TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên lê Thị Thu Huyền phân lập VI khuẩn có hoạt tính keratinaza và MỘt số ĐẶc tính của enzim
tải về 389.84 Kb.
|
* Ứng dụng trong công nghiệp dệt Keratinza được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Keratinaza có tác dụng thủy phân lớp protein serin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. * Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 được thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các proteaza bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là proteaza serine được sản xuất từ các chủng Bacillus , và chủ yếu là từ Bacillus subtilis (1). Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzim proteaza (17). Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ 2.1.1. Vật liệu - Các mẫu đất chôn lông gà từ 1 đến 6 tháng thu thập từ các vị trí khác nhau tại các huyện Thanh Hà, Ninh Giang tỉnh Hải Dương; quận Hà Đông thành phố Hà Nội. Các mẫu đất này được sử dụng để phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza. Các mẫu đất được sử dụng trong nghiên cứu: Mẫu A: Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Thanh Hồng, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương. Mẫu B : Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Hợp Đức, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương. Mẫu C: Đất ở nơi thải lông của cơ sở giết mổ gia cầm tư nhân, thị trấn Thanh Hà, huyện Thanh Hà, Hải Dương. Mẫu D: Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại huyện Ninh Giang, tỉnh Hải Dương. Mẫu E: Đất đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại quận Hà Đông, Hà Nội. - Lông gà, tóc,...
Các hoá chất được sử dụng nghiên cứu hầu hết là các hoá chất được nhập ngoại của các hãng Sigma, Merc, Aldrich,… Các loại dung dịch đệm được sử dụng:
- Các dung dịch đệm có pH 7,8 -11,0 ( đệm borat )
- Đệm Tris - HCl. * Môi trường nuôi cấy - Môi trường Nutrient Agar (NA, g/l) để phân lập vi khuẩn: Cao thịt bò 3 Pepton 10 Agar 18
Nước cất 1000ml pH = 7
Khử trùng ở 1210C, 1 atm, 30 phút. - Môi trường LB (g/l) để giữ giống: Cao nấm men 5 Pepton 10 NaCl 5
Agar 18 pH 7
Khử trùng ở 1210C, 1 atm, 30 phút. - Môi trường thạch sữa (g/l): Pepton 5
Cao nấm men 3 Sữa không béo vô trùng 100 ml Agar 12
Lông sạch 8 MgSO4 0.1 KH2PO4 2 Glucozơ 2 Nước cất 1000ml pH 7.0
K2HPO4 1.5 KH2PO4 0.7 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 0.5 FeCl3 0.2 Lông sạch 10 Nước cất 1000 ml pH 7
- Cân kĩ thuật - Lò vi sóng - Tủ cấy vô trùng - Nồi khử trùng - Tủ nuôi ổn nhiệt - Máy lắc ổn nhiệt S150 (Bibby - Anh), SI - 300R (Trung Quốc) - Máy lắc GFL 3017 - Máy li tâm Eppendorf - Máy đo OD - Kính hiển vi quang học - Tủ lạnh Ngoài ra còn một số dụng cụ phòng thí nghiệm khác như: pipet của hãng Eppendof, bình nón, bình cầu, ống nghiệm, hộp lồng, cuvert, giấy lọc, giấy đo pH, lam kính, lamen, ...
Mẫu đất được pha loãng bằng nước cất vô trùng ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10-5. Cấy trải trên môi trường NA, ủ ở 370C trong 24h. Các khuẩn lạc mọc lên được kiểm tra, phân loại theo hình thái; sau đó được cấy ria trên môi trường NA, tiếp tục ủ ở 370C trong 24h để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc. Sau khi đã được tinh sạch thì cấy truyền sang môi trường LB trong ống thạch nghiêng để giữ giống. Các chủng phân lập được kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách: - Pha chế môi trường phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza (xem phần các loại môi trường nuôi cấy). Chia đều vào các bình nón 150 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường. - Dùng que cấy đã vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy lần lượt một ít vi khuẩn đã tinh sạch mỗi chủng hoà vào môi trường nuôi lắc trên. Chú ý: Khử trùng que cấy sau mỗi lần lấy ở từng chủng. - Nuôi lắc, 150 vòng / phút ở 370C trong 6 ngày. Chủng có hoạt tính keratinaza sẽ làm phân rã lông gà có thể quan sát được bằng mắt thường. 2.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza. - Các chủng có hoạt tính keratinaza được kiểm tra hình dạng tế bào bằng cách nhuộm Gram: + Bước 1: Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính; dùng que cấy đã vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy 1 ít vi khuẩn hoà vào giọt nước. + Bước 2: Làm khô vết bôi trong không khí. + Bước 3: Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn: Đưa vết bôi nhanh qua ngọn đèn cồn 2 - 3 lần. + Bước 4: Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước. + Bước 5: Nhuộm bằng dung dịch iot (dung dịch lugol) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước. + Bước 6: Phủ lên bằng dung dịch etanol 95% : axeton (1 : 1) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước. + Bước 7: Nhuộm bằng thuốc nhuộm màu đỏ trong 30 - 60s, rửa qua nước, để khô. + Bước 8: Quan sát tiêu bản ở vật kính dầu. G+ không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và iot, cồn còn làm cho các lỗ trong peptiđoglican co lại; do đó bắt màu tím. G- bị dung môi tẩy thuốc nhuộm đầu do lipit của lớp màng ngồi bị hoà tan làm tăng tính thấm của màng; do đó, sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - iot và làm vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm này (đỏ). - Kiểm tra khả năng sinh nội bào tử của các chủng bằng cách: + Đun dịch nuôi pha loãng của mỗi chủng ở 800C trong 15 phút sau đó lấy ra để nguội. + Cấy trải trên môi trường NA rồi đưa vào ủ trong tủ ấm 370C trong 24h. + Lấy ra quan sát khả năng tạo khuẩn lạc của mỗi chủng. Nếu có khả năng tạo khuẩn lạc chứng tỏ chủng nghiên cứu có khả năng sinh nội bào tử. - Quan sát hình thái khuẩn lạc: Lấy một ít sinh khối đã tinh sạch, pha loãng, cấy trải trên môi trường NA, đưa vào tủ ấm giữ ở 370C trong 24h rồi lấy ra quan sát.
Các chủng sinh keratinaza được so sánh về khả năng sinh enzim bằng cách nuôi lắc trong môi trường cơ bản chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Các bước thực hiện như sau: Bước 1: Chế tạo keratin thô từ lông gà. - Chọn những lông gà có kích thước tương đối đồng đều. - Ngâm 30 phút ở 370C trong clorofom - metanol (1:1) để loại mỡ. - Giữ trong nước xà phòng 12h ở 420C. - Rửa nước cất vài lần và làm khô ở nhiệt độ phòng. Bước 2: Pha chế môi trường cơ bản kiểm tra hoạt tính enzim (xem phần các loại môi trường nuôi cấy). Chia đều vào các bình nón 150 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường cơ bản. Bước 3: Dùng pipet hút dịch chứa vi khuẩn sinh keratinaza (50 µl) thu được từ bước kiểm tra hoạt tính ở trên cho vào mỗi bình nón tương ứng và đánh số thứ tự. Bước 4: Nuôi lắc, 150 vòng / phút trong 7 ngày. Bước 5: So sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phương pháp Saville (1958): - Lông còn sót lại trong môi trường nuôi cấy được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch với nước cất và sấy khô ở 650C đến khối lượng không đổi. - Tỉ lệ phần trăm của lông bị phân huỷ được tính dựa trên khối lượng của lông còn lại chưa bị phân huỷ so với khối lượng lông ban đầu sử dụng đưa vào môi trường. So sánh tỉ lệ lông gà bị phân huỷ để xác định khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn. Để kiểm tra lại, có thể dùng phương pháp đục giếng thạch, quy trình tiến hành như sau: Sau khi đổ môi trường thạch sữa gầy ra các đĩa Petri, dùng khoan thạch tạo các giếng thạch, đồng thời nhỏ 0,5 ml dịch nuôi vào các giếng thạch tương ứng. Cho vào tủ lạnh giữ ở 40C từ 6 đến 8 giờ, sau đó nhấc ra đặt vào tủ nuôi cấy tại nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Hoạt tính của keratinaza được xác định bằng đường kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm.
Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300 C trong các môi trường có hàm lượng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10, 15, 20, 25 g / l trong môi trường cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hưởng của nồng độ lông trên hoạt động sinh keratinaza (19). 2.2.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300 C trong các môi trường có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trường cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu trên hoạt động sinh keratinaza của chủng. 2.2.4.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trường có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 250C, 300C, 350C, 400C, 450C trong môi trường cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu trên hoạt động sinh keratinaza của chủng đó. 2.2.5. Xác định ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza 2.2.5.1. Xác định hoạt tính keratinaza Trước hết, để thu dịch enzim, có thể tiến hành như sau (30): Các chủng có hoạt tính keratinaza được nuôi lắc ở 300 C, 160 vòng / phút trong môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất: Nuôi trong bình nón 500 ml có chứa 100 ml môi trường cơ bản với 10% lông gà. Sau 5 ngày, dịch lọc được li tâm 10 000 vòng / phút ở 40C trong 30 phút. Thu lấy dịch lọc (dịch enzim thô). Tủa bằng muối amoni sunphat các phân đoạn từ 0 - 80%. Kết tủa thu được sau khi bổ sung muối amoni sunphat và làm lạnh ở 40 C trong 1 giờ được thu lấy sau khi li tâm tiếp (10 000 vòng / phút ở 40C trong 30 phút). Hoà tan kết tủa vào một lượng tối thiểu đệm Tris - HCl (pH = 8), ta được dịch enzim có độ tinh khiết cao hơn được dùng để xác định hoạt tính keratinaza. Hoạt tính của keratinaza được xác định theo phương pháp của Cheng et al. (1995) sửa đổi (10) và được thực hiện lại trong một số nghiên cứu (18,19, 43) khác như sau : 2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nước. Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ . Một đơn vị (U) hoạt động của keratinase được định nghĩa là hoạt tính làm tăng độ hấp thụ lên 0,01 trong 1h ở 370 C. 2.2.5.2. Xác định ảnh hưởng của pH Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza được tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở các pH lần lượt 6, 7, 8, 9, 10, 11 và 1 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nước. Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ. 2.2.5.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza được tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở pH = 8 và 1,0 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở các nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 300 C, 400 C, 500C và 600C trong một cốc nước. Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ. 2.2.5.4. Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại Hỗn hợp gồm: 2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nước. Bổ sung vào hỗn hợp ở mỗi thí nghiệm từng loại ion: Na+, Ca2+, K+, Mg2+, Fe3+, Cu2+ ở các nồng độ 1 mM và 5 mM. Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SỰ PHÂN RÃ CỦA LÔNG GÀ KHI ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM NGUỒN CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập được 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (phụ lục 1). Các chủng sau khi được kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách nuôi lắc trong môi trường phân lập, tuyển chọn giống vi khuẩn có hoạt tính keratinaza nói trên ở 370C, 150 vòng / phút trong 6 ngày, chủng có hoạt tính keratinaza đã làm phân rã lông gà có thể quan sát được bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này đã phân lập được 6 chủng có hoạt tính keratinaza. 
Hình 3.1. Sự phân rã của lông gà sau khi nuôi lắc 6 ngày Những chủng này có thể sinh trưởng, phát triển trên môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Điều đó cho thấy 6 chủng này đều có khả năng tiết keratinaza ngoại bào để phân huỷ lông gà (mà thành phần chính của nó là keratin) làm nguồn cung cấp cacbon và nitơ cho chúng. 3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Sau khi nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng có hoạt tính keratinaza được mô tả như bảng 3.1: Bảng 3.1: Hình thái tế bào các chủng sinh keratinaza
Tiến hành đun dịch nuôi pha loãng của chúng ở 800C trong thời gian 15 phút, để nguội rồi cấy trải trên môi trường NA, ủ ở 370C trong 24h thấy đều mọc thành các khuẩn lạc; chứng tỏ đây là các chủng sinh nội bào tử. Sau khi cấy trải mỗi chủng đã tinh sạch trên môi trường NA và để trong tủ ấm (370C) 24 giờ, hình thái khuẩn lạc quan sát được như sau:
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc chủng Kr2 Từ các thí nghiệm trên có thể nhận định các chủng sinh keratinaza trên đều có một số đặc điểm giống với chi Bacillus. Để phân loại chính xác hơn cần phải tiến hành thêm một số thí nghiệm kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hoá của chúng. 3.3. XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT Từ 6 chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza đã phân lập được, tiến hành mức độ hoạt động của enzim bằng 2 cách sau: - Nuôi lắc trong môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, 150 vòng / phút ở 370C trong 10 ngày. Sau đó, so sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phương pháp Saville (1958). Kết quả được trình bày ở bảng 3.3:
- Đánh giá hoạt tính keratinaza của các chủng bằng cách: Đục giếng thạch có đường kính 10 mm trên các đĩa thạch có cơ chất là sữa gầy; nhỏ 0,15 ml dịch enzim thô vào các giếng thạch; giữ ở 40C trong tủ lạnh 12h rồi mang ra ngoài khoảng 15 phút sau đó đưa vào tủ ấm 370C ủ trong 24h. Hoạt tính của keratinaza được xác định bằng đường kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm. Kết quả như sau: Bảng 3.4: Hoạt tính keratinaza của dịch nuôi 6 chủng sinh keratinaza
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy chủng Kr2 thể hiện hoạt tính keratinaza mạnh nhất. Chủng này được tìm thấy ở mẫu đất A. Trong điều kiện chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, chủng Kr2 thể hiện hoạt tính mạnh nhất; vì vậy, đây là một chủng tự nhiên có thể khai thác để nuôi cấy thu nhận keratinaza, phục vụ cho một số ứng dụng khác như đã trình bày ở phần mở đầu. Các chủng vi sinh vật sinh enzim tự nhiên là nguồn gen quý, là cơ sở dữ liệu được sử dụng để tạo các chủng tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu sản xuất công nghiệp với khả năng sinh enzim cao (1). Do đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu kĩ hơn về ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzim của chủng Kr2 nhằm tìm ra một số điều kiện tối ưu hoá môi trường nuôi cấy.
Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất là Kr2 được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300 C, pH = 7 trong các môi trường có hàm lượng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10, 15, 20, 25 g / l trong môi trường cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải như sau: Bảng 3.5: Ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy
Như vậy, khả năng sinh keratinaza phụ thuộc vào hàm lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy. Kết quả cho thấy, ở nồng độ lông vũ là 20 g/l cho hiệu quả phân giải cao nhất. Ở hàm lượng thấp hơn, hiệu quả phân giải lông vũ cũng thấp hơn. Tuy nhiên, ở hàm lượng cao hơn, hiệu quả phân giải cũng giảm. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cheng et al. (1995) cho rằng hàm lượng lông cao làm tăng độ nhớt của môi trường, có thể dẫn đến hạn chế oxy cho vi khuẩn phát triển. 3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu Chủng Kr2 được nuôi lắc trong môi trường cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300 C trong các môi trường có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trường cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải như sau: Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến khả năng sinh keratinaza
Như vậy, pH tối ưu cho nuôi cấy chủng Kr2 để cho hiệu quả sinh keratinaza phân giải lông vũ cao nhất là khoảng 7 - 8. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với một số báo cáo trước đây về keratinaza mà thuộc về proteaza kiềm (10), cho rằng keratinaza sản xuất bởi các loài vi khuẩn Bacillus hoạt động tích cực nhất trong môi trường trung tính hoặc hơi kiềm. Nó cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới về pH tối ưu cho sinh keratinaza của nhiều chủng vi sinh vật (5, 8, 13, 20). Nhìn chung pH tối ưu thường khoảng từ 7 - 8,5. Ở pH trên 8,5 sẽ ức chế tăng trưởng của nhiều chủng thuộc chi Bacillus (18). Trong nghiên cứu này, pH tối ưu cho sinh keratinaza của chủng Kr2 là khoảng 7 - 8. 3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu Chủng Kr2 được nuôi lắc trong môi trường cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trường có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 250C, 300C, 350C, 400C, 450C trong môi trường cơ bản, dựa vào tỉ lệ lông bị phân giải cho thấy nhiệt độ môi trường nuôi cấy tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza chủng Kr2 là 350C. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy nhiệt độ tối ưu cho khả năng sinh keratinaza của các chủng có hoạt tính này rất khác nhau như: ở Bacillus subtilis KD-N2 nhiệt độ tối ưu là 230C (8), Bacillus pseudofirmus AL-89 là 370C (13), Staphylococcus sp. Là 370C - 400C (20), … Đây là đặc tính sinh lý riêng của mỗi chủng.
Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên ở các pH khác nhau kết quả như sau: 
Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính keratinaza Kết quả ở hình 3.3 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11. Ở vùng pH nhỏ hơn 7, hoạt tính keratinaza bị giảm còn dưới 60%. Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có pH tối ưu cho hoạt động của keratinaza là 9. Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với những mô tả về đặc tính keratinaza của nhiều nghiên cứu trên thế giới, đó là hoạt động tốt trong môi trường kiềm như keratinaza từ Streptomyces albidoflavus K1-02 có hoạt tính cao nhất ở pH = 7,5 (7), keratinaza từ Bacillus licheniformis PWD-1 có hoạt tính cao nhất ở pH = 10 (10), keratinaza từ Bacillus DF1a có hoạt tính cao nhất ở pH = 8 (18),… 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên, kết quả thu được như sau: 
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza Kết quả ở hình 3.5 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30 - 600C. Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của keratinaza là 500C. Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 Kết quả này góp phần khẳng định keratinaza là loại enzim ưa nhiệt giống như các nghiên cứu trước đó của nhiều tác giả trên thế giới; trong đó theo Gupta và cộng sự (2006), nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của các keratinazaằnm trong khoảng 300C - 800C. 3.5.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại Keratinaza thu được từ các chủng sẽ chịu ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính ở các mức độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 như sau: Bảng 9: Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Hoạt tính keratinaza tăng khi có mặt của một số ion như: Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+ , do trong cấu tạo của phân tử keratinaza có mặt của 2 ion Ca2+ ; do vậy, khi có mặt trong môi trường phản ứng, ở nồng độ thấp, chúng có tác dụng hoạt hoá keratinaza (1). Một số ion như: Fe3+, Cu2+ lại làm giảm hoạt tính của keratinaza. KẾT LUẬN 1. Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập được 6 chủng có hoạt tính keratinaza. Các chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà như là nguồn cacbon và nitơ duy nhất. 2. Cả 6 chủng này đều có một số đặc điểm giống chi Bacillus. 3. Keratinaza từ 6 chủng phân lập được đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong khoảng nhiệt độ 30 - 600C. 4. Chủng Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất. pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 500C. 5. Hoạt tính của keratinaza tăng khi trong môi trường phản ứng có mặt của một số ion : Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+ , ở nồng độ 1 mM và 5 mM; và giảm hoạt tính khi trong môi trường phản ứng có mặt một số ion như: Fe3+, Cu2+ . 6. Điều kiện nuôi tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza của chủng Kr2 là môi trường ban đầu có hàm lượng lông là 20 g/l, pH = 7-8, nhiệt độ khoảng 350C. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn sinh keratinaza ứng dụng vào phân huỷ lông gia cầm làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi và một số ứng dụng khác. 2. Ngoài các chủng sinh keratinaza tự nhiên, có thể tiếp tục nghiên cứu tạo các chủng tái tổ hợp sinh keratinaza cao hơn. 3. Nghiên cứu các thông số kĩ thuật cho lên men sinh tổng hợp keratinaza của chủng có khả năng sinh keratinaza cao nhất, tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp: nhiệt độ lên men, pH môi trường, mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng, thời điểm thu hồi keratinaza. 4. Thu nhận và tinh chế keratinaza có độ tinh khiết cao. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Văn Hiếu (2012), Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tái tổ hợp có hoạt tính keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng trong công nghiệp thuộc da, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Bách khoa Hà Nội. 2. Ngô Tự Thành (2001), Sự phân bố, sinh trưởng và sinh tổng hợp proteaza ngoại bào của Bacillus ở vùng Hà Nội, Tạp chí Sinh học, số 23 (3a), tr.153-157. 3. Võ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một số chủng thuộc chi Bacillus, Luận án Tiến sĩ Khoa học, Viện CNSH, Trung tâm KHTN và CNQG, Hà Nội.
10. Cheng SW, Hu HM, Shen SW, Takagi H, Asano M, Tsai YC (1995). Production and characterization of a feather degrading Bacillus licheniformis PWD-1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2239-2243. 11. Draper, C. I., 1944. The nutritive value of corn oil meal and feather proteins. Iowa Agr. Exp. Sta. Res. Bul. 326, Iowa State College, Ames, IA. 12. Friedrich, J.; Gradisar, H.; Mandin. D; Chaumount, J.P. (1994). Screening fungi for synthesis of keratinolytic enzymes. Lett Appl Microbiol., 28, 127-130. 13. El-Refai, H.A.; AbdelNaby, M.A.; Gaballa, A.; El-Araby, M.H.; Fatah, A.F.A. (2005). Improvement of the newly isolated Bacillus pumilus FH9 Keratinolytic activity. Process Biochem., 40, 2325-2332. 14. Geessess, A.; Kaul, R.H.; Gashe, B.A.; Mattiasson, B. (2003). Novel alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather. Enzyme and Microbial Technol., 32, 519-524. 15. Gordon, Ruth E.; William, C.; Haynes, Hor-Nay Pang, C. (1973). The Genus Bacillus: Agriculture Handbook No. 427. ARS-USDA, Washington, D.C 16. Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., & Brandelli, A. (2006). Nutritional improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Science and Technology, 126, 135–144. 17. Gupta, R., & Ramnani, P. (2006). Microbial keratinases and their prospective applications: An overview. Applied Microbiology and Biotechnology, 70,21–33 18. Guvin Govinden , Daneshwar Puchooa. (2012). Isolation and characterization of feather degrading bacteria from Mauritian soil. African Journal of Biotechnology Vol. 11(71), pp. 13591-13600. 19. Hui Ni, Qi - he Chen, Feng Chen, Ming - liang Fu, Ya - chen Dong, Hui - nong Cai (2011). Improved keratinase production for feather degradation by Bacillus lichenifomis ZJUEL 31410 in submerged cultivation. African Journal of Biotechnology vol. 10 (37), pp. 7236 - 7244, 20 July, 2011. 20. Kim, J.M.; Lim, W.J.; Suh, H.J. (2001). Feather-degrading Bacillus species from poultry waste. Process Biochem., 37, 287-291. 21. Langeveld, J. P. M., Wang, J. J., van de Wiel, D. F. M., Shih, G. C.,Garssen, G. J., Bossers, A., et al. (2003). Enzymatic degradation of prion protein in brain stem from infected cattle and sheep. Journal of Infectious Diseases, 188, 1782–1789. 22. Lin, X.; Lee, C.G.; Casale, E.S.; Shih, J.C.H. (1992). Purification and characterization of a keratinase from a feather - degrading Bacillus licheniformis strain. Appl Environ Microbiol., 58, 3271- 3275. 23. Moritz, J.S.; Latshaw, J.D. Indicators of nutritional value of hydrolyzed feather meal. Poultry Sci., 80, 79-86, 2001. 24. Mukhopadhyay, R. P., & Chandra, A. L. (1990). Keratinase of a Streptomycete. Indian. Journal of Experimental Biology, 28,575–577. 25. Noval, J. J., & Nickerson, W. J. (1959). Decomposition of native keratin by Streptomyces fradiae. Journal of Bacteriology, 77,251–263. 26. Onifade, A.A.; Al-Sane, N.A.; Al-Musallam, A.A.; Al-Zarban, S. (1998). Potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources. Biores. Technol., 66, 1-11. 27. Papadopoulos, M.C.; El Boushy, A.R.; Roodbeen, A.E.; Ketelaars, E.H. (1986). Effects of processing time and moisture content on amino acid composition and nitrogen characteristics of feather meal. Animal Feed Sci. Technol., 14, 279-290. 28. Parry DAT, North ACT (1998). Hard-keratin intermediate filament chains: substructure of the N and C-terminal domains and the predicted structure and function of the C-terminal domains of type and type II chains. J. Struct. Biol. 122:67-75. 29. Ramnani P., Singh R., Gupta R, 2005. Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis RG1: structural and biochemical mechanism of feather degradation, Can. J. Microbiol. 51, 191. 30. Rodziewicz, A.; Laba, W. (2008). Biodegradation of feather keratin by Bacillus cereus in pure culture and compost. EJPAU 11(2) #03[ISSN1505-0297]. 31. Sangali, S.; Brandelli, A. (2000). Feather keratin hydrolysis by a Vibrio sp. kr2 strain. J. Appl. Microbiol., 89,735-743. 32. Sarita Agrahari , Neeraj Wadhwa (2010). Degradation of Chicken Feather a Poultry Waste Product by Keratinolytic Bacteria. Isolated from Dumping Site at Ghazipur Poultry Processing Plant. Department of Biotechnology, 62, 482 - 492. 33. Saville, B. (1958). A scheme for colorimetric determination of microgram amount of thiols. Analyst, 83, 670-72. 34. Sidra Aftab, Samia Ahmed , Sadia Saeed , Sheikh Ajaz Rasool (2006). Screening, Isolation and Characterization of Alkaline Protease Producing Bacteria from Soil. Pakistan Journal of Biological Sciences , 9 , 2122 - 2126. 35. Suntornsuk, W.; Suntornsuk, L. (2003). Feather degradation by Bacillus sp. FK 46 in submerged cultivation. Bioresour Technol., 86, 239-243. 36. Steinert, PM, Parry, DAD (1993 ) The conserved H1 domain of the type II keratin 1 chain plays an essential role in the alignment of nearest neighbor molecules in mouse and human keratin 1/keratin 10 intermediate filaments at the two- to four-molecule level of structure. J Biol Chem. 2878–2887 37. Steinert, P. M. (1993). Structure, function, and dynamics of keratin intermediate filaments. Journal of Investigative Dermatology, 100, 729–734. 38. Takami, H.; Nogi, Y.; Horikoshi, K. (1999). Reidentification of the keratinase-producing facultatively alkaliphilic Bacillus sp no AH-101 as Bacillus halodurans. Extremophiles, 3, 293-296. 39. Takiuchi, I.; Higuchi, D.; Sei, Y.; Koga, M. (1982). Isolation of an extracellular proteinase (keratinase) from Microsporum canis. Sabouraudia, 20, 281-288. 40. Wang J.J., Shih J.C.H.(1999). Fermentation production of keratinase from Bacillus licheniformis PWD-1 and a recombinant B. subtilis FSB-29, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22,608 . 41. Wawrzkiewicz, K.; Wolski, T.; Lobarzawski, J. (1991). Screening the keratinolytic activity of dermatophytes in vitro. Mycopathologia, 114, 1-8. 42. Williams, C.M.; Lee, C.G.; Garlich, J.D.; Shih, J.C.H. (1991). Evaluation of a bacterial feather fermentation product, feather lysate, as a feed protein. Poultry Science, 70, 85-94. 43 .Wojciech Łaba, Anna Rodziewicz. (2010). Keratinolytic Potential of Feather-Degrading Bacillus polymyxa and Bacillus cereus.Polish J. of Environ. Stud. Vol. 19, No. 2 (2010), 371-378. 44. Yamamura, S., Morita, Y., Hasan, Q., Yokoyama, K., & Tamiya, E. (2002). Keratin degradation: A cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Biochemical and Biophysical Research Communications, 294, 1138–1143. 45. Yu, R.J.; Harmon, S.R.; Grappel, S.F.; Blank, F. (1971). Two cell-bound keratinases of Trichophyton mentagrophytes. J. Invest. Dermatol., 55, 27-32. PHỤ LỤC 1 Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập được 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc như sau:
Keratin trong bảng này được phân loại trong hai cột đầu tiên theo danh pháp được thành lập vào năm 2006 . Tên gọi khác trước đây được sử dụng được liệt kê trong cột 3 và 4. I. Keratin nhóm I * Keratin biểu mô của người
* Keratin trong lông, tóc người
* Keratin không có ở người
* Pseudogene keratin ở người
II. Keratin nhóm II * Keratin biểu mô của người
* Keratin trong lông, tóc người
* Pseudogene keratin ở người
Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 389.84 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||