NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH HƯƠNG
Capsular polysaccharide 9
Deoxyribonucleic acid 9
Polymerase chain reaction 9
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis.suis 3
1.1.1. Giới thiệu chung 3
1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán 5
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis 7
1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis 15
1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG 19
1.3.1. Đường lây truyền 19
1.3.2. Triệu chứng 20
1.3.3. Biện pháp phòng bệnh 21
1.3.4. Biện pháp chống dịch 22
1.3.5. Nguyên tắc điều trị 22
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM 22
1.4.1. Nuôi cấy phân lập 23
1.4.2. Nhuộm Gram 23
1.4.3. Phản ứng catalase 23
1.4.4. Xét nghiệm định danh, định typ: 23
1.4.5. Phát hiện vi khuẩn S. suis bằng phản ứng Realtime PCR 24
1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR 25
1.5.1. Giới thiệu về phương pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction – PCR) 25
1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR 25
1.5.3. Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi 29
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 35
2.1.2. Dịch não tủy nền 35
2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài): 36
2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu: 36
2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ 39
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 39
2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng 39
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn 45
2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt 47
2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia phản ứng 48
2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi. 49
2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S. suis 49
2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis 50
2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP 51
2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tính và âm tính 51
2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4] 52
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN 54
3.1.1. Tạo bệnh phẩm mô phỏng 54
3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: 55
3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 57
58
58
3.1.4. Tối ưu hóa các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến 59
61
62
3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR được xây dựng (khả năng lặp lại kết quả) 64
Độ lặp lại của kỹ thuật 65
(10 lần thử nghiệm) 65
1 65
0/10 65
3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu) với những vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis 65
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI) 66
3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 71
3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định được vi khuẩn từ bệnh phẩm: 71
3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phương pháp 72
KẾT LUẬN 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 79
Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử 3
(http://genome.jgi-psf.org/strsu/strsu.home.html) 3
Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa 4
Hình 1.3. Bệnh nhân bị nhiễm S. suis (http://www.pig333.com/what_the_experts_say/streptococcus-suis-zoonotic-epidemic-in-asia_4091/) 21
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR 26
(http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml) 26
Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8) 55
Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ hợp 16) 56
Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện trực tiếp S. suis trong bệnh phẩm 59
Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lượng các mồi với nồng độ mỗi mồi là 20pmol/µl 61
Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lượng mồi với nồng độ mồi khác nhau 62
Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 63
với các thể tích mẫu khác nhau 63
Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi PCR đa mồi đã hoàn thiện (kết quả với bệnh phẩm mô phỏng) 64
Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp gen mồimồi & quy trình PCR đa mồi 65
Hình 3.9. Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 850C và 900C trong 60 phút 68
Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800C với thời gian ủ khác nhau 68
Hình 3.11. Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ 800C/60’ 69
Hình 3.12. Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở 800C/60’(đánh giá bởi PCR đơn mồi) 70
Hình 3.13. Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đã được xây dựng trên mẫu bệnh phẩm 71