Xã hội loài người ngày càng phát triển, cùng với nó là sự bùng nổ của các đại dịch mà nổi bật nhất là lao, hiv và sốt rét. Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới



tải về 460.58 Kb.
trang6/8
Chuyển đổi dữ liệu26.08.2017
Kích460.58 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8

2.3.3.3. Điện di


Điện di DNA là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được các phân tử DNA bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel Agarose.

Sản phẩm DNA được điện di trên gel Agarose sẽ tạo thành các giải băng khác nhau. DNA mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc DNA, nồng độ Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di.

Dựa vào kích thước từng đoạn gel được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose, chúng tôi sử dụng kỹ thuật điện di trên gel Agarose 1,2% nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các băng khi được điện di cùng thang DNA chuẩn.

- Chuẩn bị gel Agarose 1,2%:

+ Pha 1,2g agarose trong TBE 0,5X và đựng trong bình chịu nhiệt.

+ Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn.

+ Để nguội đến 70oC, đổ gel vào khay đã được cài răng lược.

+ Rút răng lược ra sau khi gel đã đông lại (khoảng 30 phút).

- Quá trình diện di và kiểm tra sản phẩn PCR:

+Gel được đặt nằm ngang trong buồng điện di có chứa dung dịch đệm .

+ Điện di thực hiện theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110 V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 45 phút.

+ Các axit nucleic trong gel được nhuộm bằng Red safe.

+ Sau khi nhuộm gel được quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel Dolphin-DOC [6, 12, 13, 14, 15].



    1. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các số liệu được thu thập phân tích và xử lý theo các phương pháp thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN CÁC CHỦNG LAO Ở VIỆT NAM

3.1.1. Kết quả tách chiết DNA

Trong nghiên cứu sinh học phân tử tách chiết DNA là một kĩ thuật rất quan trọng. Độ tinh sạch, nồng độ DNA và sự bảo đảm không có hiện tượng nhiễm chéo sẽ quyết định đến kết quả của nghiên cứu. Trong quá trình tách chiết DNA chúng tôi luôn tách kèm mẫu vi khuẩn không phải lao nhằm kiểm soát hiện tượng nhiễm chéo. Các mẫu DNA này sẽ được sử dụng làm đối chứng âm trong các phản ứng multiplex PCR và PCR .



Các mẫu DNA sau khi tách chiết được kiểm tra độ tinh sạch bằng thiết bị máy đo quang phổ. Đo độ hấp thu quang phổ của DNA ở bước sóng 260nm và của protein ở bước sóng 280nm. Nồng độ của DNA được tính bằng độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 260nm, độ tinh sạch được đánh giá bằng tỷ số hấp thu OD260nm/OD280nm. DNA thu được có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8 - 2,0 được coi là tinh sạch, không lẫn protein và các tạp chất khác [6, 26, 37]. DNA tổng số này đảm bảo để sử dụng làm panel mẫu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.


Bảng 3.1. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao

của Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung Ương


Stt

Mẫu

OD

Nồng độ ng/µl

Stt

Mẫu

OD

Nồng độ ng/µl

1

TB02-35

1,61

68,9

6

TB02-40

2,08

6,5

2

TB02-36

1,62

54,6

7

TB02-41

1,74

23,9

3

TB02-37

2,29

8,3

8

TB02-42

1,94

11,2

4

TB02-38

1,66

37,8

9

TB02-43

1,70

29,7

5

TB02-39

1,85

18,8

10

TB02-44

1,79

9,8



Bảng 3.2. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao

của Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Huế

Stt

Mẫu

OD

Nồng độ ng/µl

Stt

Mẫu

OD

Nồng độ ng/µl

1

TB05-100

1,55

20,7

6

TB05-105

1,65

30,3

2

TB05-101

1,92

27,8

7

TB05-106

1,82

91,8

3

TB05-102

1,78

20,5

8

TB05-107

1,89

86,1

4

TB05-103

1,85

16,5

9

TB05-108

1,69

49,2

5

TB05-104

1,85

17,8

10

TB05-109

1,71

39,5


Bảng 3.3. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao

của Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch

Stt

Mẫu

OD

Nồng độ ng/µl

Stt

Mẫu

OD

Nồng độ ng/µl

1

TB06-40

1,57

26,7

6

TB06-45

1,55

12,3

2

TB06-41

1,73

36,8

7

TB06-46

1,87

138,6

3

TB06-42

1,88

318,9

8

TB06-47

1,84

180,4

4

TB06-43

1,76

37,7

9

TB06-48

1,84

155,4

5

TB06-44

1,83

24,5

10

TB06-49

1,86

40,1

3.1.2. Kết quả phát hiện các gen đích đặc trưng của vi khuẩn lao

Chúng tôi tiến hành kiểm tra 750 mẫu DNA được tách từ 750 chủng vi khuẩn lao do Bệnh viện Lao và bệnh Phổi Trung ương, Bệnh viện Trung ương Huế và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch thành phố Hồ Chí Minh cung cấp bằng kĩ thuật multiplex PCR. Với các mẫu sau khi được kiểm tra bằng phản ứng multiplex PCR có hiện tượng khuyết gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA chúng tôi tiến hành kiểm tra lại các mẫu này bằng phản ứng PCR đơn mồi, phản ứng PCR sẽ được chạy cùng đối chứng dương là mẫu DNA của vi khuẩn lao có xuất hiện cả 3 băng đặc trưng cho IS6110, IS1081 và 23S rDNA và mẫu đối chứng âm là mẫu DNA của vi khuẩn không phải lao.



3.1.2.1. Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao phía Bắc

Chúng tôi tiến hành chạy multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên 200 chủng của bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương. Các chủng này được thu thập từ các bệnh nhân ở khu vực Bắc bộ của Việt Nam. Do vậy kết quả khảo sát trên 200 chủng này có thể đại diện cho kết quả khảo sát trên miền Bắc. Kết quả multiplex PCR được điện di trên gel agarose 1,2 % như sau:




M: marker 100 bp


300 IS1081

249 IS6110

118 23S rDNA


M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (+)

(-): chứng âm

(+): chứng dương

Mẫu 1 đến mẫu 14 tương ứng TB02-1 đến TB02-14


Hình 3.1. Kết quả phát hiện 3 gen đích đặc trưng

trên một số chủng lao Miền Bắc

Kết quả trên cho thấy khi kiểm tra bằng multiplex PCR trên 200 mẫu DNA của chủng vi khuẩn lao ở miền Bắc thì thấy ở tất cả các mẫu đều xuất hiện cả 3 băng đặc hiệu cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA.

Kết quả trên được thống kê trong bảng sau:

Bảng 3.4. Kết quả phát hiện gen đích đặc trưng ở các chủng lao miền Bắc

Tổng số mẫu

Tổng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng mPCR

Gen đích IS6110

Gen đích IS1081

Gen đích 23S rDNA

Xuất hiện

Khuyết

Xuất hiện

Khuyết

Xuất hiện

Khuyết

200

200

0

(0%)


200

0

(0%)


200

0

(0%)

Kết quả kiểm tra trên 200 mẫu lao ở bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương được coi như kết quả khảo sát trên miền Bắc. Hiện tại chưa phát hiện hiện tượng khuyết các gen đích đặc trưng là IS6110, IS1081 và 23S rDNA ở các chủng lao phân lập ở miền Bắc.

3.1.2.2. Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao ở miền Trung

Chúng tôi tiến hành kiểm tra hiện tượng khuyết gen đích bằng multiplex PCR trên 300 mẫu lao của bệnh viện Lao Trung ương Huế. Các chủng lao này được thu thập từ các bệnh nhân khu vực miền Trung Việt Nam. Như vậy có thể coi kết quả khảo sát trên 300 mẫu chủng của bệnh viện này đại diện cho kết quả khảo sát ở Miền Trung Việt Nam.



  • Mẫu có hiện tượng khuyết IS6110: Kết quả sau khi chạy phản ứng multiplex PCR để phát hiện các gen đích đặc trưng được điện di trên gel agarose 1,2% có xuất hiện một số mẫu khuyết thiếu gen đích đặc trưng IS6110.


M: marker 100 bp


IS 1081 300

IS6110 249

23S rDNA 118


(-) Mẫu khuyết IS6110 (+) M

(-) TB05-161 TB05-166 (+) M (+) M


300

249

118


(-): chứng âm

(+): chứng dương

TB05-161 và TB05-166: chủng khuyết IS6110


Hình 3.2. Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao ở miền Trung

Kiểm tra trên tất cả 300 chủng của bệnh viện Lao Trung ương Huế cho thấy có 9 mẫu DNA không xuất hiện băng đặc trưng cho gen đích IS6110 là các mẫu: TB05-64, TB05-131, TB05-148, TB05-149, TB05-161, TB05-166, TB05-190, TB05-209, TB05-240.

Chúng tôi tập hợp lại trong một bản gel sau:


M: marker 100bp

(-): chứng âm
(+): chứng dương


300 IS1081

249 IS6110

118 23S rDNA


(-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (+) M

Mẫu 1 đến mẫu 09 tương ứng với các mẫu: TB05-64, TB05-131, TB05-148, TB05-149, TB05-161, TB05-166, TB05-190, TB05-209, TB05-240


Hình 3.3. Kết quả phát hiện khuyết gen IS6110 trên các chủng lao ở miền Trung
Với kết quả như trên chúng tôi tiến hành kiểm tra lại các mẫu này bằng PCR với mồi IS6110. Cùng chạy với 9 mẫu này chúng tôi còn chạy kèm mẫu đối chứng âm là DNA của vi khuẩn không phải lao được tách cùng để tránh hiện tượng nhiễm chéo. Đối chứng dương là DNA của chủng vi khuẩn lao đã được kiểm tra có đủ ba gen đích đặc trưng là IS6110, IS1081 và 23S rDNA để đảm bảo chất lượng của phản ứng PCR. Kết quả cho hình ảnh điện di như hình sau:

M: marker 100bp

(-): chứng âm
(+): chứng dương

300 IS1081

249 IS6110

118 23S rDNA



(-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (+) M

Mẫu 1 đến mẫu 09 tương ứng với các mẫu: TB05-64, TB05-131, TB05-148, TB05-149, TB05-161, TB05-166, TB05-190, TB05-209, TB05-240

Hình 3.4. Kết quả kiểm tra bằng PCR đơn

với 9 mẫu nghi khuyết IS6110 tại miền Trung

Kết quả điện di cho thấy cả 9 mẫu nghi khuyết IS6110 sau khi chạy đơn mồi IS6110 đều không xuất hiện băng đặc trưng cho IS6110. Mẫu đối chứng âm không xuất hiện băng nào. Mẫu đối chứng dương xuất hiện một băng đặc trưng cho IS6110. Như vậy chất lượng của mix và kĩ thuật thao tác được đảm bảo.




  • Mẫu có hiện tượng khuyết IS1081:

Khi kiểm tra 300 mẫu DNA của miền Trung chúng tôi còn phát hiện 1 mẫu không xuất hiện băng đặc trưng cho IS1081 là: TB05-121


M: marker 100bp
IS1081 300

IS 6110 249

23S rDNA 118


(-) TB05-121 (+) M


(-): chứng âm

(+): chứng dương

Mẫu TB05- 121: mẫu khuyết IS1081


Hình 3.5. Kết quả phát hiện mẫu khuyết IS1081 ở miền Trung
Chúng tôi tiến hành kiểm tra lại 1 mẫu này bằng phản ứng PCR với một mồi duy nhất là IS1081. Kết quả điện di cho thấy mẫu nghi khuyết IS1081 sau khi được kiểm tra bằng PCR đơn mồi không cho băng đặc trưng cho gen đích IS1081. Mẫu đối chứng âm không xuất hiện băng đặc hiệu. Mẫu đối chứng dương chạy kèm xuất hiện một băng đặc trưng cho IS1081.


M: marker 100bp



300

249

118


(-) TB05-121 (+) M


(-): chứng âm

(+): chứng dương

TB05-121: mẫu khuyết IS1081


Hình 3.6. Kết quả kiểm tra bằng PCR

với 1mẫu khuyết IS1081 tại miền Trung

Như vậy khi kiểm tra 300 mẫu chủng vi khuẩn lao ở miền Trung chúng tôi phát hiện ra có một mẫu khuyết IS1081.



  • Mẫu có hiện tượng khuyết 23S rDNA:

Chúng tôi cũng phát hiện một mẫu không xuất hiện băng đặc trưng cho 23S rDNA là mẫu TB05-113


M: marker100bp



300

249

118


(-) TB05-113 (+) M



Hình 3.7. Kết quả phát hiện mẫu khuyết 23S rDNA ở miền Trung
Chúng tôi tiến hành kiểm tra lại 1 mẫu này bằng phản ứng PCR với một mồi duy nhất là 23S rDNA. Kết quả điện di cho thấy mẫu nghi khuyết 23S rDNA sau khi được kiểm tra bằng PCR đơn mồi không cho băng đặc trưng cho gen đích 23S rDNA. Mẫu đối chứng âm không xuất hiện băng đặc hiệu. Mẫu đối chứng dương chạy kèm xuất hiện một băng đặc trưng cho 23S rDNA.


M: marker 100bp

300

249

118


(-) TB05-113 (+) M


(-): chứng âm

(+): chứng dương

TB05-113: mẫu khuyết 23S rDNA 100bp

300

249

118


Hình 3.8. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 1mẫu khuyết 23S rDNA tại miền Trung

Kết quả kiểm tra trên 300 mẫu DNA được thống kê trong bảng sau:


Bảng 3.5. Kết quả phát hiện gen đích ở miền Trung

Tổng số mẫu

Tổng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng mPCR

Gen đích IS6110

Gen đích IS1081

Gen đích 23S rDNA


Xuất hiện

Khuyết

Xuất hiện

Khuyết

Xuất hiện

Khuyết

300

291

9 (3%)

299

1 (0,33%)

299

1 (0,33%)

Kết quả trên cho thấy ở 300 mẫu DNA của miền Trung có xuất hiện 9 mẫu không có băng đặc trưng cho gen đích IS6110, 1 mẫu không có băng đặc trưng cho gen đích IS1081 và 1 mẫu không có băng đặc trưng cho 23S rDNA. Tỷ lệ khuyết các gen đích đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA lần lượt là: 3%, 0,33% và 0,33%.




3.1.2.3. Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao ở miền Nam

Chúng tôi tiến hành kiểm tra 250 mẫu lao của bệnh viện Phạm Ngọc Thạch bằng phản ứng multiplex PCR. Các chủng lao của bệnh viện Phạm Ngọc Thạch được thu thập từ các bệnh nhân khu vực miền Nam Việt Nam, do vậy kết quả khảo sát trên các mẫu của bệnh viện này có thể đại diện cho kết quả kảo sát của miền Nam Việt Nam. Kết quả của multiplex PCR sau khi điện di cho thấy tất cả các mẫu đều lên băng đặc trưng cho IS1081 và 23S rDNA. Phát hiện có 3 mẫu không xuất hiện băng đặc trưng cho IS6110 là TB06-220, TB06-246, TB06- 247. Chúng tôi tập trung 3 mẫu này trong 1 bản gel.





: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


1   2   3   4   5   6   7   8


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương