Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.2. Cỡ mẫu nghiên cứu

Trong đó :

Z_{1- /2} = 1,96 (với độ tin cậy = 95%)

P : Tỉ lệ ước đoán trong quần thể (tỷ lệ ước đoán khuyết gen đích IS6110 ở Việt Nam là 5 % theo các nghiên cứu trong nước công bố).

d : Độ dao động của tỉ lệ phát hiện không quá 5% so với tỷ lệ thực

n : Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được

Căn cứ công thức trên, chọn d = 2% thì cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là n = 456, thực tế đã thu thập 750 chủng vi khuẩn lao ở cả 3 miền.

Cách lấy mẫu: Thu thập ngẫu nhiên chủng vi khuẩn phân lập được trong khoản thời gian thuộc giai đoạn 2007-2010 tại các điểm nghiên cứu.

Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược – Học viện Quân Y.

1. 
   Các hóa chất và thiết bị
   

Trình tự các cặp mồi IS 6110 và 23S rDNA được tham khảo từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới. Cặp mồi IS 6110F/IS 6110R khuếch đại gen đích nằm trong trình tự chèn IS 6110 có độ dài 249 bp. Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự đã cho thấy gen đích 23S rDNA có ở tất cả các chủng lao gây bệnh [41]. Chúng tôi đã tham khảo, kiểm tra và lựa chọn cặp mồi khuếch đại ADN có độ dài 118 bp nằm trong gen 23S rDNA mã hoá cho tiểu phần 23S của rRNA.

Theo các tác giả Ấn Độ và trên thế giới đã chứng minh trình tự IS 1081 cũng có giá trị rất lớn trong chẩn đoán phát hiện M. tuberculosis complex và khắc phục vấn đề thiếu gen đích IS 6110 ở một số chủng lao ở Ấn Độ, Đông Nam châu Á và Việt Nam [20,40, 43], do vậy chúng tôi sử dụng cặp mồi IS 1081F/IS 1081R để khuếch đại gen đích thuộc trình tự chèn IS 1081 có độ dài 300bp.
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Gen đích	Mồi	Trình tự	Sản phẩm (bp)	Nguồn
23S rDNA	23S-F	5’ GAA AAC AAT TGT GAT TCC GCA AG 3’	118	[12, 13]
	23S-R	5’ CGG GTA GCG CTG AGA CAT ATC CT 3’
IS1081	IS1081-F	5’ TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3’	300	[12,13]
	IS1081-R	5’ GCC GTT GCG CTG ATT GGA CC 3’
IS6110	IS6110-F	5’ CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC 3’	249	[12,13]
	IS6110-R	5’ GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA 3’

2. 
   PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
   
   1. 
      Thiết kế nghiên cứu
      

Các chủng lao của ba miền Bắc Trung Nam được tách DNA và chạy multiplex PCR để kiểm tra tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA . Với những chủng lao nghi khuyết các trình tự đặc trưng cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA sẽ được thu nhận và kiểm tra lại bằng phản ứng PCR đơn mồi.

Kết quả về hiện tượng khuyết gen được thống kê ở từng miền và so sánh với nhau.

Thống kê kết quả khuyết những gen đặc trưng như IS6110, IS1081 và 23S rDNA ở vi khuẩn lao ở Việt Nam.