TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN



tải về 0.74 Mb.
trang1/14
Chuyển đổi dữ liệu13.08.2016
Kích0.74 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   14
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Đặng Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN

QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI



TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Đặng Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN

QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH HƯƠNG

Hà Nội - 2013



LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phan Lê Thanh Hương, Trưởng Khoa Vi Khuẩn, Trưởng Phòng Vi khuẩn hô hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thanh Thủy – Trưởng Khoa An toàn sinh học - Quản lý chất lượng, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương và tập thể Khoa đã tạo mọi điều kiện về thời gian cho tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Vi khuẩn hô hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương học đã chỉ bảo, giúp đỡ, chia sẻ tận tình cho tôi những kinh nghiệm chuyên môn trong quá trình làm thực nghiệm.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, các cô trong Khoa sinh học, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn luôn động viên tinh thần để tôi hoàn thành luận văn này.




Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Học viên

Đặng Thị Kiều Oanh

MỤC LỤC

Capsular polysaccharide 9

Deoxyribonucleic acid 9

Polymerase chain reaction 9

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis.suis 3

1.1.1. Giới thiệu chung 3

1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán 5

1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis 7

1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis 15

1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG 19

1.3.1. Đường lây truyền 19

1.3.2. Triệu chứng 20

1.3.3. Biện pháp phòng bệnh 21

1.3.4. Biện pháp chống dịch 22

1.3.5. Nguyên tắc điều trị 22

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM 22

1.4.1. Nuôi cấy phân lập 23

1.4.2. Nhuộm Gram 23

1.4.3. Phản ứng catalase 23

1.4.4. Xét nghiệm định danh, định typ: 23

1.4.5. Phát hiện vi khuẩn S. suis bằng phản ứng Realtime PCR 24

1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR 25

1.5.1. Giới thiệu về phương pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction – PCR) 25

1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR 25

1.5.3. Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi 29



CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35

2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 35

2.1.2. Dịch não tủy nền 35

2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài): 36

2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu: 36

2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ 39

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 39

2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng 39

2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn 45

2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt 47

2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia phản ứng 48

2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi. 49

2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S. suis 49

2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis 50

2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP 51

2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tính và âm tính 51

2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4] 52



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN 54

3.1.1. Tạo bệnh phẩm mô phỏng 54

3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: 55

3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 57

58


58

3.1.4. Tối ưu hóa các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 59

61

62


3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR được xây dựng (khả năng lặp lại kết quả) 64

Độ lặp lại của kỹ thuật 65

(10 lần thử nghiệm) 65

1 65


0/10 65

3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu) với những vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis 65

3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI) 66

3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 71

3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định được vi khuẩn từ bệnh phẩm: 71

3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phương pháp 72



KẾT LUẬN 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử 3

(http://genome.jgi-psf.org/strsu/strsu.home.html) 3

Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa 4

Hình 1.3. Bệnh nhân bị nhiễm S. suis (http://www.pig333.com/what_the_experts_say/streptococcus-suis-zoonotic-epidemic-in-asia_4091/) 21

Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR 26

(http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml) 26

Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8) 55

Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ hợp 16) 56

Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện trực tiếp S. suis trong bệnh phẩm 59



Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lượng các mồi với nồng độ mỗi mồi là 20pmol/µl 61

Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lượng mồi với nồng độ mồi khác nhau 62

Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 63

với các thể tích mẫu khác nhau 63

Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi PCR đa mồi đã hoàn thiện (kết quả với bệnh phẩm mô phỏng) 64

Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp gen mồimồi & quy trình PCR đa mồi 65

Hình 3.9. Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 850C và 900C trong 60 phút 68

Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800C với thời gian ủ khác nhau 68



Hình 3.11. Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ 800C/60’ 69

Hình 3.12. Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở 800C/60’(đánh giá bởi PCR đơn mồi) 70

Hình 3.13. Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đã được xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 71

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis 4

Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong nghiên cứu [11,25,39,41] 38

Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm 45

Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được thử nghiệm 47

Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số 52

Bảng 2.4. Mức độ LR+, LR - liên quan đến khả năng mắc bệnh và không mắc bệnh 53

Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm mẫu 54

Bảng 3.2. Các tổ hợp mồi thích hợp được lựa chọn trong thí nghiệm 56

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các chu trình PCR đến khả năng phát hiện S.suis 57

Bảng 3.4. Khả năng phát hiện vi khuẩn và các yếu tố độc lực khi thay đổi điều kiện quy trình PCR đa mồi 58

Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi được khảo sát 59

Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu bệnh phẩm 64

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý bệnh phẩm dùng/không dùng kit 66

Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so với phương pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144 72

Bảng 3.9. So sánh kết quả ba hai phương pháp: PCR đơn mồi, đa mồi và nuôi cấy phân lậpNCPL 73

Bảng 3.10. Các chỉ số đánh giá độ chính xác và sự hữu ích của phương pháp PCR đa mồi và nuôi cấy phân lập (n=153) 73


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bbp

Base pair

C (-) 

Chứng âm

C (+)

Chứng dương

Cps

Capsular polysaccharide


DNA

Deoxyribonucleic acid


DNT

Dịch não tủy

Eef

Extracellular factorr

Mrp

Muramidase-released protein

NCPL

Nuôi cấy phân lập

PCR

Polymerase chain reaction




Phản ứng

Sly

Suiis lysin

S.suis

Streptococcus suis

VMN

Viêm màng não

VK

Vi khuẩn













: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   14


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương