TRƯỜng đẠi học nông nghiệp hà NỘi khoa công nghệ sinh họC    khóa luận tốt nghiệP



tải về 223.26 Kb.
trang1/2
Chuyển đổi dữ liệu30.08.2017
Kích223.26 Kb.
  1   2


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

------ ------



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn”



HÀ NỘI – 2011

MỤC LỤC

Hình 2.2. Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB 1JS4) 4

Hình 3.1. Thu nhận enzyme 22

Hình 4.1. Hình ảnh các mẫu nước thải và dịch nuôi cấy 24

Hình 4.2. Đồ thị thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian 25


27

Hình 4.3. Hoạt tính cellulase của 8 chủng nghiên cứu 27



Hình 4.5. Đồ thị chuẩn glucose 29

Hình 4.6. Hoạt tính cellulase 29



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APS

Amonium persulphat

Cellulase C1

Enzyme có hoạt tính exocellulase

Cellulase Cx

Enzyme có hoạt tính endocellulase

CMC

Carboxymethyl-cellulose

CMCase

Enzyme carboxymethyl cellulas

Dhalo

Đường kính vòng sáng

DNSA

3,5-Dinitrosalicylic acid

ĐC

Đối chứng

kDa

Kilodalton.

OD

pI


Optical density

Isoelectrics point



SDS

Sodium dodecyl sulfat

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

Tetramehtylethyenediamine

U

Unit

V

Thể tích

w/v

khối lượng/thể tích

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất cellulose 7

Bảng 3.1. Tên thiết bị dùng trong đề tài 15

Bảng 3.2. Các hóa chất sử dụng trong đề tài 15

Bảng 3.3. Thành phần môi trường 17

Bảng 3.4. Xây dựng đồ thị chuẩn 20

Bảng 3.5. Thành phần gel điện di SDS - PAGE 23

Bảng 4.1. Lượng đường khử sinh ra theo thời gian 25

Bảng 4.2. Hoạt tính cellulose ngoại bào của 8 chủng nghiên cứu 26



DANH MỤC HÌNH

Hình 2.2. Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB 1JS4) 4

Hình 3.1. Thu nhận enzyme 22

Hình 4.1. Hình ảnh các mẫu nước thải và dịch nuôi cấy 24

Hình 4.2. Đồ thị thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian 25


27

Hình 4.3. Hoạt tính cellulase của 8 chủng nghiên cứu 27



Hình 4.5. Đồ thị chuẩn glucose 29

Hình 4.6. Hoạt tính cellulase 29




TÓM TẮT

Từ nguồn nước thải nhà máy giấy Phong Khê, Bắc Ninh 8 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose đã được phân lập. Hầu hết các chủng đều phát triển tốt trên môi trường chọn lọc có agar. Khả năng sản xuất cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn được kiểm tra bằng khuếch tán đĩa thạch và nhuộm Congo đỏ. Hoạt độ cellulase được xác định bằng phương pháp đường khử. Trong số 8 chủng phân lập, chúng tôi đã chọn được 1 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulase hiệu quả nhất (chủng PK 4 – 9). Kiểm tra hoạt độ bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch thu được đường kính vòng sáng có kích thước 7mm. Hoạt độ cellulase ngoại bào thu được đạt 792,5218 U/ml dịch nuôi.

Enzyme ngoại bào thu được bằng cách kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy bằng ethanol (80%). Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy, enzyme cellulase ngoại bào của chủng vi khuẩn này có kích thước khoảng 32 kDa.

Từ khóa: Nước thải nhà máy giấy, vi khuẩn phân hủy cellulose, hoạt tính cellulase.

PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Hằng năm có khoảng 230 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo ra từ quá trình quang hợp ở thực vật, trong đó có khoảng 70 tỉ tấn (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuất nông nghiệp, chất thải các nhà máy giấy, đường và dệt may. Cellulose không tan trong nước và chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với kiềm hay acid hoặc bị thủy phân bởi các enzyme cellulase (Trần Xuân Nghạch, 2005). Hiện nay, lượng phế, phụ phẩm nông nghiệp cũng như chất thải từ các nhà máy đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường.

Để giải quyết vấn đề trên, việc phân lập được các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân huỷ cellulose có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm vi sinh vật để xử lý ô nhiễm môi trường. Từ yêu cầu đó, đề tài nghiên cứu“Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn” đã được tiến hành nhằm tạo nguồn vi sinh vật ban đầu cho các nghiên cứu ứng dụng sau này.

1.2. Mục tiêu của đề tài

1.2.1. Mục tiêu chung

Phân lập và sàng lọc một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme celulase ngoại bào cao, trong đó tập trung vào đối tượng vi khuẩn.



1.2.2. Mục tiêu cụ thể

  • Phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase ngoại bào.

  • Mô tả đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn đã phân lập được.

  • Đánh giá được khả năng sản xuất enzyme ngoại bào bằng các kỹ thuật hóa sinh.

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về cellulose và cellulase

2.1.1. Giới thiệu về cellulose

Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên. Hằng năm một lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012 tấn) được tạo thành chủ yếu từ quá trình quang hợp (Klemm D và cộng sự, 2002).

Cellulose được cấu tạo từ các gốc β-D glucopyranose được liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glucoside. Có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật (Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến, 2007). Trong gỗ lá kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích.


1



2


Hình 2.1. Một số hình ảnh về cấu trúc của cellulase

1. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose.

2. Hình ảnh ba chiều hợp chất cao phân tử Cellulose: Màu nâu - carbon, màu đỏ -oxy, màu trắng – hydro.

2.2.2. Giới thiệu về cellulase

Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiều enzyme khác nhau. Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D – glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides.

Có 3 loại enzyme cellulose chính:


  • Cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobioydrolase, EC 3.2.1.91): Enzym này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Khối lượng phân tử của các enzyme thuộc nhóm này trong khoảng 53 - 75 kDa. Các enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng.

  • Endo-β-1,4-cellulase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase, EC 3.2.14) có khối lượng phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa. Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và β-D-glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose.

  • β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21): có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Enzyme thủy phân cellulose có thể được tách thành nhiều thành phần, chẳng hạn như enzyme cellulase của vi sinh vật có thể bao gồm một hoặc nhiều CBH, một hoặc nhiều EG và có thể có β-glucosidase. Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm CBH celulase, EG và BG phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose. Các enzyme exo-cellobiohydrolases và endocellulases cùng hoạt động để thủy phân cellulose thành các đoạn ngắn oligosaccharides. Các oligosaccharides (chủ yếu là cellobiose) sau đó được thủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase (Bguin P và Henrissat B, 1994).

Celulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men. Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme.

Cellulase được sử dụng trong công nghiệp dệt (Gusakov AV và cộng sự, 2000; Belghith H và cộng sự, 2001), trong chất tẩy rửa (Maurer KH, 1997; Kottwitz B và Schambil F, 2005), ngành công nghiệp giấy (Buchert J và cộng sự, 1996), cải thiện thức ăn chăn nuôi (Lewis GE và cộng sự, 1996), trong công nghiệp thực phẩm các enzyme này chiếm một phần đáng kể của thị trường (Galante YM và cộng sự, 1998). Sản xuất ethanol sinh học từ cellulose, hemicellulose và lignin (lignocellulosic) sẽ giải quyết được mối quan tâm về tình trạng thiếu nhiên liệu hóa thạch, cũng như ô nhiễm không khí do đốt các nguyên liệu hóa thạch. Đặc biệt là sử dụng cellulase và hemicellulase để thủy phân lignocellulosic (Himmel ME và cộng sự, 1999; Zaldivar J và cộng sự, 2001). Tuy nhiên việc sản xuất ethanol cũng cần chú ý đến hiệu quả kinh tế (Sheehan J và Himmel M, 1999).

Sản xuất cellulase thương mại đã được thử nghiệm bằng cách nuôi cấy cùng lúc trên môi trường rắn hoặc nuôi cấy chìm và nuôi cấy liên tục. Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có chứa các nguồn cellulose khác nhau (Person I và cộng sự, 1991; Domingues FC và cộng sự, 2000), hoặc lignocellulosic (Doppelbauer R và cộng sự,1987; Reczey K và cộng sự, 1996), đặc biệt trong lên men chất rắn.





Hình 2.2. Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB 1JS4)



Hình 2.3. Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulase

1. Cắt đứt sự tương tác không cộng hóa trị trong cấu trúc tinh thể của cellulose (endocellulase). 2. Thủy phân của các sợi cellulose riêng rẽ để tạo thành các cấu trúc nhỏ hơn (exocellulase). 3. Thủy phân của disaccharides và tetrasaccharides thành glucose (beta-glucosidase).



2.2. Vi sinh vật sản xuất cellulase

Vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose chủ yếu là phân giải carbohydrate thường không sử dụng protein hay lipid làm nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng (Lynd LR và cộng sự, 2002). Trong số các vi sinh vật phân giải cellulose đáng chú ý nhất là vi khuẩn Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn). Hầu hết các loại nấm có thể sử dụng nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose (Poulsen OM & Petersen LW, 1988; Rajoka MI & Malik KA, 1997), trong khi ở các loài sống trong điều kiện kỵ khí thì có sự lựa chọn về nguồn carbohydrate, cellulose (Ng TK, & Zeikus JG, 1982; Thurston B và cộng sự, 1993). Khả năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại nấm, đặc điểm này được khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn. Nấm Trichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoại bào (Kumar R và cộng sự, 2008). Hầu hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose tập trung vào các loài nấm (Trichoderma, Humicola, Penicilium, Aspergillus, Actinomucor), vi khuẩn Pseudomonas, Cellulomonas, Actinomycetes và Streptomyces) (Bảng 2.1).

Trong một số loại nấm sử dụng cellulose làm nguồn carbon, chỉ có một vài chủng có khả năng tiết ra phức hơp các enzyme cellulose có thể ứng dụng trong thực tế để thuỷ phân cellulose. Bên cạnh T. reesei, một số loài nấm khác như Penicillium, Humicola và Aspergillus có khả năng sản xuất cellulase ngoại bào cao (Hayashida S và cộng sự, 1988; Ong LG và cộng sự, 2004).

Bảng 2.1. Các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất cellulose



Nhóm chính

Chi

Loài


Nấm

Aspergillus

A. niger

A. nidulans

A. oryzae

(Tái tổ hợp)

Fusarium

F. solani

F. oxysporum

Humicola

H. insolens

H. grisea

Melanocarpus

M. albomyces

Penicillium

P. brasilianum

P. occitanis

P. decumbans

Trichoderma

T. reesei

T. longibrachiatum

T. harzianum


Vi khuẩn

Acidothermus

A. cellulolyticus

Bacillus sp

Bacillus subtilis

Clostridium

C. acetobutylicum

C. thremocellum

Pseudomonas

P. cellulosa

Rhodothermus

R. marinus

Xạ khuẩn (Actinomycetes)

Cellulomonas


C. fimi

C.bioazotea

C.uda

Streptomyces


S. drozdowiczii

S. sp

S. lividans

Thermononospora

T. fusca

T. curvata

2.3. Các ứng dụng của cellulase

Trong những thập kỷ trở lại đây, một số điều tra ban đầu cho thấy cellulose được ứng dụng trong ngành công nghiệp thức ăn gia súc, thực phẩm, dệt may, chất tẩy rửa và công nghiệp giấy (Xia L & Cen P, 1999). Với tình trạng thiếu nguyên liệu hoá thạch hiện nay người ta đang quan tâm đến việc khai thác các nguồn sinh khối chứa lignocellulose bằng sử dụng cellulase và các enzyme khác.



2.3.1. Chất tẩy rửa và công nghiệp dệt may

Cellulase, đặc biệt là EG III và CBH I, thường được bổ sung trong các chất tẩy rửa, giũ hồ vải trong công nghiệp dệt may. Biến thể của EG III, đặc biệt từ T. reesei rất thích hợp cho việc sử dụng trong chất tẩy rửa (Nielsen JB, 1994; Clarkson KA và cộng sự, 2000). Cellulase có nguồn gốc từ Humicola có khả năng hoạt động dưới điều kiện kiềm nhẹ, nhiệt độ cao do đó thường được bổ sung vào bột giặt (Mitchinson C & Wendt DJ, 2001) và chất tẩy rửa (Uhlig H, 1998).



2.3.2. Công nghiệp giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhau chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì được giữ lại. Phương pháp thông thường là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một phương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần chlor tồn dư trong nước thải. Vì thế, trong những năm gần đây giải pháp mới được đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống là sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có cellulase để xử lý bột giấy.

Cellulase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời việc xử lý cellulase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004 và Hồ Sỹ Tráng, 2006). Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, cellulase được sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh (Howard RL và cộng sự, 2003).

2.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng trong quá trình chiết và lọc các loại nước ép trái cây, sản xuất mật hoa và súp đặc và trong chế biến dầu oliu (Galante YM và cộng sự, 1998). Trong công nghệ sản xuất bia, cellulase được bổ sung nhằm cải thiện sự tạo mạch nha của lúa mạch (Barbesgaard PO và cộng sự, 1984). Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, màu sắc rượu tạo đạt nhờ sử dụng enzyme ngoại bào hemicellulase và cellulase (Galante YM và cộng sự, 1998). Cellulase còn được sử dụng khai thác carotenoid trong sản xuất chất màu thực phẩm (Pajunen E, 1986).



2.3.4. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cốc thường chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thường không được tiêu hóa triệt để và làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung cellulase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2000).

Omogbenigun và cộng sự (2004) cho thấy, khi xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi bằng cách bổ sung tổ hợp chế phẩm cellulase và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) đã nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme cụ thể như sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% (Omogbenigun OF và cộng sự, 2004).

Tiềm năng ứng dụng to lớn của các enzyme thuộc nhóm cellulase trong chăn nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế phẩm như SSF của Mỹ hiện đang bán tại thị trường Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-cellulase (200 BGU/g), phytase (1000 PU/g), α-amylase (30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g), protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/g) (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn , 2006).

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi. Chu Thị Thanh Bình và cộng sự (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất xơ làm thức ăn cho gia súc (Chu Thị Thanh Bình và cộng sự, 2002).

2.3.5. Nhiên liệu sinh học

Nghiên cứu sử dụng các chất thải có chứa lignocellulose để sản xuất nhiên liệu sinh học đang được quan tâm. Các phế liệu có chứa lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú nhưng lại bị giới hạn do thiếu các yếu tố cần thiết như enzyme thủy phân cellulose và các quy trình công nghệ. Một ứng dụng tiềm năng khác của cellulase là việc chuyển đổi nguyên liệu cellulose thành glucose và các đường lên men khác.Mặc dù các vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase có khả năng chuyển đổi sinh khối tạo thành rượu đã được nghiên cứu (Martin JW, 1978; Kundu S và cộng sự, 1983) tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào thể hiện được hiệu quả khả thi về mặt kinh tế. Chiến lược sử dụng hiện tại trong sản xuất ethanol sinh học từ nguồn lignocellulosic một quá trình gồm nhiều bước nhằm loại bỏ phần dư lượng lignin và hemicellulase, xử lý cellulase ở 500C thuỷ phân các dư lượng cellulose để tạo ra đường lên men, và cuối cùng sử dụng lên men vi sinh vật để tạo ra cồn (Sudha Rani K và cộng sự, 1997). Việc sử dụng các enzyme tinh khiết trong chuyển đổi sinh khối thành ethanol hoặc lên men các sản phẩm hiện nay chưa đạt hiệu quả kinh tế do chi phí của các enzyme cellulase thương mại cao, chiến lược hiệu quả vấn đang tiếp tục được nghiên cứu.

Ngoài những ứng dụng phổ biến, cellulase còn được sử dụng trong các công thức để loại bỏ chất nhờn công nghiệp (Van Zessen E và cộng sự, 2003), nghiên cứu tạo ra các thế hệ (Wiatr CL, 1990), tạo thể kháng khuẩn chitooligosaccharide có thể được sử dụng trong bảo quản thực phẩm (Liu W & Zhu WM, 2000), tạo thuốc chống u bướu (Wu GJ & Tsai GJ, 2004).

2.3.6. Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh

Việc sử dụng enzyme trong xử lý chất thải có ý nghĩa quan trọng trong bảo vệ môi trường. Ngoài ra các sản phẩm chuyển hóa từ chất thải có thể sử dụng cho nhiều mục đích khác chẳng hạn như glucose, ethanol (bổ sung tài liệu tham khảo). Trong những năm gần đây, các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng để để xử lý rác thải sinh hoạt (bổ sung tài liệu tham khảo)

Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam (Nguyễn Lan Hương và cộng sự, 1999).

Nhiều chế phẩm vi sinh chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Chẳng hạn chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường (Lý Kim Bảng và cộng sự, 1999).

Ngoài ra, những nghiên cứu ảnh hưởng của cellulase đến nấm gây bệnh cây trồng như cellulase của Trichoderma harzianum đã được áp dụng để sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học (Cao Cường, Nguyễn Đức Lượng, 2003).

2.4. Tình hình nghiên cứu

2.4.1. Nghiên cứu trong nước

Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu được nhiệt độ 80oC, nhiệt độ lên men tối ưu từ 45oC đến 55oC, pH môi trường ban đầu thích hợp nhất khoảng 8,0. Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC, nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động học của quá trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48h lên men (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999).

Nguyễn Đức Lượng và cộngsự đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu các tác giả thấy rằng khả năng sinh tổng hợp cellulase của A. griseus rất cao và tối ưu ở 58oC, pH ban đầu là 6,7, độ ẩm ban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72h. Nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cưa (Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh, 1990). Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất (Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự, 1999).

Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tượng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủy cellulose cao và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đề được nhiều tác giả quan tâm. Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra được một số điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng nấm này (Đặng Minh Hằng , 1999). Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên cứu, tác giả đã tìm ra được một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thải công nghiệp như mật rỉ đường (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003).

Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao, Lý Kim Bảng và cộng sự đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm này được bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, một nửa thời gian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lượng mùn tạo thành của bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng và cộng sự, 1999).

2.4.2. Nghiên cứu trên thế giới

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch có thể thủy phân CMC (Carbomethyl cellulose), trấu, bã mía, và giấy vụn, trong đó CMC cho kết quả thủy phân tốt hơn. Hiệu suất thủy phân CMC tăng lên khi nồng độ CMC ngày càng tăng từ 5 – 50 g/l. Khi nồng độ CMC là 10g/l thì sản lượng đường khử và tốc độ sản sinh đường khử chỉ đạt được lần lượt là 5,531mg/l và 92,9 mg/l/h. Vả lại, việc phân lập vi khuẩn sinh H2 (mà chủ yếu là dòng Clostridium) đã được sử dụng để biến đổi sự thủy phân cellulose thành năng lượng H2. Với nồng độ đường khử ban đầu là 0,8 g/l, sản lượng và số lượng H2 lần lượt khoảng 23,8ml/l và 1,21 mmolH2/g đường khử (0,097 mmol H2/g cellulose) (Yung-Chung Lo và cộng sự, 2008).



Clostridium josui sp. nov. là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí bắt buộc, ưa ấm phát triển tốt nhất ở 45oC và pH = 7,0, là vi khuẩn tạo bào tử hình tròn được tìm thấy trong phân. Dòng này thủy phân cellulose nguyên thủy, trấu, và những nguyên liệu có chứa cellulose khác. Đây là dòng vi khuẩn sản xuất ethanol, acetate, butyrate, hydrogen, CO2 trong suốt quá trình phát triển trên môi trường cellulose và cellobiose (Jiraporn Sukhumavasi và cộng sự, 1988).

Chín dòng vi khuẩn phân hủy cellulose được phân lập từ trong nguồn đất, trong đó có một dòng là Cellolorimicrobium cellulans. Hoạt tính của enzim thủy phân cellulose (gồm cellulase và xylanase) được sản xuất từ những chủng này hiện diện chính là những enzim ngoại bào và những sản phẩm enzyme hoạt động độc lập với môi trường phát triển có celulose (xylan, trấu và cám) (Yung- Chung Lo và cộng sự, 2009).



PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Vật liệu

3.1.1. Đối tượng

Các chủng vi sinh vật được thu thập ở nguồn nước thải làng nghề giấy Phong Khê (Yên Phong – Bắc Ninh) tại 4 địa điểm xung quanh khu vực làng nghề.



3.1.2. Thiết bị

Các dụng cụ thiết bị của phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ vi sinh Khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Thiết bị bao gồm:



Bảng 3.1. Tên thiết bị dùng trong đề tài


Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Nước sản xuất

Tủ cấy vô trùng

JSR

Hàn Quốc

Tủ sấy dụng cụ

JSR

Hàn Quốc

Tủ ấm

JSR

Hàn Quốc

Tủ lạnh thường

LG

Việt Nam

Lò vi sóng

SANYO

Việt Nam

Máy đo PH

METTLER TOLEDO

Thụy Sỹ

Máy lắc lạnh

JSR

Hàn Quốc

Máy khuẩy từ gia nhiệt

VELP

Ý

Máy vortex

VELP

Ý

Máy sản xuất đá lạnh cho thí nghiệm

Evermed

Ý

Bể ổn nhiệt

JSR

Hàn Quốc

Máy đo quang phổ

Lamda – Scientific

Úc

Tủ sinh trưởng

JSR

Hàn Quốc

Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật

Memmert

Đức

Tủ lạnh sâu

Operon

Hàn Quốc

Máy lắc ấm

GFL

Đức

Máy lắc thường

JSR

Hàn Quốc

Máy ly tâm lạnh 13000 vòng/phút

Hettich

Đức

Cân kỹ thuật chính xác 0,01g

Mettler Toledo

Thụy Sỹ

Cân phân tích độ chính xác 0,1mg

Mettler Toledo

Thụy Sỹ

3.1.1. Hóa chất

Hóa chất được sử dụng bao gồm:

Bảng 3.2. Các hóa chất sử dụng trong đề tài

Hóa chất

Hãng sản xuất

Nước sản xuất

Yeast extract

Merck

Đức

Peptone

OXOID

Anh

Glycerol

Sigma

Mỹ

Beef extract

Becton Dickinson

Mỹ

CMC

Kanto Chemical

Nhật

Congo red

Merck

Đức

Agar




Trung Quốc

Ethanol




NaCl




CaCl2




KH2PO4




MgSO4.7H2O




Na2HPO4




FeSO4.7H2O




MnSO4.H2O




NH4NO3




3.2. Môi trường

Bảng 3.3. Thành phần môi trường



Tên môi trường

Thành phần môi trường (g/l)

Môi trường nuôi (Azhari và cộng sự, 2010) (1)

Yeast extract 2,0

Beef extract 4,0

Pepton 5,0

CMC 10,0


KH2PO4 1,0

MgSO4 0,2

CaCl2 3,0

Na2HPO4 0,111

pH 7,0


Môi trường chọn lọc (Nermeen và cộng sự, 2010) (2)

KH2PO4 1,0

MgSO4.7H2O 0,5

NaCl 0,5

FeSO4.7H2O 0,01

MnSO4.H2O 0,01

NH4NO3 0,3

CMC 10,0

pH 7,0


Môi trường chọn lọc có Agar

Thành phần môi trường (2)

Agar 12,0



Môi trường thử hoạt tính Cellulase ngoại bào

CMC 5,0

Agar 10,0




3.3. Các phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phân lập vi khuẩn từ dịch nước thải nhà máy giấy

  • Mục đích: Tách riêng từng tế bào vi khuẩn trong dịch nước thải để được dòng thuần.

  • Tiến hành:

Môi trường sau khi pha được đổ vào các bình trụ đem khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong vòng 20 phút. Môi trường có agar để nhiệt độ xuống khoảng 40oC – 45oC đem đổ vào các đĩa petri đã hấp khử trùng.

Nước thải chứa vi khuẩn sau khi thu về được nuôi cấy trong môi trường nuôi lỏng ở nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút. Sau 16 – 18h đem cấy chuyển lên môi trường chọn lọc có chứa agar. 100 μl dịch nuôi cấy cho vào 900 μl nước cất thu được nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục hút 100 μl dung dịch pha loãng vào 900 μl nước thu được nồng độ pha loãng 10-2 , lặp lại quá trình đến khi có nồng độ pha loãng 10-10. Dùng pipet hút một lượng từ 50µl – 100µl dung dịch pha loãng ở nồng độ 10-10 nhỏ lên bề mặt thạch. Sau đó hơ thật nóng que cấy để khử trùng, để nguội và trải đều khắp bề mặt thạch. Các đĩa thạch đã cấy trải được ủ ở 37oC, sau 24h đem quan sát. Các khuẩn lạc trên môi trường này tiếp tục được cấy chuyển nhiều lần để được khuẩn lạc đơn. Các thao tác cấy được thực hiện trong buồng cấy vô trùng.



3.3.2. Đánh giá đặc điểm hình thái

Sau khi có khuẩn lạc đơn, tiến hành nhuộm, soi kính để quan sát, đánh giá hình thái, chụp ảnh…



Mô tả hình thái khuẩn lạc: Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc có agar:

  • Hình thái khuẩn lạc: tròn, dạng amip, dạng rễ cây, dạng không đều.

  • Kích thước, đường kính khuẩn lạc.

  • Đặc tính quang học: trong, bán trong, long lanh, đục, huỳnh quang.

  • Mép khuẩn lạc: bằng phẳng, lượn sóng, có thùy, dạng rễ.

  • Mặt cắt ngang: phẳng, lồi, lõm giữa, ăn sâu vào thạch.

Quan sát tế bào: Nhằm xác định hình dạng, kích thước tế bào, các chủng vi khuẩn được cố định trên lam và quan sát dưới kính hiển vi soi dầu ở độ phóng đại 1000 lần .

3.3.3. Định tính cellulase bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ

  • Chuẩn bị:

Đệm phosphat 0.5 M pH 7,0

Dung dịch Congo đỏ 1%

NaCl 1M


  • Tiến hành:

Vi khuẩn sau khi phân lập được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc ở điều kiện 37oC trong 20h để tạo dịch enzyme.

Hút 70µl dịch enzyme nhỏ lên đĩa thạch đã đục lỗ trên môi trường thử hoạt tính, ủ ở điều kiện 30oC trong vòng 24h rồi đem ra nhuộm Congo đỏ.

Tiến hành nhuộm Congo đỏ: Đổ Congo đỏ 1% ngập đĩa thạch trong 15 phút, rồi chắt bỏ và tiếp tục nhuộm với NaCl 1M trong 15 phút. Vùng phân giải cellulose xuất hiện dưới dạng một vùng sáng trong trên nền đỏ của Congo.

Hoạt tính tương đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thước đường kính vòng phân giải cơ chất. Dhalo = D - d (với D là đường kính vòng ngoài và d là đường kính lỗ).



3.3.4. Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Miller

Hoạt độ celulase được xác định chính xác dựa vào lượng đường khử tạo thành sau phản ứng bằng phương pháp đo quang phổ theo Miller (1959).



  • Chuẩn bị:

Máy đo quang phổ

Đồ thị chuẩn

Ống nghiệm và các hoá chất cần thiết


  • Tiến hành:

Xây dựng đồ thị chuẩn:

Bảng 3.4. Xây dựng đồ thị chuẩn



Cho vào ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

Nước cất (µl)

1490

1450

1400

1300

1000

800

500

0

Dung dịch Glucose 7,5mM (µl)

10

50

100

200

500

700

1000

1500

Dung dịch thuốc thử (µl)

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

Lắc đều các ống nghiệm, đặt vào bể 1000C trong 10 phút, làm nguội đến to phòng

Bổ sung nước cất (ml)

7,5

7,5

7,5

7,5

7,5

7,5

7,5

7,5

Tổng thể tích (ml)

10

10

10

10

10

10

10

10

Nồng độ Glucose trong các ống nghiệm (µM)

50

250

500

1000

2500

3500

5000

7500

Đo quang phổ ở bước sóng 540 nm, cuvette 2 ml, đường kính cuvette 1 cm . Mẫu đối chứng tương tự chỉ thay dung dịch maltose chuẩn bằng nước cất. Giá trị OD540 của các mẫu được tính bằng OD540 mẫu – OD540 đối chứng. Xây dựng đường chuẩn dựa trên 8 điểm thu được, trong đó trục tung là giá trị OD540, trục hoành là hàm lượng glucose (M).



Xác định hoạt độ:

Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dịch enzyme được hút vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC, trong 0,5 ml đệm phosphate 0,01M, pH 7,0. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 37°C trong 20 phút, sau đó bổ sung ngay 1,0 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút.

Ống đối chứng: 0,5 ml dịch enzyme được hút vào ống nghiệm, 0,5 ml đệm phosphate 0,01 M, pH 7,0 đun sôi trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC 1,0 ml dung dịch thuốc thử DNS. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 37°C trong 20 phút, sau đó lấy ra và đun sôi cách thủy 5 phút.

Hỗn hợp sau phản ứng được đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 540 nm. Kết quả đo độ hấp thụ quang phổ được đối chiếu với đồ thị chuẩn glucose để suy ra lượng đường khử tương đương được giải phóng ra.

Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ quốc tế (U) được định nghĩa là lượng enzyme làm thủy phân cơ chất (CMC) thành đường khử tương đương 1 µM glucose trong một phút ở điều kiện thí nghệm.

3.3.5. Thu nhận enzyme

Dịch vi khuẩn được nuôi trong các bình tam giác 250ml ở điều kiện 37oC, 200 vòng/phút, sau 20h dịch vi khuẩn được ly tâm ở 15000g (g = 9,8 m/s2) trong 30 phút ở 4o độ C để loại tế bào. Dịch trong được tủa bằng ethanol với tỉ lệ 1:4 (v|v) ở 4oC. Tiếp tục ly tâm dịch tủa ở 10000g trong 15 phút, tủa được hòa tan trong đệm phosphat 0,01M. Ly tâm lại dịch tủa lần 2 ở 5000g trong 5 phút để thu được dịch enzyme sạch. Dịch enzyme sau đó được kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch và điện di SDS-PAGE.

Quá trình kết tủa chọn lọc cellulase được tóm tắt theo sơ đồ:

Hình 3.1. Thu nhận enzyme



3.3.6. Điện di SDS - PAGE

Khối lượng phân tử và độ tinh sạch của enzyme được đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide theo Laemmli (Laemmli U, 1970).



  • Chuẩn bị hóa chất:

Dung dịch acrylamide 30%, Dung dịch đệm: 1,5 M Tris-HCl, (pH=8,8 )+ 1,0 M Tris- HCl (pH= 6,8), Amonium persulfate (APS) 10%, SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate), Dung dịch Tetramehtylethyenediamine (TEMED), Dung dịch chạy điện di (1 lít): 6g Tris + 28,8 g Glycine + 1g SDS, Dung dịch nhuộm gel (100ml): 0,1g Coomassie Brilliant Blue R-250 + 50 ml metanol +10 ml acetic acid 100% + 40 ml nước cất, Dung dịch tẩy gel: 100 ml methanol + 70 ml acetic acid 100% + 830 ml nước cất.

  • Chuẩn bị mẫu enzyme điện di:

Dịch enzyme đã được tủa và tinh sạch. Pha mẫu tỷ lệ 1:1 (Sample buffer : mẫu)(20µl mẫu và 20µl Sample buffer). Lắc đều và đun cách thủy ở 95oC, 5 phút. Để nguội.

  • Chuẩn bị gel polyacrylamide:

Chuẩn bị hộp điện di gồm: Khuôn kính để đổ gel, lược cài và hộp điện di được rửa sạch và lau khô bằng cồn. Sau đó ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel.

Bảng 3.5. Thành phần gel điện di SDS - PAGE



Thành phần

V

% Acrylamide

Gel tách

Gel cô

12%

5%

H2O

(ml)

8,75

11,6

1,5 M Tris HCl pH 8,8

(ml)

6,25

0

0,5 M Tris HCl pH 6,8

(ml)

0

5

29: 1 Acrylamide: Bis

(ml)

10

3,33

10% APS

(µl)

130

60

TEMED

(µl)

20

20

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập vi khuẩn từ nguồn nước thải

Từ các mẫu nước thải thu thập được, chúng tôi tiến hành nuôi khởi động trên môi trường nuôi (Môi trường (1) – Bảng 3.2, Mục 3.2) nhằm tăng sinh khối các chủng vi sinh vật (Hình 4.1).




1



2


Hình 4.1. Hình ảnh các mẫu nước thải và dịch nuôi cấy

1. Các mẫu nước thải sau khi thu thập tại khu công nghiệp giấy Phong Khê.

2. Môi trường nuôi cấy khởi động.

10ml mẫu thu thập được nuôi trong 100ml môi trường nuôi ở điều kiện nhiệt độ 37oC, lắc 200 vòng/phút. Sau 5h bắt đầu được cấy trải trên môi trường chọn lọc có agar, ủ ở 37oC trong 30h. Môi trường chọn lọc chỉ có nguồn cơ chất duy nhất là CMC, nên chỉ có những vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulose mới có thể tạo khuẩn lạc. Tiếp tục chọn lọc, pha loãng và cấy chuyển nhiều lần để thu được khuẩn lạc đơn.

Sau quá trình chọn lọc, chúng tôi thu được 8 khuẩn lạc đơn (tương ứng với 8 chủng phân lập). Các chủng này được chuyển sang nuôi cấy lỏng trong môi trường chọn lọc (Bảng 3.2, Mục 3.2) ở điều kiện 37oC, lắc 200 vòng/phút. Sau thời gian 10h, 20h, 30h tiến hành thu dịch nuôi cấy, tính lượng đường khử sinh ra trong dịch nuôi cấy bằng phản ứng đường khử, đo mật độ quang học ở bước sóng 540 (OD540). Kết quả thu được như Bảng 4.1, Hình 4.2.
Bảng 4.1. Lượng đường khử sinh ra theo thời gian

Thời gian nuôi

Chủng vi khuẩn



10h

20h

30h

PK 2-6

0,044

0,114

0,109

PK 3-1

0,044

0,124

0,102

PK 3-2

0,010

0,013

0,013

PK 3-4

0,010

0,061

0,054

PK 3-6

0,010

0,069

0,057

PK 4-3

0,044

0,112

0,093

PK 4-8

0,044

0,118

0,096

PK 4-9

0,050

0,159

0,150


Hình 4.2. Đồ thị thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian

Trong cùng một điều kiện nuôi cấy, so sánh lượng đường khử sinh ra theo thời gian của các chủng vi khuẩn, nhận thấy tại thời điểm 20h lượng đường khử được tạo ra là nhiều nhất.

Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch để định tính hoạt tính enzyme cellulase, chúng tôi chọn được chủng PK 4 – 9 có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao nhất để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Hình 4.3, bảng 4.2).

Bảng 4.2. Hoạt tính cellulose ngoại bào của 8 chủng nghiên cứu

Chủng

Dhalo (mm)

PK 2-6*

3

PK 3-1

< 1

PK 3-2

< 1

PK 3-4

< 1

PK 3-6

< 1

PK 4-3

< 1

PK 4-8

< 1

PK 4-9

7

(*): Tên các chủng được đặt theo địa điểm, vị trí lấy mẫu và thứ tự chọn lọc khuẩn lạc.



Hình 4.3. Hoạt tính cellulase của 8 chủng nghiên cứu

ĐC: Nước cất.

PK*: 70µl dịch nuôi cấy trên môi trường chọn lọc lỏng ở điều kiện 37oC, lắc 200 vòng/phút, thu tại thời điểm 20h sau khi nuôi cấy.


: books -> luan-van-de-tai -> luan-van-de-tai-cd-dh
luan-van-de-tai-cd-dh -> Thế kỷ 21, cùng với sự phát triển nh­ vũ bão của khoa học kỹ thuật, của công nghệ thông tin. Sự phát triển kinh tế tác động đến tất cả mọi mặt đời sống kinh tế xã hội
luan-van-de-tai-cd-dh -> VIỆN ĐẠi học mở HÀ NỘi khoa công nghệ thông tin đỒ Án tốt nghiệP ĐẠi họC
luan-van-de-tai-cd-dh -> Phần một : Tình hình thu hút vốn đầu tư trên thị trường vốn việt nam hiện nay
luan-van-de-tai-cd-dh -> TRƯỜng đẠi học cần thơ khoa công nghệ BỘ MÔN ĐIỆn tử viễn thôNG
luan-van-de-tai-cd-dh -> Em xin chân thành cảm ơn! Vị Xuyên, ngày 19 tháng 5 năm 2012 sinh viêN
luan-van-de-tai-cd-dh -> PHẦn I mở ĐẦu tầm quan trọng và SỰ ra đỜi của giấY
luan-van-de-tai-cd-dh -> Đề tài: Tìm hiểu về vấn đề sử dụng hợp đồng mẫu trong đàm phán ký kết hợp đồng mua bán ngoại thương và thực tiễn ở Việt Nam
luan-van-de-tai-cd-dh -> Đề tài phân tích thực trạng kinh doanh xuất khẩu cà phê nhân của các doanh nghiệP
luan-van-de-tai-cd-dh -> Giao tiếp máy tính và thu nhận dữ liệU ĐỀ TÀI: TÌm hiểu công nghệ 4g lte


  1   2


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương