KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT

Kỹ thuật Southern blot được mô tả lần đầu tiên vào năm 1975 bởi Edwin Southern – nhà sinh học phân tử người Anh [3]. Và phát minh này vinh dự đạt giải thưởng Albert Lasker về Nghiên cứu Y khoa Lâm sàng năm 2005.

Southern blot là kỹ thuật lai phân tử giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA. Kỹ thuật này cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen nhằm phát hiện và xác định các chuỗi nucleic acid đặc trưng hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong genomic DNA của sinh vật.



Hình 1.  Giáo sư Edwin Southern – nhà sinh học phân tử người Anh

2. 
   Nguyên tắc của kỹ thuật lai Southern blot
   

Kỹ thuật lai Southern blot dựa trên sự biến tính - hồi tính của phân tử DNA và nguyên tắc bắt cặp bổ sung giữa các base A-T, G-C thông qua liên kết hydrogen. Kỹ thuật này sử dụng mẫu dò DNA được đánh dấu lai với DNA đích được cố định trên một vật đỡ rắn (màng nitrocellulose hoặc nylon). Dưới điều kiện thích hợp hai chuỗi DNA đơn tạo thành một phân tử lai. Phản ứng lai phụ thuộc rất nhiều vào mức độ tương đồng của hai trình tự nucleotide. Do đó, nó đã cung cấp một công cụ có giá trị để phát hiện và xác định các chuỗi DNA quan tâm [1].

3. 
   Quy trình
   

Kỹ thuật lai Southern blot bao gồm 3 bước cơ bản:

- Phân tách các đoạn cắt hạn chế của genomic DNA bằng điện di trên gel agarose

+ DNA mang chuỗi đích được cắt bởi một hoặc một vài enzyme hạn chế (ví dụ ở sơ đồ hình 2: DNA genomic và mẫu dò được cắt bằng EcoRI) tạo thành một tập hợp các đoạn DNA có chiều dài khách nhau.

+ Phân đoạn theo kích thích bằng điện di trên gel agarose.

Hình 2. Sơ đồ của kỹ thuật lai Southern blot [1].

- Chuyển DNA từ gel agarose lên màng lai (nitrocellulose hoặc nylon): Sau khi biến tính, DNA sợi đơn được chuyển từ gel agarose lên màng lai bằng phương pháp thẩm tích mao dẫn hoặc thẩm tích nửa khô bằng dòng điện và được cố định trên màng lai.

*Lưu ý:

+ Đối với những đoạn DNA có kích thước lớn trước khi chuyển lên màng lai cần khử purin bằng dung dịch HCl loãng.

+ Màng lai được sử dụng trong kỹ thuật lai Southern blot là màng nylon và nitrocellulose. Tuy nhiên màng nylon có sức chịu đựng cao nên có thể tái sử dụng và gắn các đoạn DNA ngắn (<500bp) hiệu quả hơn màng nitrocellulose.

+ DNA sau khi thẩm tích lên màng được liên kết đồng hóa trị bằng chiếu UV trong thời gian ngắn (1-2 phút) ở 2000J đối với màng lai nylon. Còn đối với màng lai nitrocellulose thì đun nóng ở 80^oC trong điều kiện chân không khoảng 2 giờ.

+ Trong quá trình thẩm tích, thông thường đệm chuyển có nồng độ muối cao được sử dụng cho genomic DNA và ngược lại đệm có nồng độ muối thấp thích hợp với DNA plasmid.

- Lai các mẫu dò được đánh đấu đồng vị phóng xạ ³²P với các DNA được cố định trên màng lai

+ Mẫu dò DNA được đánh dấu bằng ³²P và gây biến tính trước khi thực hiện phản ứng lai.

+ Lai các DNA đã được cố định trên màng lai với mẫu dò có đánh dấu đồng vị phóng xạ ³²P ở điều kiện tối thích nhằm tăng tính đặc hiệu của phản ứng lai giữa mẫu dò với các chuỗi DNA đích. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A-T và G-C) của mẫu dò với DNA đích.

+ Sau quá trình lai, màng lai được rửa để loại bỏ các tín hiệu không đặc hiệu.

+ Cuối cùng, nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các đoạn DNA đích liên kết đặc hiệu với mẫu dò.

2. 
   
   
   tải về 0.49 Mb.
   
   Chia sẻ với bạn bè của bạn: