Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.3.3. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu

Vi khuẩn lao sau khi được phân lập và tăng sinh được tiến hành tách chiết thu DNA tổng số. Tách chiết DNA tổng số gồm các bước sau:

Bước 1: Votex kĩ tube chứa chủng vi khuẩn lao, lấy 200 µl vào tube eppendorf, bất hoạt ở 80^oC trong 20 phút rồi để nguội ở nhiệt độ phòng [33, 34, 38].

Bước 2: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút, thu cặn lắng chứa khuẩn lạc, bỏ nước nổi.

Bước 3: Bổ sung 500µl lysis buffer và 12µl lysozyme 25mg/ml (nồng độ cuối cùng đạt 500µg/ml), vortex kĩ rồi ủ trong nước đá 30 phút.

Bước 4: Bổ sung 3 µl proteinase K (nồng độ cuối 100µg/ml), lắc kỹ bằng pipetting.

Bước 5: Ủ 56^oC trong bể ổn nhiệt có lắc 900rpm trong 3h (hoặc qua đêm).

Bước 6: Thêm 550µl Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 1/1 với lysis bufer), vortex kỹ.

Bước 7: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút.

Bước 8: Chuẩn bị trước 1 tube eppendorf có chứa 1300 µl Ethanol 100% + 50µl NaAC 3M, (trường hợp cồn 95% cần 2 tube loại 2ml, mỗi tube chứa 775µ cồn 95% +25µl NaAC 3M) trộn đều, đặt trong khay nước đá (nồng độ cuối cùng của cồn ít nhất 70%).

Bước 9: Hút lấy phần dịch nổi ở phía trên ở cuối bước 7 (tránh hút lớp ngăn cách giữa 2 pha dịch) cho vào tube chứa sẵn cồn và NaAC đã chuẩn bị ở bước 8 (trường hợp cồn 95% cần chia đều dịch nổi vào 2 tube đó), lắc đảo ngược vài lần.

Bước 10: Ủ - 20^oC trong 3 giờ hoặc qua đêm.

Bước 11: Ly tâm 13000g/phút trong 30 phút.

Bước 12: Hút nước nổi, giữ lại phần cặn (không hút kiệt để tránh mất DNA).

Bước 13: Thêm 1000µl cồn 70%, lắc ngược vài lần.

Bước 14: Ly tâm 13000g/phút trong 20 phút, bỏ nước nổi lấy cặn (để lại khoảng 20µl tránh mất DNA).

Bước 15: Ly tâm 13000g/phút trong 15 phút, bỏ nước nổi cẩn thận bằng pipet 20µl, giữ phần cặn có DNA.

Bước 16: Làm khô hoàn toàn, thêm vào 200µl nước khử ion, lắc trộn bằng tay, chia ra 02 tube (nếu đã chia 02 tube ở bước 8 thì cho vào mỗi tube 100µl nước khử ion) ghi mã số chủng kèm số (1) và số (2), đo nồng độ OD. Ủ -4^o C qua đêm, sau đó bảo quản tube số (2) ở -80^oC, tube số (1) dùng ngay hoặc để ở -20^oC.

2.3.3.2. Kĩ thuật PCR và multiplex PCR

Phản ứng PCR và multiplex PCR là một chuỗi chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước được thực hiện trên máy luân nhiệt 9700 và iCycler.

Bước 1: Phân tử DNA khuôn được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử (95^oC) trong vòng 30 giây đến 90 giây. Đây là giai đoạn biến tính (Denaturation).

Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 50 đến 70^oC phụ thuộc Tm của mồi sử dụng và thời gian kéo dài từ 30 đến 1 phút 30 giây. Đây là giai đoạn lai (Anealing). Để tìm nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi và cho cả 3 cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR chúng tôi sử dụng phương pháp gradient nhiệt.

Bước 3: Nhiệt độ tăng lên đến 72^oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại và đặc tính của DNA Polymerase. Đây là giai đoạn tổng hợp (Extension). Đối với nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng multiplex PCR đã được tác giả Nguyễn Thái Sơn và cộng sự thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân Y tối ưu vào năm 2007 [12, 13].

Bảng 2.4. Chu kì nhiệt cho phản ứng multiplex PCR

Bước	Phản ứng	Nhiệt độ	Thời gian	Chu kì
1	Biến tính chung	95	5 phút	1
2	Biến tính	95	45 giây	40
3	Gắn mồi	60,7	45 giây
4	Kéo dài chuỗi	72	45 phút
5	Hoàn tất kéo dài	72	10 phút	1
6	Kết thúc phản ứng	4	∞

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng

Stt	Thành phần	Nồng độ	Thể tích (µl)
1	H2O		8,35
2	Buffer		2,5
3	dNTPs (2,5 mM)	2,5mM	5
4	MgCl­­2 (25 mM)	2,5mM	3
5	Primer 23S – F (25pmoles/µl)	0,8 µM	0,5
6	Primer 23S – R (25pmoles/µl)	0,8 µM	0,5
7	Primer IS6110 – F (25pmoles/µl)	0,4 µM	0,5
8	Primer IS6110 – R (25pmoles/µl)	0,4 µM	0,5
9	Primer IS1081 – F (25pmoles/µl)	0,6 µM	0,5
10	Primer IS1081 – R (25pmoles/µl)	0,6 µM	0,5
11	Taq DNA polymerase	0,5 unit	0,15
12	DNA template		3
Tổng			25

Các thành phần của phản ứng ở các mẫu đều giống nhau chúng chỉ khác khác nhau về DNA template. Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di trên gel Agarose 1,2% để phân tích kích thước các gen đích cần nghiên cứu. Dưới đây là thành phần cho phản ứng PCR chúng tôi sử dụng để kiểm tra lại các mẫu khuyết gen đích:

• 
  Kiểm tra các mẫu khuyết IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam bằng phản ứng PCR
  

Các chủng lao nghi khuyết các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA được kiểm tra lại bằng phản ứng PCR đơn mồi. Với các mẫu nghi khuyết IS6110 chúng tôi sẽ kiểm tra lại bằng phản ứng PCR với mồi IS6110.

Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 như sau:

Bảng 2.6. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110

Stt	Thành phần	Nồng độ	Thể tích (µl)
1	H2O		10,35
2	Buffer		2,5
3	dNTPs	2,5mM	5
4	MgCl­­2	2,5mM	3
7	Primer IS6110 – F (25pmoles/µl)	0,4 µM	0,5
8	Primer IS6110 – R (25pmoles/µl)	0,4 µM	0,5
11	Taq DNA polymerase	0,5 unit	0,15
12	DNA template		3
Tổng			25

Tương tự với các mẫu nghi khuyết IS1081 sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi IS1081. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS1081 như sau:


Bảng 2.7. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110

Stt	Thành phần	Nồng độ	Thể tích (µl)
1	H2O		10,35
2	Buffer		2,5
3	dNTPs	2,5mM	5
4	MgCl­­2	2,5mM	3
7	Primer IS1081 – F (25pmoles/µl)	0,6 µM	0,5
8	Primer IS1081 – R (25pmoles/µl)	0,6 µM	0,5
11	Taq DNA polymerase	0,5 unit	0,15
12	DNA template		3
Tổng			25

Với các mẫu nghi khuyết 23S rDNA được kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi 23S rDNA.

Bảng 2.8. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi 23S rDNA

Stt	Thành phần	Nồng độ	Thể tích (µl)
1	H2O		10,35
2	Buffer		2,5
3	dNTPs	2,5mM	5
4	MgCl­­2	2,5mM	3
7	Primer 23S rDNA – F (25pmoles/µl)	0,8µM	0,5
8	Primer 23S rDNA – R (25pmoles/µl)	0,8µM	0,5
11	Taq DNA polymerase	0,5 unit	0,15
12	DNA template		3
Tổng			25

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 460.58 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: