Xã hội loài người ngày càng phát triển, cùng với nó là sự bùng nổ của các đại dịch mà nổi bật nhất là lao, hiv và sốt rét. Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới


Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU



tải về 460.58 Kb.
trang4/8
Chuyển đổi dữ liệu26.08.2017
Kích460.58 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU



2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các mẫu chủng vi khuẩn lao M. Tuberculosis được thu thập từ 3 bệnh viện ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam.

Miền Bắc: Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TƯ – Kí hiệu chủng TB02

Miền Trung: Bệnh viện Đa Khoa TW Huế - Kí hiệu chủng TB05

Miền Nam: Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch – Kí hiệu chủng TB06

Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường Lowenstein rồi tách chiết thu DNA sử dụng trong quá trình nghiên cứu.


2.1.2. Cỡ mẫu nghiên cứu


Cỡ mẫu được tính theo công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của WHO cho các nghiên cứu dịch tễ học [54]

n = Z2­1-/2 P (1-P)/ d2

Trong đó :

Z1- /2 = 1,96 (với độ tin cậy = 95%)

P : Tỉ lệ ước đoán trong quần thể (tỷ lệ ước đoán khuyết gen đích IS6110 ở Việt Nam là 5 % theo các nghiên cứu trong nước công bố).

d : Độ dao động của tỉ lệ phát hiện không quá 5% so với tỷ lệ thực

n : Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được

Căn cứ công thức trên, chọn d = 2% thì cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là n = 456, thực tế đã thu thập 750 chủng vi khuẩn lao ở cả 3 miền.

Cách lấy mẫu: Thu thập ngẫu nhiên chủng vi khuẩn phân lập được trong khoản thời gian thuộc giai đoạn 2007-2010 tại các điểm nghiên cứu.



2.2. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược – Học viện Quân Y.



      1. Các hóa chất và thiết bị

Các hóa chất và thiết bị chính phục vụ cho nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1 và 2.2

Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chất chính

Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA




PBS

Rectopur(CE- EMB)

Tris – Base

Applied BioSiciences (Mỹ)

Protease K

Sigma (Mỹ)

Lyzozyme

Fermentas

Các dung môi hữu cơ

Gibco BRL Life technology

Ethanol

Wako (Japan)

Natri acetate

Wako (Japan)

Phenol/Chloroform/Isomyl

Wako (Japan)

  1. 2. Hóa chất trong PCR




Taq buffer

Fermentas

Primers

Bioneer

MgCl2

Fermentas

Taq DNA polymerase

Fermentas

DNTPs

Fermentas

  1. 3. Hóa chất trong điện di và soi gel

Fermentas

Agarose

Fermentas

Thang chuẩn DNA

Fermentas

Loading Dye

Fermentas

Red safe

Sigma (Mỹ)


Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính


Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Máy PCR iCyler (Gradient nhiệt)

Bio-Rad

Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700)

Appiled BioSystems

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Heraeus

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Thomas Scientific

Máy làm khô chân không

Eppendorf

Máy chụp ảnh Gel – Doc

Dolphin

Tủ lạnh 0oC, 4oC, -20oC; -80oC

Nuaire

Lò vi song

Sanyo

Cân điện tử (Electronic balances)

Adam

Pippetman

Gilson, Haminlton, Bio-Rad

Vortex

OSI Rotolab

Bể ổn nhiệt

Memmert

Khối ổn nhiệt có lắc

Eppendorf

Máy lắc Gyromax 737R

Amerex Instrument

Bộ điện di DNA

Labnet

Tủ cấy an toàn sinh học

Nuaire

Tủ ấm

Shelab



2.2.2. Các cặp mồi được sử dụng trong phát hiện gen đích

Trình tự các cặp mồi IS 6110 và 23S rDNA được tham khảo từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới. Cặp mồi IS 6110F/IS 6110R khuếch đại gen đích nằm trong trình tự chèn IS 6110 có độ dài 249 bp. Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự đã cho thấy gen đích 23S rDNA có ở tất cả các chủng lao gây bệnh [41]. Chúng tôi đã tham khảo, kiểm tra và lựa chọn cặp mồi khuếch đại ADN có độ dài 118 bp nằm trong gen 23S rDNA mã hoá cho tiểu phần 23S của rRNA.

Theo các tác giả Ấn Độ và trên thế giới đã chứng minh trình tự IS 1081 cũng có giá trị rất lớn trong chẩn đoán phát hiện M. tuberculosis complex và khắc phục vấn đề thiếu gen đích IS 6110 ở một số chủng lao ở Ấn Độ, Đông Nam châu Á và Việt Nam [20,40, 43], do vậy chúng tôi sử dụng cặp mồi IS 1081F/IS 1081R để khuếch đại gen đích thuộc trình tự chèn IS 1081 có độ dài 300bp.
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Gen đích

Mồi

Trình tự

Sản phẩm (bp)

Nguồn

23S rDNA

23S-F

5’ GAA AAC AAT TGT GAT TCC GCA AG 3’

118

[12, 13]

23S-R

5’ CGG GTA GCG CTG AGA CAT ATC CT 3’

IS1081

IS1081-F

5’ TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3’

300

[12,13]

IS1081-R

5’ GCC GTT GCG CTG ATT GGA CC 3’

IS6110


IS6110-F

5’ CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC 3’

249

[12,13]

IS6110-R

5’ GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA 3’



    1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

      1. Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu mô tả với quần thể nghiên cứu là chủng vi khuẩn lao phân lập trên cả 3 miền của Việt Nam và thông số nghiên cứu là tỷ lệ xuất hiện các gen đích đặc trưng phục vụ cho chẩn đoán của quần thể chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam.

2.3.1.1. Kiểm tra tỷ lệ khuyết IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam bằng phản ứng multiplex PCR

Các chủng lao của ba miền Bắc Trung Nam được tách DNA và chạy multiplex PCR để kiểm tra tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA . Với những chủng lao nghi khuyết các trình tự đặc trưng cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA sẽ được thu nhận và kiểm tra lại bằng phản ứng PCR đơn mồi.



2.3.1.2. So sánh tỷ lệ khuyết các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA giữa ba miền Bắc Trung Nam

Kết quả về hiện tượng khuyết gen được thống kê ở từng miền và so sánh với nhau.



2.3.1.3. Đặc điểm khuyết gen ở vi khuẩn lao ở Việt Nam

Thống kê kết quả khuyết những gen đặc trưng như IS6110, IS1081 và 23S rDNA ở vi khuẩn lao ở Việt Nam.


2.3.2. Sơ đồ nghiên cứu

Vi khuẩn lao

Tách DNA








Multiplex PCR đồng thời 3 gen đích

Kiểm tra lại bằng PCR đơn mồi với mẫu khuyết gen









Xác định tỷ lệ khuyết của từng gen đích

So sánh tỷ lệ khuyết gen ở ba miền Bắc – Trung – Nam






Đặc điểm khuyết gen ở các chủng lao ở Việt Nam



: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


1   2   3   4   5   6   7   8


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương