Đặc điểm sinh học của chủng PK 4 – 9

4.2. Đặc điểm sinh học của chủng PK 4 – 9

• 
  Hình thái khuẩn lạc: tròn, bề mặt phẳng và ướt.
  
• 
  Kích thước, đường kính khuẩn lạc: 0,5mm – 2,0 mm
  
• 
  Màu trắng đục.
  

1

2

1. Hình ảnh khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có agar, quan sát và chụp hình sau 30h nuôi. 2. Hình ảnh soi tươi bằng kính hiển vi quang học, độ phóng đại 400 X.

Hoạt độ cellulose được xác định dựa theo phương pháp xác định đường khử của Miller (Miller G , 1959).

Theo đơn vị hoạt độ quốc tế, hoạt độ cellulase được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân CMC tạo thành 1 µM đường khử sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn (37^oC)

Trước tiên chúng tôi tiến hành dựng đồ thị tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị OD₅₄₀ (Hình 4.5). Phương trình đường đồ thị chuẩn:

y = 28221x – 524,53 (µM)

Hoạt độ enzyme cellulase tại thời điểm 20h sau khi nuôi, mật độ quang học (OD₅₄₀) đo được = 0,159, nồng độ glucose sau khi phản ứng thủy phân trong ống nghiệm = 3962,609 µM. Hoạt độ thể tích của enzyme cellulase là: 3962,609 x 2/10 = 792,5218 (Unit/ml dịch nuôi)

Hình 4.5. Đồ thị chuẩn glucose

Dịch nuôi cấy ngoại bào sau khi kết tủa chọn lọc bằng ethanol theo tỉ lệ 1:4 (v/v). Enzyme sau khi tủa chọn lọc (sơ đồ mục 3.3.5) được xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Hình 4.6).

ĐC: Nước cất

1. 70µl dịch nuôi cấy trên môi trường chọn lọc lỏng ở điều kiện 37^oC, lắc 200 vòng/phút, thu tại thời điểm 20h sau khi nuôi cấy.

2. 70 µl dịch nuôi cấy sau khi tủa bằng ethanol (80%).

Sau khi nhuộm Congo đỏ thấy xuất hiện vòng sang phân giải trên nền môi trường thử hoạt tính cellulase. Kết quả điện di SDS-PAGE cho một băng protein có khối lượng phân tử khoảng 32 kDa (Hình 4.7). Như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng, chủng PK 4 – 9 có khả năng tiết enzyme cellulase ngoại bào có khối lượng phân tử khoảng 32 kDa.

1. Marker Pre-stained protein Marker (Bio-Lab).

2. Protein MW Marker (pEQLab)

3. Mẫu enzyme vi khuẩn PK 4 – 9 sau khi tủa dịch nuôi cấy bằng ethanol.

Từ nguồn nước thải ở làng nghề giấy Phong Khê (Yên Phong – Bắc Ninh) chúng tôi đã chọn được chủng PK 4 – 9 có khả năng sinh enzyme celulase cao nhất trong 8 chủng khảo sát.

Hoạt độ thể tích enzyme của chủng khảo sát là 792,5218 (Unit/ml dịch nuôi cấy).

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy cellulose ngoại bào của chủng PK 4 – 9 có khối lượng phân tử khoảng 32 kDa.

Dựa vào kết quả nghiên cứu, có thể chọn chủng PK 4 – 9 để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo và sử dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học, phân bón vi sinh.

5.2. Đề nghị

Thử nghiệm nuôi cấy sinh khối lượng lớn với các nguồn cơ chất rẻ tiền khác như bột giấy, trấu.

1. 
   Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999), Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551.
   
2. 
   Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thùy Dương (2002), "Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn chăn nuôi." Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, 2: 34-36.
   
3. 
   Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2006), Danh mục thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu vào Việt Nam, Số 01/2006/QĐ-BNN.
   
4. 
   Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797.
   
5. 
   Cao Cường, Nguyễn Đức Lượng (2003), Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinase và cellulase của Trichoderma harzianum ảnh hưởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 321-324.
   
6. 
   Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339.
   
7. 
   Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến (2007), Giáo trình Hoá học hữu cơ, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội.
   
8. 
   Nguyễn Lan Hương, Lê Văn Nhương, Hoàng Đình Hòa (1999), Phân lập và hoạt hóa vi sinh vật ưa nhiệt có hoạt tính xenllulaza cao để bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội, 531-536
   
9. 
   Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003), Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL-363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307.
   
10. 
    Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 177-182.
    
11. 
    Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 804-809.
    
12. 
    Trần Xuân Ngạch (2005), Công nghệ enzyme, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
    
13. 
    Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
    
14. 
    Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ và cellolose tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 7 -14.
    
15. 
    Nguyễn Khắc Tuấn (1996). Vi sinh vật học. NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
    

16. 
    Azhari Samsu Baharuddin, Mohamad Nafis Abd Razak, Lim Siong Hock, Mohd Najib Ahmad, Suraini Abd-Aziz, Nor’ Aini Abdul Rahman, Umi Kalsom Md Shah, Mohd Ali Hassan, Kenji Sakai and Yoshihito Shirai, Isolation and Characterization of Thermophilic Cellulase-Producing Bacteria from Empty Fruit Bunches-Palm Oil Mill Effluent Compost, American Journal of Applied Sciences 7 (2010): 56-62.
    
17. 
    Barbesgaard P O, Jensen G W & Holm P, Detergent cellulase, US Pat 4435307 (to Novo Nordisk, Denmark) 6 March 1984.
    
18. 
    Belghith H, Ellouz-Chaabouni S & Gargouri A, Biostoning of denims by Penicillium occitanis, vol 6: Cellulases, J Biotechnol, 89 (2001) 257-262.
    
19. 
    Bguin P & Aubert JP, The biological degradation of cellulose, FEMS Microbiol Rev, 13 (1994) 25-58.
    
20. 
    Buchert J, Suurnakki A, Tenkanen M & Viikari L, Enzymatic characterization of pulps, in, Enzymes for Pulp and Paper Processing , edited by TW Jeffries, L Viikari, ACS Symp Ser , 655 (1996) 38-43.
    
21. 
    Clarkson K A, Weiss G L & Larenas E A, Detergent compositions containing substantially pure EGIII Cellulase, Eur Pat EP 0 586 375 B1 (to Genencore International Inc, USA) 15 March 2000.
    
22. 
    Domingues FC, Queiroz JA, Cabral JMS & Fonseca LP, The influence of culture conditions on mycelial structure and cellulase production by Trichoderma reesei RUT C-30, Enzyme Microbial Technol, 26 (2000) 394-401.
    
23. 
    Doppelbauer R, Esterbauer H, Steiner W, Lafferty R & Steinmuller H, The use of cellulosic wastes for production of cellulases by Trichoderma reesei, Appl Microbiol Biotechnol , 26 (1987) 485–494.
    
24. 
    Galante YM, De Conti A & Monteverdi R, Application of Trichoderma enzymes in food and feed industries, in Trichoderma & Gliocladium — Enzymes, Biological Control and Commercial Applications , vol 2, edited by GF Harman & CP Kubicek (Taylor & Francis, London) 1998, 327-342.
    
25. 
    Gusakov AV, Berlin AG, Popova NN, Okunev ON & Sinitsyna AP, A comparative study of different cellulase preparations in the enzymatic treatment of cotton fabrics, Appl Biochem Biotechnol, 88 (2000) 119-126.
    
26. 
    Hayashida S, Otta K & Mo K, Cellulases of Humicola insolens and Humicola grisea , in Methods in Enzymology , vol 160, edited by WA Wood & JN Abelson (Academic Press, New York) 1988, 323-332.
    
27. 
    Henrissat B, Cellulases and their interaction with cellulose, in Cellulose , vol 1 (Chapman Hall, London) 1994, 169-196.
    
28. 
    Himmel ME, Ruth MF & Wyman CE, Cellulase for commodity products from cellulosic biomass, Curr Opin Biotech , 10 (1999) 358-364.
    
29. 
    Howard RL, Abotsi E, van Rensburg ELJ, Howard S (2003), "Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production", Afr J Biotechnol, 2(12): 602-619.
    
30. 
    Jiraporn Sukhumavasi, Kunio Ohmiya, Shoichi Shimizu and Kazue Ueno, Clostridium josui sp. Nov.,a Cellullolytic, Moderate Thermophilic Species from Thai Compost. Society for General Microbiology (1988).
    
31. 
    Klemm D, Schmauder HP & Heinze T, in Biopolymers , vol VI, edited by E Vandamme, S De Beats & A. Steinb_chel (Wiley-VCH, Weinheim) 2002, 290-292.
    
32. 
    Kottwitz B & Schambil F, Cellulase and cellulose containing detergent, US Pat, 20050020472 , 27 January, 2005.
    
33. 
    Kumar R, Singh S, Singh OV, Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35 (2008): 377–91.
    
34. 
    Kundu S, Ghose TK & Mukhopadhyay SN, Bioconversion of cellulose into ethanol by Clostridium thermocellum - Product inhibition, Biotechnol Bioeng, 25 (1983) 1109-1126.
    
35. 
    Laemmli U (1970), "Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227: 680-685.
    
36. 
    Lewis GE, Hunt CW, Sanchez WK, Treacher R, Pritchard GT & Feng P, Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on the digestive characteristics of a forage-based diet fed to beef steers, J Animal Sci, 74 (1996) 3020-3028.
    
37. 
    Liu W & Zhu WM, Production and regeneration of Trichosporon cutaneum protoplasts, Process Biochem, 35 (2000) 659-664.
    
38. 
    Lynd LR, Weimer PJ, van Zyl WH & Pretorious IS, Microbial cellulase utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol Mol Biol Rev, 66 (2002) 506-577.
    
39. 
    Martin JW, Method of removing paper adhered to a surface, US Pat 4092175 (William Zinnsser & Co, Inc., USA) 30 May 1978.
    
40. 
    Maurer KH, Development of new cellulases, in Enzymes in Detergency , edited by Jan H Van Ee et al (Marcel Dekker, New York) 1997, 175-202.
    
41. 
    Miller G (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars", Anal Chem, 31: 426-428.
    
42. 
    Mitchinson C & Wendt D J, Variant EGIII-like cellulase compositions, US Pat 6268328 (to Genencore International Inc) 31 July 2001.
    
43. 
    Nermeen A. El-Sersy, Hanan Abd-Elnaby, Gehan M. Abou-Elela, Hassan A. H. Ibrahim and Nabil M. K. El-Toukhy, Optimization, economization and characterization of cellulase produced by marine Streptomyces ruber, African Journal of Biotechnology (2010), Vol 9 (38): 6355-6364.
    
44. 
    Ng TK, & Zeikus J G, Differential metabolism of cellobiose and glucose by Clostridium thermocellum and Clostridium thermohydrosulfuricum , J Bacteriol, 150 (1982) 1391-1399.
    
45. 
    Nielsen J B, A process for producing localized variation in the colour density of fabrics, Int Pat WO 94/19528 (to Novo Nordisk, Denmark) 1 September 1994.
    
46. 
    Omogbenigun OF, Nyachoti CM, Slominski BA (2004), "Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs", J Anim Sci, 82: 1053-1061.
    
47. 
    Ong L G, Abd-Aziz S, Noraini S, Karim M I & Hassan M A, Enzyme production and profile by Aspergillus niger during solid substrate fermentation using palm kernel cake as substrate, Appl Biochem Biotechnol , 118 (2004) 73-79.
    
48. 
    Pajunen E, Optimal use of β-cellulases in wort production. in EBC-Symposium on Wort Production , Monograph XI (Maffliers, France) 1986, 137-48.
    
49. 
    Persson I, Tjerneld F & Hahn-Hagerdahl B, Fungal cellulolytic enzyme production: A review, Process Biochem, 26 (1991), 65-74.
    
50. 
    Poulsen OM & Petersen LW, Growth of Cellulomonas sp.ATCC 21399 on different polysaccharides as sole carbon source induction of extracellular enzymes, Appl Microbiol Biotechnol, 29 (1988) 480-484.
    
51. 
    Rajoka MI & Malik KA, Cellulase production by Cellulomonas biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates, Biores Technol, 59 (1997) 21-27.
    
52. 
    Reczey K, Szengyel Z S, Eklund R & Zacchi G, Cellulase production by T. reesei, Biores Technol , 57 (1996) 25-30.
    
53. 
    Sheehan J & Himmel M, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the US Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol Prog, 15 (1999) 817-827.
    
54. 
    Sudha Rani K, Swamy MV & Seenayya G, Increased ethanol production by metabolic modulation of cellulose fermentation in Clostridium thermocellum, Biotech Lett, 8 (1997) 819-823.
    
55. 
    Thurston B, Dawson K A & Strobel H J, Cellobiose versus glucose utilization by the ruminal bacterium Ruminococcus albus, Appl Environ Microbiol, 59 (1993) 2631-2637.
    
56. 
    Uhlig H, Industrial Enzymes and their Applications (John Wiley & Sons, Inc, New York) 1998, 435.
    
57. 
    Van Zessen E, Weismannn M, Bakker RR, Elberson HW, Reith JH & den Uil H, Lignicellulosic Ethanol – A second opinion. -Report 2 “GAVE” 03.11 , Netherlands Agency for energy and environment, Catharijnesingel, 59, Netherlands, 2003
    
58. 
    Wiatr CL, Application of cellulase to control industrial slime, US Pat 4936994 (to Nalco Chemical Company, Illinois, USA) 26 June 1990.
    
59. 
    Wu GJ & Tsai GJ, Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water-soluble hydrolysate with immunoactivity, Fisheries Sci, 70 (2004) 1113.
    
60. 
    Xia L & Cen P, Cellulase production by solid state fermentation on lignocellulosic waste from the xylose industry, Process Biochem, 34 (1999) 909-912.
    
61. 
    Yung-Chung Lo, Ganesh D. Saratale, Wen-Ming Chen, Ming-Der Bai and Jo-Shu Chang (2009). Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production.
    
62. 
    Yung-Chung Lo, Ming-Der Bai, Wen-Ming Chen and Jo-Shu Chang, Cellulosic hydrogen production with a sequencing bacterial hydrolysis and dark fermentation strategy. Taiwan (2008).
    
63. 
    Zaldivar J, Nielson J & Olsson L, Fuel ethanol production from lignocellulose: A challenge for metabolic engineering and process integration, Appl Microbiol Biotechnol, 56 (2001) 17-34