Microsoft Word tcsh14-027-Nguyen Duc Thanh Dzung edited doc
Công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai (Next-
tải về 0.52 Mb. Chế độ xem pdf
|
| Công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai (Next-
Generation of Sequencing Technology) Sự phát triển các công nghệ giải trình tự số lượng lớn (high throughput sequencing) đã làm cho việc giải trình tự DNA trở nên đặc biệt quan trọng cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền, tiến hóa, bảo tồn sinh học và chọn giống. Các công nghệ này có tiềm năng loại bỏ một trong các trở ngại đối với thực hiện tiếp cận hệ gen trong các cơ thể không phải là mô hình bao gồm các cơ thể thiếu thông tin về trình tự genome. Các công nghệ này tránh được sự tốn kém, phức tạp và sai lệch ở phương pháp giải trình tự dựa vào nhân dòng bằng nhân bản trực tiếp từ DNA khuôn [17, 113]. Công nghệ giải trình tự thế hệ thứ hai (hay còn được coi là công nghệ giải trình tự số lượng lớn) gồm ba nhóm chính là giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp, giải trình tự bằng phương pháp gắn và giải trình tự phân tử đơn.
giống như kỹ thuật giải trình tự của Sanger tức là xác định thành phần nucleotide bằng phát hiện tín hiệu quang hóa trong quá trình gắn các nucleotide vào sợi DNA bổ trợ bằng enzyme DNA polymerase. Trong kỹ thuật Sanger, sự kết thúc chuỗi dideoxynucleotide được dùng để xác định trình tự, còn trong giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp thì DNA được cắt thành nhiều phân đoạn rồi gắn với chuỗi tiếp hợp sau đó nhân dòng để tăng tín hiệu huỳnh quang hoặc tín hiệu hóa học. Có ba hệ thống giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp. Ba hệ thống này khác nhau về độ dài đọc, về phương pháp nhân dòng và cố định, bao gồm: hệ thống 454 của Roche, Solexa của Illumia và SOLiD của Applied Biosystem. Hệ thống Roche 454 giải trình tự bằng phương pháp dựa trên nguyên tắc tổng hợp cao nhiệt (pyrosequencing), sợi đơn DNA khuôn được gắn vào hạt siêu nhỏ (microbead) và nhân bản bằng PCR nhũ tương (emulsion PCR) [112]. PCR nhũ tương là phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp phản ứng PCR thông thường và hỗn hợp phản ứng PCR dạng nhũ tương nước trong dầu [158]. Hệ thống Roche 454 đầu tiên chỉ đọc được đoạn 100 bp, hiện nay do cải tiến có thể đọc đoạn đến 800 bp. Hệ thống Illumina của Solexa giải trình tự dựa vào việc đơn giản hóa phương pháp xây dựng thư viện và đảo đầu bằng phương pháp huỳnh quang dẫn đến việc tạo ra các đoạn đọc có độ dài 35 bp [17]. Hệ thống này sử dụng việc nhân bản cầu pha cứng (solid-phase bridge amplification), trong đó các đoạn tiếp hợp đầu 5’ và 3’ được gắn với mỗi đầu của khuôn DNA. Một đầu của khuôn sau đó được đính với cơ chất. Các đoạn tiếp hợp được lai với các mồi xuôi hoặc ngược cố định tạo thành cầu nối, tạo thuận lợi cho việc nhân bản để tạo ra các sản phẩm nhân bản được đính với cơ chất và tạo
Các kỹ thuật chỉ thị DNA
281 thành các nhóm khuôn giống nhau do đó làm tăng cường sự phát hiện bằng quang hóa. Với hệ thống HiSeq 2000 có thể tạo khoảng 6 tỷ đoạn đọc cho 540 đến 600 Gb trong 11 ngày (http://www.illumina.com). Hệ
thống Ion
Torrent (http://www.iontorrent.com) là hệ thống giải trình tự thế hệ thứ hai duy nhất xác định trình tự không dựa vào các chất huỳnh quang mà dựa vào việc đo sự thay đổi pH do việc giải phóng H + khi gắn nucleotide bằng công nghệ bán dẫn (semiconductor) [154]. Bằng việc bổ sung liên tục các nucleotide, máy có thể nhận biết nucleotide nào được gắn vào sợi đang kéo dài. Giải trình tự bằng phương pháp gắn là giải trình tự bằng tổng hợp có sử dụng DNA polymerase làm phương tiện kéo dài trong quá trình xác định trình tự DNA. Giải tự bằng phương pháp gắn khai thác sự mẫn cảm của DNA ligase với sự bắt cặp sai (mismatch) để xác định trình tự DNA. Phương pháp này sử dụng các oligonucleotide dò có kích thước khác nhau và được đánh dấu bằng chất huỳnh quang ở nucleotide cần xác định, các phân đoạn DNA khuôn được mồi với các chuỗi neo ngắn đã biết để tạo điều kiện cho sự lai với các đoạn dò. DNA ligase được bổ sung vào phản ứng để nối các đoạn dò được đánh dấu huỳnh quang với mồi và khuôn. Hình ảnh huỳnh quang được thiết lập để xác định đoạn dò nào được gắn. Quá trình này được lặp lại với việc sử dụng các bộ dò khác nhau cho các DNA khuôn nghiên cứu để xác định trình tự nucleotide. Hệ thống giải trình tự hỗ trợ gắn và phát hiện oligonucleotide (Supported Oligonucleotide Ligation and
Detection-SOLiD) của
Life Technologies/Applied Biosystems (http:// www.appliedbiosystems.com) giải trình tự bằng phương pháp gắn có thể tạo ra chuỗi DNA 0,1 đến 4 Gb trong một đến bảy ngày với giá thành trong khoảng 3400 đến 8500 Đô-la Mỹ. Giải trình tự phân tử đơn còn gọi là giải trình tự thế hệ thứ ba (third-generation sequencing). Phương pháp này tạo ra các tín hiệu nhận biết sự gắn nucleotide bằng quang hóa trong quá trình giải trình tự từ phân tử nucleic acid đơn. Vì thế có thể loại bỏ việc nhân bản khuôn. Điều này làm cho giải trình tự phân tử đơn có nhiều lợi thế so với giải trình tự thế hệ thứ hai. Đặc biệt là việc đơn giản hóa sự chuẩn bị mẫu và có thể sử dụng DNA kém chất lượng hoặc có nồng độ thấp, đồng thời tránh được các lỗi trong quá trình nhân bản khuôn bằng PCR. Phương pháp này cũng sử dụng việc giải trình tự trực tiếp RNA nên loại bỏ được các sai lệch trong nhân bản cDNA. Hiện nay, đã có hai thiết bị giải trình tự theo phương pháp giải trình tự phân tử đơn đó là Helicos - Helicos Genetic Analysis System (http://www.helicosbio.com) và PacBio RS SMS của Pacific BioSciences (http://www.pacificbiosciences.com). Do sự khác nhau về độ dài đoạn đọc, mục đích của từng công nghệ giải trình tự là khác nhau. Với đoạn đọc ngắn và giá thành thấp của Solexa và SOliD thì hai công nghệ này phù hợp cho giải trình tự toàn bộ hệ gen, trong đó trình tự genome mới có thể lắp ráp và so sánh với trình tự tham chiếu (trình tự genome của loài đang tồn tại). Công nghệ giải trình tự Roche 454 với chuỗi đọc dài (có thể tới 800 bp) cũng có thể sử dụng để nhìn được tổng thể bước đầu về hệ gen và hệ sao chép của loài. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới được sử dụng trong nghiên cứu mã vạch DNA thế hệ mới-next-geneation DNA bacoding [81, 161], trong xác định đột biến [19], trong nghiên cứu phân loại và phát sinh loài [41, 164], trong nghiên cứu biến đổi hệ gen và phiên mã ở cơ thể đa bội [72] và trong phát triển chỉ thị DNA như SNP và SSR [9, 209].
tải về 0.52 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|