Trong nhiều quốc gia, bệnh lao bò là bệnh truyền nhiễm chính trên đàn bò, các thú vật thuần dưỡng khác, và một số quần thể hoang dã. Sự truyền lây sang người gây nên vấn đề sức khỏe cộng đồng


c) Các phương pháp nhận biết acid nucleic



tải về 195.61 Kb.
trang2/3
Chuyển đổi dữ liệu10.11.2017
Kích195.61 Kb.
1   2   3

c) Các phương pháp nhận biết acid nucleic

Việc nhận diện nhanh đã được áp dụng đối với các dòng phân lập được, đến cấp độ phức hợp M. tuberculosis có thể thực hiện được bằng thăm dò DNA với phức hợp đoạn Gen Thăm dò Lao (Gen Probe TB complex DNA probe) hay bằng phản ứng chuỗi phân tử (PCR) tập trung vào rRNA 16S – 23S, kết chuỗi chèn IS6110 và IS1081, và các gen mã hóa cho các protein của phức hợp M. tuberculosis, như MPB70 và kháng nguyên b có phân tử lượng 38 kDa. Việc nhận diện đặc trưng của một dòng phân lập là M. bovis có thể thực hiện được bằng áp dụng PCR nhắm đến một biến dị ở vị trí nucleotide 285 trong gen oxyR (15, 26, 32, 35). Cách khác, các kỹ thuật phân chủng theo phân tử như cắt xén phân tử để phân chủng (spoligotyping) sẽ nhận diện các dòng M. bovis và cho ra một số thông tin về phân chủng phân tử (moleculartyping) trên dòng vi sinh vật phân lập được mà có giá trị về dịch tễ học.

PCR đã được đánh giá rộng rãi cho phát hiện phức hợp M. tuberculosis trong các mẫu lâm sàng (chủ yếu là mủ) ở bệnh nhân và gần đây đã được áp dụng cho các chẩn đoán bệnh lao trên thú vật. Một số bộ kit thương mại hiện hành và các phương pháp trong phòng thí nghiệm “in-house” khác nhau đã được đánh giá cho phát hiện phức hợp M. tuberculosis trong các mô tươi và đã cố định. Các đoạn mồi khác nhau đã được sử dụng, như mô tả phần trên. Các sản phẩm khuyếch đại đã được phân tích bằng lai ghép (hybridisation) với các đoạn thăm dò (primer) hay bằng điện di. Các bộ kit thương mại và các phương pháp trong phòng thí nghiệm, trên các mô tươi, đông lạnh hay được bảo quản bằng acid boric, đã thể hiện khác nhau và thấp hơn các kết quả hoàn hảo trong các so sánh giữa các phòng thí nghiệm (31). Các kết quả dương tính sai và âm tính sai, đặc biệt là trong các mẫu có chứa số lượng ít trực khuẩn, đã làm giảm độ tin cậy của xét nghiệm. Các biến thiên về kết quả đã ảnh hưởng đến số lượng sao chép thấp của kết chuỗi mục tiêu trên mỗi vi khuẩn có liên quan với số lượng thấp của trực khuẩn. Các biến thiên cũng ảnh hưởng đến các phương pháp khử nhiễm, các phương pháp chiết xuất DNA, các kỹ thuật cho hạn chế các tác nhân ức chế enzyme polymerase, các đối chứng nội bộ và bên ngoài và các phương pháp ngăn ngừa vấy nhiễm chéo. Sự cải thiện về độ tin cậy của PCR như là một xét nghiệm thực dụng để phát hiện phức hợp M. tuberculosis trong các mẫu lâm sàng tươi sẽ cần đến phát triển các phương pháp đã được chuẩn hóa và mạnh mẽ. Vấy nhiễm chéo là vấn đề lớn nhất với dạng ứng dụng này và giải thích vì sao phải kiểm soát đầy đủ với từng đợt khuyếch đại. Tuy nhiên, PCR hiện nay được áp dụng trong một thủ tục cơ bản trong một số phòng thí nghiệm để phát hiện nhóm M. tuberculosis trong các mô đã được thấm nhập paraffin (29, 30). Các kết quả tối ưu đã thu được khi áp dụng cả PCR trực tiếp lẫn các phương pháp phân lập.

Việc tìm dấu vết gen cho phép các phòng thí nghiệm phân biệt được giữa các dòng của M. bovis và sẽ giúp mô tả được mô hình về nguồn gốc, truyền lây và lan tràn của M. bovis. Phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất là phân chủng cắt xén (spoligotyping) (từ “khoảng cắt xén”), mà cho phép phân biệt các dòng trong loài thuộc về phức hợp M. tuberculosis, bao gồm M. bovis và cũng có thể phân biệt giữa M. bovisM. tuberculosis (25). Các kỹ thuật khác mà có thể xác định hơn bao gồm các phân tích giới hạn nội nhân (restriction endonuclease analysis – REA), giới hạn chiều dài đoạn đa hình thái (restriction fragment length polymorphism – RFLP), sử dụng đoạn mồi IS6110 (đặc biệt khi ở đây có > 3 – 4 bản sao của IS6110 trong dòng phân lập), đoạn thăm dò vùng trực tiếp lặp lại (direct repeat [DR] region probe) và đoạn thăm dò PGRS (kết chuỗi đa hình thái GC lặp lại – polymorphic GC repeat sequence) (40). RFLP sử dụng một kết hợp của các đoạn thăm dò DR và pUCD (33) và phân loại cấu hình VNTR (biến thiên lặp lại số lượng ghép cặp – variable number tandem repeat) (13, 14, 18, 27) gần đây đã được đánh giá. Thông thường, một kết hợp của các kỹ thuật này có thể được áp dụng để thu được sự phân biệt giữa các dòng (11).

Gen di truyền của M. bovis đã được phân tích chuỗi và thông tin này đã được công bố để cải thiện các phương pháp dò tìm dấu vết di truyền (genetic fingerprinting).

2. Xét nghiệm trì hoãn dạng quá mẫn (delayed hypersensitivity test)

o Xét nghiệm thử lao tố (the tuberculin test) (xét nghiệm được đề xuất cho giao thương quốc tế)

Trước kia, lao tố chế tạo từ môi trường tổng hợp được cô đậm bằng nhiệt (heat-concentrated synthetic medium – HCSM) đã được áp dụng ở hầu hết các quốc gia, nhưng lao tố HCSM đã được thay thế bằng một lao tố chiết xuất từ protein tinh lọc (purified protein derivative – PPD tuberculin). Các lao tố HCSM có thể có hiệu lực tốt nếu được chuẩn hóa đúng đối với phản ứng sinh học, nhưng tính đặc hiệu thì thấp hơn các lao tố PPD. Hơn nữa, người ta thấy rằng các lao tố PPD dùng cho bò được chế tạo từ M. bovis dòng AN5 là đặc hiệu hơn cho phát hiện bệnh lao bò, so với các lao tố PPD được chế tạo từ M. tuberculosis.

Phương pháp chuẩn cho phát hiện bệnh lao bò là thử lao tố, mà bao gồm tiêm vào trong da lao tố PPD của bò và sau đó phát hiện phản ứng sưng (mức độ trì hoãn dạng quá mẫn) ở vị trí tiêm vào 3 ngày sau. Xét nghiệm này có thể thực hiện chỉ với lao tố bò hay thực hiện như một xét nghiệm so sánh, sử dụng các lao tố gia cầm và bò. Xét nghiệm thử lao tố thường được thực hiện ở phần giữa cổ, nhưng có thể thực hiện ở nếp gấp cuối (caudal fold) ở đuôi. Da của vùng cổ thường nhạy cảm hơn đối với lao tố, so với sa của vùng đuôi. Để biết được sự khác biệt này, các liều cao của lao tố có thể sử dụng ở nếp gấp cuối đuôi.

Dạng trì hoãn miễn dịch có thể không phát triển trong giai đoạn 3 – 6 tuần sau khi bị nhiễm mầm bệnh. Do đó, nếu một đàn/con thú bị nghi ngờ có tiếp xúc với các con thú rất mới bị nhiễm gần đây, xét nghiệm trì hoãn sẽ được cho là để làm giảm khả năng cho ra âm tính sai. Do độ nhạy của xét nghiệm là thấp hơn 100%, không chắc rằng việc thanh toán bệnh lao từ một đàn sẽ đạt được chỉ với xét nghiệm thử lao tố. Phải nhìn nhận rằng khi được áp dụng với các con thú bị nhiễm mãn tính với bệnh tích nặng nề, xét nghiệm thử lao tố có thể không cho ra đáp ứng.

Xét nghiệm thử lao tố so sánh được áp dụng để phân biệt giữa con thú bị nhiễm với M. bovis và con thú đã có nhạy cảm (sensitised) với lao tố bò là kết quả của phơi nhiễm với mycobacteria khác. Sự nhạy cảm này có thể góp phần cho phản ứng kháng nguyên chéo đối với các loài mycobacteria và giống có liên quan. Xét nghiệm này bao gồm tiêm vào trong da lao tố bò và lao tố gia cầm ở các vị trí khác nhau, thường trên cùng một bên cổ, và đo lường phản ứng vào 3 ngày sau.

Tính hiệu lực của lao tố phải được ước tính bằng các phương pháp sinh học, dựa vào so sánh với các lao tố chuẩn, và tính hiệu lực được biểu thị bằng Đơn vị Quốc tế (International Units – IU). Trong một số quốc gia, lao tố bò được coi là có hiệu lực chấp nhận được nếu hiệu lực ước tính được bảo đảm cho mỗi liều ở bò là ít nhất 2.000 IU (± 25%). Ở bò đã được giảm nhạy di ứng, cần có một liều cao lao tố bò, và các liều lượng trong chiến dịch quốc gia thanh toán được khuyến cáo đến 5.000 IU. Thể tích cửa từng liều tiêm sẽ không quá 0,2 ml.



Phương pháp xét nghiệm

  1. Một kỹ thuật tiêm chuẩn xác là quan trọng. Vị trí tiêm phải được cao lông và làm sạch. Một nếp da được đo bằng thước kẹp trước khi tiêm. Một mũi kim tiêm ngắn, mũi vát và một xy lanh chia độ chứa lao tố, chích xiên góc vào lớp sâu của da. Sau đó tiêm lượng lao tố vào. Liều lượng lao tố không thấp hơn 2.000 IU, kể cả lao tố bò lẫn lao tố gia cầm. Thao tác tiêm đúng được xác nhận bằng sờ nắn thấy một nốt sưng bằng hạt đậu xanh (pea-like) ở vị trí tiêm. Khoảng cách giữa hai mũi tiêm sẽ khoảng 12 – 15 cm. Ở thú non mà không có đủ khoảng rộng giữa hai mũi tiêm, thì tiêm mỗi mũi một bên cổ đối xứng với nhau, nơi một phần ba giữa của cổ. Độ dày nếp da của từng mụi tiêm được đo lúc 72 giờ sau khi tiêm. Cùng một người sẽ đo độ dày da trước khi tiêm và sau khi tiêm.

  2. Đã có một số phương pháp thay thế khác cho diễn giải đáp ứng của xét nghiệm thử lao tố, nhận ra các phản ứng dương tính sai có thể xảy ra do nhạy cảm với các mycobacteria khác và nhận ra viêm cục bộ. Quan trọng là việc nhận biết này cân bằng giữa độ nhạy và tính đặc hiệu, và việc xảy ra các giá trị trùng lắp là không có khả năng. Các chính sách thích hợp cần được đặt ra, tùy theo lưu hành bệnh và liên quan đến nguy cơ (như có nguồn tàng trữ hoang dã). Việc diễn giải là dựa vào quan sát và ghi nhận sự gia tăng độ dày nếp da. Trong xét nghiệm thử một loại lao tố (chỉ cần tiêm một loại lao tố bò), phản ứng thường được coi là âm tính nếu quan sát thấy chỉ bị sưng đến mức giới hạn, mà độ dày da tăng không quá 2 mm và không có các dấu hiệu lâm sàng, như phù lan tràn hay tỏa rộng, xuất dịch, hoại tử, đau hay viêm các đường bạch huyết trong vùng hay ở các hạch lâm ba. Phản ứng được coi là không chắc chắn nếu không có bất cứ dấu hiệu nào quan sát thấy và nếu sự gia tăng độ dày nếp da là trên 2 mm và dưới 4 mm. Phản ứng được coi là dương tính nếu các dấu hiệu lâm sàng, như đã nêu trên, quan sát thấy được hoặc có sự gia tăng độ dày nếp da đến 4 mm hay hơn. Hơn nữa, trong các đàn bị nhiễm M. bovis, mọi mức độ sưng sờ thấy hay nhìn thấy đều được coi là dương tính. Đôi khi một diễn giải cứng rắn hơn sẽ được áp dụng, đặc biệt là trong một một quần thể có nguy cơ cao hay với thú vật có tiếp xúc. Các con thú mà coi là không chắc chắn bởi xét nghiệm thử một loại lao tố sẽ phải chịu một xét nghiệm nữa sau thời gian khoảng 42 ngày, để cho hết nhạy cảm (một số nơi quy định là 60 ngày với bò và 120 ngày với hươu). Các con thú mà không âm tính đối với lần xét nghiệm thứ nhì sẽ được coi là dương tính. Các con thú mà dương tính với xét nghiệm thử một loại lao tố có thể phải qua một xét nghiệm thử so sánh hai loại lao tố hay làm xét nghiệm máu. Mọi xét nghiệm lại sẽ được thực hiện theo tiêu chuẩn của các chương trình kiểm soát của quốc gia hay khu vực.

  3. Trong diễn giải xét nghiệm so sánh thử lao tố trong da, một phản ứng thường được coi là dương tính nếu có phản ứng thể hiện ở vị trí tiêm lao tố gia cầm. Phản ứng được coi là không chắc chắn nếu độ dày nếp da ở vị trí tiêm lao tố bò là dày hơn từ 1 đến 4 mm so với vị trí tiêm lao tố gia cầm. Phản ứng được coi là âm tính nếu sự gia tăng độ dày da ở vị trí tiêm lao tố bò là thấp hơn hay tương đương với gia tăng độ dày da ở vị trí tiêm lao tố gia cầm. Lược đồ diễn giải này được áp dụng ở các quốc gia thuộc Liên Minh Châu Âu (EU) và được khuyến cáo trong Council Directive 64/432/EEC (16). Đôi khi người ta áp dụng một diễn giải cứng rắn hơn.

  4. Trong xét nghiệm thử lao tố vào nếp da đuôi, một mũi kim tiêm ngắn, có mũi vát, được đâm xiên vào lớp sâu của da nơi hai bên của nếp da đuôi, điểm giữa quanh nếp gấp và điểm giữa vùng có lông và mặt bụng của nếp gấp. Một diễn giải chuẩn là mọi biến đổi sờ nắn được hay nhìn thấy được đều được cho là phản ứng. Một diễn giải cải tiến cũng được áp dụng: Một xét nghiệm dương tính là mọi mức độ sưng sờ thấy hay nhìn thấy được ở vị trí tiêm mà có độ dày nếp da chênh lệch đến 4 mm khi so sánh với độ dày của nếp da đối diện. Nếu con thú chỉ có một nếp gấp da đuôi, xét nghiệm được coi là dương tính nếu nếp gấp da đuôi dày đến 8 mm hay hơn.

3. Các xét nghiệm máu ở phòng thí nghiệm

Bên cạnh xét nghiệm thử lao tố da cổ điển, một số xét nghiệm máu đã được áp dụng (22). Do có chi phí và phức tạp hơn của các xét nghiệm ở phòng thí nghiệm, nên thường được áp dụng làm xét nghiệm phụ (ancillary test) để xác nhận hay phủ nhận các kết quả của thử lao tố trong da. Ở đây cũng có bằng chứng là khi một con thú bị nhiễm được xét nghiệm lao tố trong da, xảy ra sự gia tăng kết quả trong xét nghiệm máu. Điều này cho phép phân biệt tốt hơn các đáp ứng xét nghiệm máu ở ngoại môi trường, dẫn đến tính chính xác của xét nghiệm lớn hơn. Xét nghiệm gamma interferon đo lường miễn dịch qua trung gian tế bào, trong khi xét nghiệm ELISA đo lường miễn dịch qua trung gian thể dịch.



a) Xét nghiệm gamma-interferon

Trong xét nghiệm này, sự phóng thích một lymphokine gamma interferon (IFN-γ) được đo lường trong hệ thống cấy máu nguyên. Xét nghiệm này là dựa vào sự phóng thích IFN-γ từ các tế bào lâm bà đã được tạo nhạy (sensitised lymphocytes) trong thời gian ủ 16 – 24 giờ với kháng nguyên đặc hiệu (lao tố PPD). Xét nghiệm tạo ứng dụng về so sánh sự sản sinh IFN-γ sau khi kích thích với PPD của gia cầm và bò. Phát hiện về định lượng của IFN-γ ở bò được thực hiện bằng xét nghiệm ELISA chồng lớp (sandwich ELISA) mà sử dụng hai kháng thể đơn gia đối với gamma-interferon. Khuyên rằng các mẫu máu sẽ được vận chuyển đến phòng thí nghiệm và xét nghiệm được thực hiện càng sớm càng tốt, trong vòng 8 – 12 giờ sau khi thu thập mẫu. Trong một số khu vực, đặc biệt là nơi mà lưu hành “không đặc trưng”, một số vấn đề về tính chính xác đã thể hiện. Tuy nhiên, do xét nghiệm IFN-γ có khả năng phát hiện bệnh nhiễm sớm, việc áp dụng cả hai xét nghiệm song song cho phép phát hiện số lượng lớn thú vật bị nhiễm trước khi chúng trở thành nguồn lây lan cho các thú vật khác cũng như thành nguồn cho vấy nhiễm vào môi trường (19). Việc sử dụng các kháng nguyên mycobacteria đã xác định như ESAT 6 và CFP-10 hứa hẹn cải thiện tính đặc hiệu (5). Việc sử dụng các kháng nguyên này cũng có thể cho ra khả năng phân biệt được các con thú có hay không sử dụng vaccin. Ở các con thú mà khó khăn hay nguy hiểm khi tiếp xúc, như bò bị kích động hay các loài bò khác, lợi thế của xét nghiệm IFN-γ hơn hẳn xét nghiệm thử lao tố do con thú chỉ cần được cố định một lần. Xét nghiệm IFN-γ đã được chấp thuận áp dụng trong nhiều chương trình quốc gia, bao gồm ở Mỹ, New Zealand và Australia. Ở New Zeland, xét nghiệm IFN-γ được áp dụng làm xét nghiệm tiếp theo (để gia tăng tính đặc hiệu) và làm xét nghiệm song song (để gia tăng độ nhạy). Khi xét nghiệm IFN-γ được áp dụng làm xét nghiệm tiếp theo, các mẫu máu có thể được gởi đến phòng thí nghiệm muộn đến 28 giờ sau khi thu thập (37).



b) Xét nghiệm phát hiện tăng sinh tế bào lâm ba (lymphocyte proliferation assay)

Dạng xét nghiệm ở ngoại môi trường này so sánh phản ứng của các tế bào lâm ba ngoại biên đối với lao tố PPD (PPDB) và PPD từ Micobacterium avium (PPD-A). Xét nghiệm này có thể thực hiện với máu nguyên (5) hay với tế bào lâm ba tinh khiết từ các mẫu máu ngoại biên (20). Xét nghiệm này cố gắng gia tăng tính đặc hiệu của xét nghiệm bằng loại bỏ đáp ứng của các tế bào lâm ba đối với các kháng nguyên “không đặc hiệu” hay kháng nguyên có phản ứng chéo với các loài không gây bệnh của mycobacteria, mà con thú có thể đã bị phơi nhiễm. Các kết quả thường được phân tích là giá trị thu được trong đáp ứng đối với PPD-B trừ đi giá trị thu được trong đáp ứng đối với PPD-A. Giá trị B – A này phải trên ngưỡng mà có thể được chọn lựa để tối đa hóa cả về tính đặc hiệu lẫn độ nhạy của chẩn đoán. Xét nghiệm này có giá trị khoa học, nhưng không được áp dụng làm thủ tục chẩn đoán do tốn thời gian và thi hành phức tạp trong phòng thí nghiệm (cần thời gian ủ kéo dài và sử dụng các đoạn nucleotide phóng xạ). Như với xét nghiệm IFN-γ, xét nghiệm tăng sinh tế bào lâm ba sẽ được tiến hành ngay sau khi thu thập mẫu máu. Xét nghiệm này có thể có ích đối với các con thú hoang dã hay thú vật sở thú. Một xét nghiệm máu bao gồm xét nghiệm về chuyển hóa tế bào lâm ba (lymphocyte transformation assay) và xét nghiệm ELISA đã được báo cáo là có độ nhạy và tính đặc hiệu cao trong chẩn đoán M. bovis ở hươu (20). Xét nghiệm này tương đối đắt tiền và chưa được so sánh giữa các phòng thí nghiệm.



c) Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay)

Ở đây đã có nhiều nỗ lực thành công để phát triển các xét nghiệm chẩn đoán huyết thanh học lâm sàng có ích đối với bệnh lao. ELISA thể hiện là thích hợp nhất trong các xét nghiệm phát hiện kháng thể và có thể dùng để bổ sung, hơn là thay thế, các xét nghiệm dựa vào miễn dịch qua trung gian tế bào. Xét nghiệm này có thể có ích đối với bò và hươu. Một lợi thế của ELISA là tính giản tiện, nhưng cả tính đặc hiệu lẫn độ nhạy đều có giới hạn đối với bò, chủ yếu là do sự phát triển muộn và không đồng đều của đáp ứng miễn dịch dịch thể của bò trong tiến trình bệnh. Tuy nhiên đáp ứng kháng thể của hươu gần như phát triển sớm và chính xác hơn, nên độ nhạy của một ELISA cạnh tranh (conparative ELISA) đã được báo cáo là cao đến 85% trong các loài này (21). Sự cải thiện có thể được bằng sử dụng các kháng nguyên khác, bao gồm các proteins (như MPB 70, rất đặc hiệu nhưng thiếu độ nhạy). Hơn nữa, trong các con thú bị nhiễm M. bovis, sự gia tăng ký ức đã diễn ra trong tế bào lâm ba, thường dẫn đến có các kết quả ELISA tốt hơn lúc 2 – 8 tuần sau khi thực hiện thủ tục xét nghiệm thử lao tố. Một so sánh các hàm lượng kháng thể đối với PPD-B và PPD-A cũng đã thể hiện có ích trong việc làm gia tăng tính đặc hiệu của ELISA (21). ELISA cũng có thể có ích cho phát hiện bị nhiễm M. bovis ở loài hoang dã. Ở New Zealand, ELISA được chấp thuận là một xét nghiệm phụ song song cho hươu nuôi trang trại, thực hiện lúc 13 – 33 ngày sau khi thử lao tố ở vùng giữa cổ (20).



C. CÁC YÊU CẦU ĐỐI VỚI VACCIN VÀ CÁC CHẨN ĐOÁN SINH HỌC

Ngày nay, chỉ một vaccin hiện có đối với bệnh nhiễm M. bovis là bacille-Calmette-Guerin (BCG), là một dòng nhược độc của M. bovis. Vaccin này thể hiện hiệu quả khác nhau trên các thử nghiệm ở bò, mà có thể bị ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau bao gồm công thức vaccin, đường cấp vaccin và mức độ phơi nhiễm đối với mycobacteria ở môi trường (39). Các thử nghiệm đã được thực hiện trên một số vaccin khác, nhưng không có vaccin nào trong số này thể hiện bảo hộ cao hơn so với BCG. Hiệu quả của BCG cũng thể hiện biến thiên như đã được báo cáo trên người. Một số vaccin ứng cử hiện nay đã được thử nghiệm. DNA của vi khuẩn gây bệnh lao hiện đang được nghiên cứu chi tiết và toàn bộ kết chuỗi di truyền đã được công bố. Điều này có thể đặc biệt có ích trong nhận diện các gen có liên quan đến độc lực để hướng đến một vaccin DNA. Ở các quốc gia bị nhiễm mà không có lịch trình xét nghiệm và giết hủy, việc áp dụng vaccin BCG có thể làm giảm sự phát tán bệnh trên bò. Trước khi đưa ra một chương trình sử dụng vaccin, lịch trình cung cấp vaccin sẽ được tối ưu hóa theo các điều kiện của địa phương. Liều lượng điển hình sẽ từ 104 đến 106 đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit – CFU), được cấp dưới da. Vaccin sẽ dựa vào dòng vi khuẩn tham chiếu chuẩn, dòng BCG Pasteur của Đan Mạch (43). Quan trọng là biết rằng việc sử dụng vaccin sẽ cản trở các xét nghiệm thử lao tố hay các xét nghiệm miễn dịch học khác. Do đó sẽ không sử dụng vaccin cho bò trong các quốc gia mà các biện pháp kiểm soát hay giao thương là dựa vào các xét nghiệm này. Các vaccin BCG cũng có thể được sử dụng để làm giảm lây lan M. bovis trong loài hoang dã thành nguồn tàng trữ. Trước khi sử dụng vaccin này, cốt yếu là đánh giá hệ thống cung cấp cho từng loài hoang dã. Tác động đến môi trường của vaccin trên các loài hoang dã cũng cần được cân nhắc.

Các hướng dẫn về sản xuất các vaccin thú y được nêu trong Chương 1.1.8 Các nguyên tắc về sản xuất vaccin thú y. Các hướng dẫn nêu trong chương này và trong Chương 1.1.8 là có hướng chung, có thể được bổ sung theo các yêu cầu của quốc gia và vùng.

Lao tố chế tạo từ các sản phẩm đã được xử lý nhiệt của các mẻ cấy và làm dung giải M. Tuberculosis (lao tố cho người) hay M. bovis (lao tố cho bò). Trước kia, mẻ nuôi cấy vi khuẩn được sử dụng cho sản xuất lao tố là canh glycerol. Vào các năm 1940, “lao tố chế tạo từ môi trường nuôi cấy tổng hợp được cô đậm bằng nhiệt – heat concentrated synthetic medium tuberculin” hay lao tố HCSM, được chế tạo từ nuôi cấy vi khuẩn trong một môi trường tổng hợp dạng lỏng, đã thay thế các lao tố “cũ”. Hiện nay, cả các lao tố cũ và HSCM đều đã được thay thế, trên khắp thể giới, bằng chiết xuất protein đã được tinh lọc gọi là PPD (purified protein derivative).



Sản xuất lao tố (tuberculin)

1. Quản lý giống

a) Phân loại giống

Các dòng của M. bovis được sử dụng để chế tạo giống gốc phải được nhận diện loài bằng các xét nghiệm thích hợp. Một ghi chép phải được kèm theo về nguồn gốc và lịch sử tiếp theo. Các mẻ giống phải không được qua cấy truyền quá năm lần. Các dòng M. bovis AN5 hay Vallee thường được áp dụng nhất.



b) Phương pháp nuôi cấy

Nếu mẻ cấy gốc được cấy trong môi trường đặc, cần phải tạo thích nghi cho vi khuẩn đối với môi trường dòng chảy (như bằng cách kết hợp một miếng khoai tây [potato] vô trùng vào các bình nuôi cấy hay môi trường lỏng, như môi trường của Watson Reid). Khi vi khuẩn đã thích nghi với môi trường lỏng, có thể sử dụng để chế tạo thành lô giống gốc (master seed lot), sẽ được bảo quản dưới dạng đông khô (freeze-dried). Giống gốc này được sử dụng để cấy vào môi trường cho sản xuất các lô giống thứ cấp (secondary seed lots), mà sẽ không cấy truyền quá bốn lượt từ giống gốc. Giống thứ cấp được sử dụng để cấy vào môi trường sản xuất (1, 23).

Chất nền nuôi cấy phải thể hiện có khả năng tạo ra một sản phẩm mà phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế đã quy định (Tổ chức Y tế Thế giới [WHO], Dược điển Châu Âu [European Pharmacopoeia] hay của các quan chức cấp phép khác). Chất nền nuôi cấy phải sạch khỏi các thành phần bị coi là gây độc hay gây phản ứng dị ứng.

c) Đánh giá

Các dòng của M. bovis được sử dụng làm giống cấy phải thể hiện sạch khỏi các vi sinh vật vấy nhiễm.

Các lô giống phải thể hiện có hiệu quả trong sản xuất lao tố với đầy đủ hiệu lực. Các xét nghiệm cần thiết được nêu trong Đoạn C.4 dưới đây.

2. Phương pháp sản xuất

Vi khuẩn này được cấy vào một môi trường tổng hợp, protein được lọc ra và được ngưng kết bằng hóa chất (sử dụng ammonium sulphate hay trichloroacetic acid [TCA]), sau đó được rửa và tái hòa tan. Lao tố PPD được khuyến cáo là phải được chuẩn hóa một cách chính xác.

Có thể cho vào một chất kháng sinh dùng bảo quản mà không cho ra các phản ứng dương tính sai, như phenol (không quá 0,5% [w/v]). Glycerol (không quá 10% [w/v]) hay glucose (2,2% [w/v]) có thể cho vào làm chất tạo ổn định. Không được sử dụng dẫn xuất của thủy ngân. Sản phẩm này cũng được chia vào một cách vô trùng cho các vật chứa vô trùng, trung tính, mà được niêm kín sao cho tránh được vấy nhiễm. Sản phẩm có thể được làm đông khô.

3. Kiểm soát trong quá trình sản xuất

Các bình nuôi cấy trong sản xuất, được cấy vào giống cấy thích hợp, được ủ nuôi với thời gian thích hợp. Mọi bình nuôi cấy mà thể hiện vấy nhiễm hay phát triển bất thường thì sẽ phải loại bỏ sau khi đem hấp tiệt trùng bằng autoclave. Theo quá trình ủ cấy, bề mặt của nhiều mẻ cấy trở nên ẩm ướt và có thể thấm vào môi trường hay đến đáy của bình nuôi.

Trong các lao tố PPD, độ pH của chất kết tủa đã hòa tan (gọi là lao tố đã được cô đậm) sẽ từ 6,6 – 6,7.

Hàm lượng protein của PPD cô đậm được xác định bằng phương pháp Kjeldahl hay các phương pháp thích hợp khác. Tổng số nitrogen và nitrogen ngưng kết TCA thường được so sánh.

Thành phẩm phải được thử nghiệm sinh học trong chuột lang (guinea-pig). Tính hiệu lực và tính đặc hiệu được thể hiện trong so sánh với một lao tố tham chiếu. Các độ pha loãng thêm được tạo ra với một dịch đệm, theo hàm lượng protein và hàm lượng cuối cùng cần thiết, thường là 1,0 mg/ml (1, 23).

4. Kiểm soát lô thành phẩm

Các mẫu phải phù hợp với các tiêu chuẩn được ghi nhận chính thức cho sản xuất lao tố như nêu ra trong Dược điển Châu Âu hay các tiêu chuẩn tương đương.



a) Tính vô trùng (sterility)

Xét nghiệm về tính vô trùng thường được thực hiện theo các hướng dẫn quốc tế (cũng xem Chương 1.1.9 Các xét nghiệm đối với tính vô trùng và sạch khỏi vấy nhiễm các chất liệu sinh học).



b) Tính an toàn (safety)

Hai con chuột lang (guinea-pig), từng con không quá 250 g, mà trước đó chưa từng được sử dụng bất kỳ chất liệu này mà gây cản trở xét nghiệm, chúng được tiêm dưới da với 0,5 ml lao tố đem thử nghiệm. Không có tác động bất lợi này xảy ra trong vòng 7 ngày.

Các xét nghiệm đối với lao tố trên mycobacteria sống có thể được thực hiện hoặc là ngay với lao tố trước khi chia vào các chai chứa thành phẩm, hoặc là xét nghiệm với vác mẫu lấy từ lô chai thành phẩm. Một mẫu gồm ít nhất 10 ml sẽ được lấy và được tiêm vào màng bụng của ít nhất hai con chuột lang, chia thành liều cho chúng. Thích hợp là lấy một mẫu lớn, như 50 ml, và cô đậm mọi mycobacteria tồn dư bằng ly tâm hay lọc qua màng. Các chuột lang được quan sát trong ít nhất 42 ngày và sau đó được kiểm tra bệnh tích đại thể sau khi chết. Mọi bệnh tích tìm thấy đều được kiểm tra vi thể và bằng nuôi cấy.


: Download -> 2011
Download -> Ex: She has said, “ I’m very tired” → She has said that she is very tired. Một số thay đổi khi đổi sang lời nói gián tiếp như sau
Download -> Wedding album prices menu of jessica
Download -> Cách thêm Album hình cho website hình ảnh
Download -> CỘng hoà XÃ HỘi chủ nghĩa việt nam
2011 -> Ở đây có ba giống virus cúm A, b và C; chỉ các virus cúm a mới gây bệnh cho các loài chim. Các chẩn đoán là bằng phân lập hay phát hiện và phân loại cho virus
2011 -> Bệnh lở mồm long móng (fmd) là bệnh truyền lây mạnh nhất của thú có vú và có khả năng gây ra tổn thất kinh tế nặng nề trên chăn nuôi gia súc móng guốc mẫn cảm
2011 -> Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (prrs) có đặc điểm là thất bại sinh sản ở heo nái và các vần đề hô hấp của heo con và heo cai sữa
2011 -> BỆnh lê DẠng trùng (babesiosis) Mở đầu


1   2   3


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương