ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

Nguyên nhân gây ra hội chứng Fragile X là do sự mở rộng của trinucleotide CGG lặp lại ở vùng 5' chưa được dịch mã trong gen FMR1 trên nhiễm sắc thể X. Hội chứng Fragile X là bệnh lý gặp ở cả nam lẫn nữ trong đó bệnh ảnh hưởng đến nam giới nhiều hơn nữ giới [6].



Hình 4. (A) Ảnh hiển vi điện tử NST X của bệnh nhân FXS (mũi tên chỉ điểm Fragile ở vị trí Xq27.3) và (B) Bệnh nhân mắc hội chứng FXS. (nguồn: https://d-nb.info/102394720X/34)

Cai X. và các cộng sự (2019) đã tiến hành phân tích Southern blot để phát hiện hội chứng FXS nhờ phân cắt DNA bằng enzyme EcoRI và EagI. Phương pháp này phát hiện kích thước của vùng lặp lại CGG bằng cách lai mẫu dò (GLFXDig1 GeneProber) với DNA được phân đoạn bởi enzym hạn chế EcoRI và EagI và được thấm lên màng lai nylon. Bởi vì kích thước và sự methyl hóa của CGG lặp lại tương quan với kiểu hình lâm sàng của các rối loạn liên quan đến FMR1. Do vậy, người ta thực hiện phân tích Southern blot nhằm sàng lọc phụ nữ mang mầm bệnh, chẩn đoán trước khi sinh cho các thai kỳ có nguy cơ và chẩn đoán các rối loạn liên quan đến FMR1 sau sinh [5]. Ở một nghiên cứu tương tự đối với một bé gái 7 tuổi mắc hội chứng FXS, Liang S. và các cộng sự (2008) đã phát hiện băng 10,9kb (ngoài băng 2,8 kb và 5,2 kb ở người bình thường) (hình 5 –IP) nhờ kỹ thuật Southern blot với DNA bộ gen được phân cắt bởi NruI và EcoRI và lai với mẫu dò pFXa1NHE được đánh dấu digoxiginin [6].

Báo cáo này đã chứng minh rằng băng 10,9kb quan sát được ở bệnh nhân này được di truyền từ cha của cô ấy và là kết quả quá trình chuyển đổi ngược dòng G→A ở CGG lặp lại trong 5'-UTR của gen FMR1, loại bỏ vị trí hạn chế 11.114 EcoR1 [6]. 



Hình 5. Phân tích Southern blot của gia đình bé gái 7 tuổi mắc hội chứng Fragile X [6].

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD - Duchenne muscular dystrophy) là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3.500 bé trai được sinh ra. Nguyên nhân do đột biến gen Dystrophin - gen lặn nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể X (Xq21), gây thiếu hụt protein Dystrophin nằm ở bề mặt màng tế bào cơ vân, dẫn đến thoái hóa cơ và teo cơ.  Do đó, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne cần được chẩn đoán sớm để có hướng điều trị phù hợp. Vì vậy, Kawamura J. (1997) đã tiến hành nghiên cứu nhằm xác định đột biến trên gen Dystrophin bằng kỹ thuật Southern blot và Multiplex PCR. Nghiên cứu này cho thấy 50% trường hợp do đột biến mất đoạn một phần gen Dystrophin và kỹ thuật lai Southern là phương pháp đáng tin cậy nhất để phát hiện người mang đột biến và đột biến lặp đoạn, mất đoạn trong gen Dystrophin, nhưng quy trình này đòi hỏi kỹ thuật cao [7].

Như vậy, trong y học lâm sàng nhiều bệnh di truyền gen lặn hoặc sai hỏng gen được chẩn đoán sớm ở bà mẹ mang thai hoặc trẻ sơ sinh bằng kỹ thuật lai Southern blot. Đây là một thành tựu vượt bậc nhằm phát hiện và can thiệp sớm để giảm tối thiểu mức độ biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, kỹ thuật này làm nảy sinh nhiều vấn đề xã hội liên quan đến đạo đức sinh học, một giả thuyết đặt ra liệu rằng con người có lựa chọn “phá thai” – vứt bỏ một sinh mạng chỉ vì thai nhi được chẩn đoán mắc bệnh trước khi sinh.

Ngoài ra, kỹ thuật lai southern blot còn được áp dụng để chẩn đoán các bệnh do tác nhân ngoại lai (virus, vi khuẩn) gây bệnh cho con người. Chẳng hạn:

 Bệnh bạch cầu tế bào T ở người trưởng thành (ATL - adult T-cell leukemia) là một loại ung thư hiếm gặp ở các tế bào T của hệ miễn dịch do virus phiên mã ngược, hay còn gọi là virus bạch cầu dòng tế bào lympho T ở người (HTLV-1) gây ra. Virus HTLV-1 có thể chuyển các vật liệu di truyền của nó thành DNA trong tế bào ký chủ gây nhiễm trùng các tế bào bạch huyết của người. Bệnh này đã được miêu tả lần đầu tiên năm 1980 và đã được nhận dạng trên khắp thế giới, phổ biến ở Nhật Bản và các quốc gia khác thuộc khu vực Tây Thái Bình Dương, vùng Ca-ri-bê, Tây Phi và Nam Mỹ. Để hỗ trợ chẩn đoán các khối u ác tính huyết học, nhóm ngiên cứu Sugahara K. và Yamada Y. (2000) đã tiến hành phân tích Southern blot bằng cách sử dụng đầu dò được đánh dấu digoxigenin lai với DNA của bệnh nhân và phát hiện sự tích hợp đơn dòng của bộ gen tiền virus HTLV-1 (tác nhân gây bệnh ATL) [8]. Từ đó, cho thấy hiệu quả của kỹ thuật lai phân tử trong chẩn đoán các bệnh lý do tác nhân virus gây ra.

Một ví dụ khác, viêm gan B do nhiễm virus viêm gan B (HBV) gây ra xơ gan và ung thư gan, và ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu người chết do viêm gan B và các biến chứng của nó. Là một thành phần thiết yếu của vòng đời virus, DNA vòng kín cộng hóa trị (cccDNA) của HBV được tổng hợp và duy trì ở số lượng bản sao thấp trong nhân tế bào gan bị nhiễm, và đóng vai trò như khuôn mẫu phiên mã cho tất cả RNA của virus. Do đó, cccDNA chịu trách nhiệm hình thành sự lây nhiễm và tồn tại của virus. Do đó, việc hiểu rõ cơ chế hình thành và điều hòa cccDNA là rất quan trọng trong việc nắm được cơ chế bệnh sinh của HBV và tìm ra phương pháp chữa trị bệnh viêm gan B. Dưới đây chúng tôi mô tả chi tiết quy trình tách chiết và phát hiện cccDNA của HBV. Chính vì vậy, Cai D. và các cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng thành công quy trình chi tiết tách chiết và phát hiện cccDNA của HBV bằng kỹ thuật lai Southern blot. Không chỉ cccDNA có thể được phát hiện trực tiếp bằng kỹ thuật lai phân tử, mà còn phân biệt cccDNA với các loài DNA virus khác thông qua sự dịch chuyển khác nhau trong quá trình điện di trên gel agarose. Nghiên cứu này cho thấy kỹ thuật Southern blot đáng tin cậy để xét nghiệm cccDNA với các mẫu nuôi cấy tế bào, và nó hữu ích cho cả sinh học phân tử HBV và nghiên cứu kháng virus [9].

Hay là, ở nghiên cứu của Tham K. M và các cộng sự (1991) đã tiến hành kiểm tra đối với các mẫu DNA từ sinh thiết các tổn thương cổ tử cung bằng phương pháp lai Southern blot nhằm xác định sự hiện diện của DNA HPV - tác nhân gây ra bệnh U nhú ở người. U nhú ở người (HPV - Human papillomaviruses) là bệnh nhiễm trùng phổ biến nhất ở đường sinh sản do virus HPV gây ra. Bệnh này có liên quan đến các khối u lành tính và ác tính của cổ tử cung. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng mẫu dò DNA được đánh dấu phóng xạ tìm HPV 11, 16, 18, 31 và 33 để lai với DNA bộ gen được phân cắt bởi enzyme hạn chế PstI, phân đoạn trên gel agarose 0.8% và cố định trên màng lai nylon. Kết quả cho thấy DNA của HPV được phát hiện trong 74% mẫu sinh thiết (42 trong số 57 trường hợp), với các loại chủ yếu là HPV 16 và HPV 18 [10].

Qua các dẫn chứng ở trên, chúng ta có thể khẳng định rằng kỹ thuật lai Sourthern blot rất hữu ích trong việc chẩn đoán các bệnh ở người. Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật này không còn được sử dụng nhiều do nhiều kỹ thuật phân tử hiện đại khác cho kết quả chẩn đoán bệnh chính xác và nhanh hơn.

2. 
   
   
   
   tải về 0.49 Mb.
   
   Chia sẻ với bạn bè của bạn: