem pdf
|
| 2.6. Kỹ thuật tạo cADN – Xây dựng thư viện gen
Thư viện gen thực chất là một tập hợp toàn bộ các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp mà mỗi loại mang các bản sao của đoạn nhất định trong bộ gen ban đầu. Mỗi dòng tái tổ hợp trong bộ gen giống như một cuốn sách chứa đựng thông tin đặc thù. 14 Trong kỹ thuật xây dựng thư viện gen, người ta có hai phương pháp đó là: - Phương pháp 1: nhân dòng ngẫu nhiên (shotgun) từ các đoạn cắt của enzyme cắt giới hạn và lưu trữ cADN. Trong phương pháp nhân dòng ngẫu nhiên, mỗi một đoạn cắt sẽ được nhân dòng vào một vector, sau đó chọn lọc và lưu giữ. Phương pháp này cũng được sử dụng nhiều, song đối với bộ gen của sinh vật nhân thực sẽ gặp khó khăn khi biểu hiện vì sự xuất hiện của gen phân mảnh. Bộ gen của sinh vật nhân thực có kích thước rất lớn, gồm nhiều gen và cấu trúc rất phức tạp. Sự phân mảnh của các đoạn ADN ở sinh vật nhân thực gây khó khăn cho việc tạo dòng từ phân tử ADN gốc. Người ta sẽ rất khó xác định các đoạn ADN không chứa intron để nhân dòng, tạo lập một sản phẩm protein hoàn chỉnh. - Phương pháp 2: dùng mARN để tạo và lưu trữ cADN bằng kỹ thuật tạo thư viện của cADN của bộ gen.Người ta thường phải theo cơ chế sao mã ngược từ phân tử mARN trưởng thành. Các phân tử ADN tạo ra theo cách này được gọi là cADN (complementary ADN). Tổng số các đoạn cADN thu được từ một tế bào, ở các giai đoạn khác nhau tạo thành thư viện cADN. Trình tự các bước tạo cADN có thể được tóm tắt như sau: + Tách chiết ARN tổng số, sau đó tách riêng mARN. Thông thường người ta dùng sắc ký với màng cellulose – oligoT do phân tử mARN trưởng thành ở sinh vật nhân thực có đuôi polyA. Sau khi rửa trôi các loại ARN khác trong hỗn hợp, mARN được tách ra khỏi màng nhờ phức chất Tris-EDTA. + Sử dụng mARN làm khuôn cùng với enzyme sao mã ngược reverse transcriptase nhằm lắp ghép các nucleotide theo khuôn mARN để tạo phân tử cADN. + Tạo dòng cADN, lưu giữ để xây dựng thư viện cADN. + Chọn lọc dòng bằng lai phân tử. Ưu thế của kỹ thuật này là tạo được dòng phân tử không chứa intron, chủ động tạo ra sản phẩm protein mong muốn nhờ biến nạp vector tạo dòng và vật chủ mới, từ đó có thể sản xuất sinh khối protein mong muốn. Tuy nhiên, kỹ thuật tạo cADN cho ta nhiều gen khác nhau. Mặt khác, mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể thì sự phiên mã của bộ gen là khác nhau, vì vậy sự thiết lập ngân hàng cADN và chọn lọc gen mong muốn đòi hỏi công phu, tỉ mỉ và tốn nhiều thời gian. tải về 1.11 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|