TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN



tải về 414.57 Kb.
trang1/3
Chuyển đổi dữ liệu13.08.2016
Kích414.57 Kb.
#18271
  1   2   3
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Dương Thị Giang


PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI



TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Dương Thị Giang


PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. BS Trần Huy Thịnh

2. PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - Năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã hết lòng tạo điều kiện để chúng tôi có thể học tập tốt và đạt được những thành quả như ngày hôm nay.

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.BS Trần Huy Thịnh, Phó trưởng Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học khoa Học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, cùng toàn thể nhân viên trong Trung tâm đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Khoa Xét Nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, cùng các anh chị em trong Khoa đã giúp đỡ cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn.

Và cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và những người bạn đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2015

Dương Thị Giang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CYP Cytochrome P450

CYP21 Cytochrome P450 21(steroid 21- hydroxylase)

DNA Deoxyribonucleic acid

DOC Deoxycorticosterone

E Exon

I Intron


Ig2 Đột biến điểm ở intron 2( 656A/C →G)

HLA Human leukocyte antigen

KCĐ Không cổ điển

MM Mất muối

MHC Major histocompatibility complex

MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification

NHĐT Nam hóa đơn thuần

PCR Polymerase Chain Reaction

Stop codon Mã kết thúc

TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh

3β- HDS 3β- hydroxysteroid dehydrogennase

17-OHP 17 – hydroxyprogesteron

21-OH 21- hydroxylase

∆8bp Mất 8bp ở exon 3




MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE 4

1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS 4

1.2. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 5

1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới 5

1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam 6

1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 7

1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS 8

1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS 9

2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 11

2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS 11

2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 11

2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 12

2.2. Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS 14

2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử 15

2.4. Phát hiện người lành mang gen bệnh 16

3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 17

3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng 17

3.1.1. Chẩn đoán xác định 17

3.1.2. Chẩn đoán phân biệt 18

3.2. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 19

3.2.1. Kỹ thuật PCR 19

3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) 20

3.2.3. Kỹ thuật Souther blot 21

3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 21

CHƯƠNG 2 25

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1. Đối tượng nghiên cứu 25

2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 25

2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị 25

2.2.2. Hoá chất 25

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

2.4. Đạo đức trong nghiên cứu 27

2.5. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang. 28

2.5.1. Thiết kế nghiên cứu 28

2.5.2 Tiến hành xét nghiệm 28

Chương 3 35

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

3.1. Kết quả tách chiết DNA 35

3.2. Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh 37

KẾT LUẬN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55



PHỤ LỤC
danh MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH trên thế giới 8

Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [4],[35],[39] 13

Bảng 1.3. Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR
trong Kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) 23

Bảng 3.1. Các thành viên trong gia đình bệnh nhân 37

Bảng 3.2. Kiểu đột biến gen của bệnh nhân và thành viên gia đình 37



danh MỤC hình

Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu hụt enzym [35] 8

Hình 1.2. Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 [19] 11

Hình 1.3. Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 [18] 12

Hình 1.4. Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường 14

Hình 1.5. Phả hệ của một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường (Autosome Recessive) 15

Thế hệ I, II, không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh. 15

Hình 1.6. Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các thể bệnh và người mang gen dị hợp tử [36]. 16

Hình 1.7. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR 20

Hình 1.8. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA 22

Hình 1.9. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 24

Hình 1.10. Hình ảnh minh họa kết quả MLPA 24

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28

Hình 2.2. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 [4] 32

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm 35

Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số 36

Hình 3.3. Phả hệ gia đình số 01 40

Hình 3.4. Kết quả MLPA gia đình mã số 01 41

Hình 3.5. Phả hệ gia đình số 02 42

Hình 3.6. Kết quả MLPA của gia đình mã số 02 43

Hình 3.7. Phả hệ gia đình số 03 44

Hình 3.8. Kết quả MLPA của gia đình mã số 03 45

Hình 3.9. Phả hệ gia đình số 04 46

Hình 3.10. Kết quả MLPA của gia đình mã số 04 47

Hình 3.11. Phả hệ gia đình số 05 48

Hình 3.12. Kết quả MLPA của gia đình mã số 05 50

Hình 3.13. Phả hệ gia đình số 06 51

Hình 3.14. Kết quả MLPA của gia đình mã số 06 52


MỞ ĐẦU
Tăng sản thượng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia - CAH) là bệnh gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham gia vào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận; trong đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất và chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp theo là thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm 5 - 9%, còn lại là các thể bệnh rất hiếm gặp do thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α-hydroxylase và 20, 22- desmolase [1].

Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền đơn gen lặn, trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2 gây nên. Đối với thể nặng, nếu bệnh không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến cơn suy thượng thận cấp và bệnh nhân có thể tử vong. Các thể bệnh khác có thể dẫn đến nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; do đó bệnh ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh sản, tâm lý của người bệnh và gia đình [6].

Sự phát triển và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, giải trình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification)… đã phát hiện được hầu hết các đột biến gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, các dạng đột biến mất đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% các trường hợp [25]. Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh bằng cách xác định các đột biến đặc trưng của từng thể bệnh. Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng như: mất đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm mất hoàn toàn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây ra những thể bệnh nặng và hay gặp ở thể mất muối. Đột biến sai nghĩa như I172N làm giảm hoạt tính enzym 21-hydroxylase chỉ còn 1 - 2% so với bình thường gặp ở thể nam hoá đơn thuần hay P30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase chỉ còn 20 - 50% so với bình thường gặp ở thể bệnh không điển hình. Xác định chính xác các dạng đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán sớm và có những biện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm những tác động của việc thiếu hụt enzym 21 - hydroxylase đối với bệnh nhân. Bên cạnh đó việc xác định người lành mang gen sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh giúp giảm tỷ lệ sinh ra những đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơ sinh để quản lý và chăm sóc tốt những trẻ có nguy cơ cao bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh trong cộng đồng.

Các đột biến mất đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, là dạng đột biến gây ra thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán chính xác và kịp thời. Tuy nhiên, các dạng đột biến này rất khó xác định bằng các kỹ thuật PCR thông thường. Gần đây, kỹ thuật MLPA là một phương pháp mới với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản và độ nhạy cao đã phát hiện chính xác các dạng đột biến này trên gen CYP21A2. Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA vẫn chưa được khai thác nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là trong việc xác định người lành mang gen gây các bệnh di truyền. Chính vì vậy nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen và cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA với mục tiêu:

Phát hiện người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE

1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS

Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinh dục- thượng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, do sự thiếu hụt các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận. Trong đó, sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) là hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp đến là sự thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase (11- OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), 17α- hydroxylase (17- OH) và ít gặp hơn là sự thiếu hụt 20 - 22 desmolase [35].

Sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase dẫn đến sự tổng hợp cortisol và phần lớn aldosterron của tuyến thượng thận bị suy giảm, gây tăng tiết Adreno Corticotropin Hormon (ACTH) tuyến yên, tăng sản vỏ thượng thận và sản xuất thừa androgen.

Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện ở các mức độ nặng hay nhẹ khác nhau. Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thượng thận cấp và cường androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase ở mức độ vừa phải (1 - 3%) sẽ biểu hiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cường androgen và khi enzym 21- hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) sẽ xuất hiện thể bệnh không cổ điển [15].

1.2. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS

1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới

Theo y văn, trường hợp bệnh TSTTBS đầu tiên trên thế giới được mô tả bởi nhà giải phẫu học De Crecchico vào năm 1865.

Đầu thế kỷ 19, Emil Huschke, một nhà giải phẫu và phôi thai học, đã phân biệt vỏ và tủy thượng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan giữa tuyến thượng thận và tuyến sinh dục [8]. Bệnh nhân TSTTBS thể mất muối đầu tiên được Butler (1939) và Wilkins (1940) mô tả. Năm 1950 - 1951, Wilkins, Bartter và cộng sự đã chứng minh rằng việc sử dụng cortisol có thể ức chế sự tổng hợp thừa androgen trong hội chứng sinh dục - thượng thận do TSTTBS [9]. Trong giai đoạn này, các nhà nghiên cứu đã xác định 6 steroid vỏ thượng thận có tác dụng sinh học, chúng được tổng hợp từ cholesterol và được chia thành 3 nhóm: (i) Steroid chuyển hóa muối gồm DOC, corticosteron và aldosteron; (ii) Steroid chuyển hóa đường gồm hydrocortisone, cortisol; (iii) Steroid sinh dục nam (androgen) gồm dehydroepiandrosteron và androstendion [10].

Từ những năm 1970, nghiên cứu và định lượng 17- OHP, một tiền chất trực tiếp tạo ra cortisol, được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh TSTTBS. Năm 1979 - 1980, Migeon và Rosenwaks hoàn chỉnh tiêu chuẩn chẩn đoán hóa sinh của bệnh TSTTBS: do thiếu enzym 21- OH gây tích tụ các tiền chất trước chỗ ứ đọng chuyển hóa bao gồm 17- OHP và progesteron, dẫn đến tăng tổng hợp testosteron ở vỏ thượng thận, nồng độ testostrron trong máu tăng và sản phẩm đào thải của testosteron trong nước tiểu là 17- Cetosteroid (17-CS) tăng. Nồng độ 17- OHP tăng cao trong máu là tiêu chuẩn có giá trị đặc hiệu để chẩn đoán TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH.

Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã được nhận biết từ những năm 1930 và được mô tả chi tiết bởi Knudson năm 1951, đó là bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên nhiễm sắc thể thường. Năm 1977, Dupont thông báo bản đồ gen và sự liên kết gần giữa TSTTBS và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC). Sau đó, Komainami phân lập được Cytochrome P450c21 là chuỗi peptid đơn. Năm 1982 - 1983, O’ Neill và Fleishwicle phát hiện sự liên quan giữa gen CYP21 với MHC nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37].

Năm 1984, Hite và cộng sự đã xác định được gen CYP21A2 và giả gen CYP21A2P có kích thước 3,4 kb; nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, bên trong phức hợp MHC cùng với các gen C4 bổ thể [27].

Năm 1986, Higashi và cộng sự đã phân tích trình tự nucleotid toàn bộ gen CYP21A2 và giả gen CYP21A2P. Sau đó, các đột biến điển hình của gen CYP21A2 đã được tìm thấy, chúng được coi là nguyên nhân chính gây thiếu hụt enzym 21- OH [23].

Phương pháp lai Southern blot do Edward Southern đề xuất năm 1975 đã được nhiều tác giả sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen CYP21A2 thường gặp [24].

Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với một số kỹ thuật sinh học phân tử khác như giải trình tự gen, hầu hết các đột biến của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS đã được phát hiện [26].

1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam

Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh TSTTBS. Các công trình nghiên cứu có thể kể đến như:

Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn và cộng sự đã tổng kết 36 bệnh nhân mắc hội chứng sinh dục - thượng thận trong giai đoạn 1981 - 1990, chiếm tỷ lệ 1,9% tổng số bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% [9].

Năm 1994, nhóm nghiên cứu Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thu Nhạn đã tổng kết chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS. Chẩn đoán dựa vào lâm sàng và xét nghiệm hóa sinh progesteron, testosteron, cortisol, Follice Stimulating Hormon (FSH), Luteinizing Hormon (LH), điện giải đồ, 17 Cetosteroid (17- CS) và 17 – Hydroxycetosteroid (17- OHCS); điều trị bệnh bằng prednisolone và nước muối đường với thể mất muối [8].

Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ và cộng sự công bố nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH ở 43 bệnh nhân khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương 1989 - 1997. Nghiên cứu đưa ra các dấu hiệu lâm sàng và giới hạn giá trị của 17- OHP, progesteron và testosteron giúp chẩn đoán và sử dụng Hydrocortison và Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả đã sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện đột biến [3].

Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH [7].

Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hưởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia đình và bệnh nhân [2].

Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH và phát hiện người lành mang gen bệnh [4].

Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và một số yếu tố ảnh hưởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương nhận thấy bệnh gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là chiều cao [1].

Nhìn chung, ở Việt Nam những nghiên cứu về lâm sàng và ảnh hưởng tâm lý của gia đình và bệnh nhân là phổ biến, chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh học phân tử bệnh TSTTBS.

1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

Tần suất mắc bệnh trên thế giới là 1/10.000 - 1/15.000. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở hai quần thể người Eskimo Yupik (Alaska) và La Réunion (Pháp) với tần suất 1/282 và 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh ở châu Âu là 1/14.000 [28].

Một nghiên cứu của Nhật tại thành phố Sapporo năm 1982 - 2005 đưa ra tỷ lệ mắc bệnh TSTTBS là 1/19.634 và tỷ lệ các kiểu hình theo thứ tự thể MM : thể NHĐT : thể không điển hình là 16 : 4 : 2.

Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ được chẩn đoán mới, chiếm tỷ lệ 60,7% các bệnh lý tuyến thượng thận và chiếm 2% các bệnh lý di truyền vào điều trị tại khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17].
Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH trên thế giới


STT

Tên nước

Tần suất

1

Alaska,Yupik Eskimos

1/ 280

2

Pháp (đảo Reunion)

1/2100

3

Thụy Điển

1/9800

4

Mỹ ( Bang Wisconsin)

1/11.000

5

Pháp ( thành phố Lille)

1/13.000

6

Nhật

1/18.000

7

Ý

1/18.000

1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS

Khi thiếu enzym, một hay nhiều con đường tổng hợp hormon bị tắc nghẽn và hormon dưới chỗ tắc không được sản xuất đủ, đặc biệt là cotisol. Cơ chế điều hòa ngược (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH, gây tăng sản tuyến thượng thận, kích thích các tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26].

Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu hụt enzym [35]

Thiếu hụt enzym 21-OH sẽ gây giảm tổng hợp cortisol, tăng các tiền thân của cortisol như 17- hydroxyprogesteron (17-OHP) và progesteron, tăng các hormon sinh dục vỏ thượng thận như dehydroepiandrosterone (DHEA), D4 androstenedion và testosteron (T) gây nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai. Trong khi đó việc thiếu hoàn toàn enzym 21-OH gây giảm aldosteron làm mất natri qua nước tiểu, giảm khối lượng tuần hoàn (hội chứng mất muối) [35].

1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS

Sự thiếu hụt enzym 21- OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt aldosteron cũng như thừa androgen thượng thận. Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt của 21- OH mà sự biểu hiện lâm sàng của TSTTBS được chia thành 3 thể khác nhau bao gồm:

Thể mất muối

Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể cổ điển sẽ dẫn đến suy giảm trầm trọng khả năng hydroxyl hóa để chuyển progesterone thành 11- deoxycorticosteron, do đó không thể tổng hợp đầy đủ aldosteron và cortisol trong máu. Ngoài ra, các tiền chất steroid trước chỗ tắc được tích lũy tăng cao là progesteron và 17- OHP có thể hoạt động như là các chất đối kháng trực tiếp các thụ thể hormon chuyển hóa muối và làm tình trạng thiếu aldosteron trầm trọng hơn [26].

Dấu hiệu xuất hiện sớm là nôn, tiêu chảy dẫn đến mất muối, mất nước và sụt cân. Nếu không được điều trị, cơn suy thượng thận nhanh chóng nặng lên với các dấu hiệu mắt trũng, da nổi vân tím, trụy tim mạch và có thể ngừng tim do kali máu tăng cao dẫn đến tử vong.

Dấu hiệu nam hóa là do tăng testosteron:

+ Ở trẻ gái, ngay khi đẻ xuất hiện âm vật to, có khi to như dương vật, các môi có thể dính với nhau nhiều hay ít, lỗ niệu đạo có thể ở ngay dưới âm vật, làm cho dễ chẩn đoán nhầm với tật lỗ đái thấp. Nếu không được điều trị, biểu hiện nam hóa ngày càng rõ: trẻ mọc lông mu, lông nách, trứng cá, cơ bắp phát triển, lớn nhanh nhưng trẻ sẽ lùn ở tuổi trưởng thành và đạt chiều cao tối đa khoảng 140  150 cm, hình dáng đàn ông, vai rộng, hông hẹp, tuyến vú kém phát triển kèm theo rối loạn kinh nguyệt [26].

+ Ở trẻ trai, biểu hiện giả dậy thì sớm: mọc lông mu, lông nách, mọc trứng cá, giọng trầm, dương vật to nhanh và cương cứng, nhưng tinh hoàn vẫn nhỏ tương ứng với tuổi thực của trẻ. Chiều cao và tuổi xương phát triển nhanh và mạnh, kết thúc sớm khi trẻ khoảng 8  10 tuổi [26].

Thể nam hóa đơn thuần

Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- OH mức độ vừa phải (1 - 3%), quá trình tổng hợp cortisol và aldosteron vẫn xảy ra.

Ở trẻ gái, biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài (giả lưỡng tính). Do rối loạn tổng hợp các steroid xảy ra sớm từ giai đoạn bào thai vào tuần thứ 7- 8 của thai kỳ nên biểu hiện nam hóa thường ngay sau sinh: âm vật to, môi lớn dính vào nhau, lỗ niệu đạo ở ngay dưới âm vật..., sau đó các biểu hiện nam hóa ngày càng rõ nếu trẻ không được điều trị sớm.

Ở trẻ trai, thường ít có biểu hiện nam hóa lúc được sinh ra (cường androgen). Cũng như trẻ gái, biểu hiện cường androgen ở trẻ nam diễn ra nhanh bắt đầu từ 2- 3 tuổi gồm các dấu hiệu dậy thì sớm như mọc lông mu, lông nách, sau đó mọc trứng cá và giọng trầm. Dương vật to nhanh, thường cương cứng, tinh hoàn nhỏ so với tuổi [8], [26].

Thể không cổ điển

Đây là thể nhẹ nhất, hoạt độ enzym 21-OH chỉ giảm nhẹ, còn khoảng 20-50% so với bình thường và nồng độ androgen máu tăng nhẹ nên không đủ gây nam hóa ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai sau sinh.

Bệnh xuất hiện muộn, triệu chứng xuất hiện ở tuổi dậy thì và thường được phát hiện ở nữ do nồng độ androgen cao hơn bình thường, còn ở nam giới, ảnh hưởng này không đáng kể vì ở lứa tuổi này, nồng độ testosterol đã tăng bài tiết. Trẻ em nữ sẽ có biểu hiện: tuyến vú kém phát triển, mọc trứng cá, rậm lông, rối loạn kinh nguyệt, thiểu kinh và có thể vô kinh [8], [26].


2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS

2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS

2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21

Vị trí gen CYP21

Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A2P, cả hai cùng nằm bên trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn của NST số 6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ thể [18], [40].



Hình 1.2. Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 [19]


Cấu trúc gen CYP21

Gen mã hóa cho enzym 21- OH của vỏ thượng thận là gen CYP21A2, có kích thước 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), trong vùng phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex-MAC) (cạnh gen HLA). Gen CYP21A2 và gen tương đồng của nó, CYP21A2P, nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B. Mỗi gen CYP21A2CYP21A2P bao gồm 10 exon trình tự nucleotide của hai gen này tương đồng 98% trong các exon và khoảng 96% trong các intron do vậy trong quá trình phân bào giảm nhiễm có thể do sự đột biến mất đoạn giữa hai allen hoặc nhân đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu trúc của gen CYP21A2 bị thay thế một đoạn của giả gen CYP21A2P hoặc gây mất đoạn của gen CYP21A2P. Các thay đổi này gây nên sự bất hoạt của gen CYP21A2 bình thường và gây nên tình trạng bệnh lý [26],[41].


Hình 1.3. Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 [18]



Chức năng gen CYP21

Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trò phiên mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các intron nối chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phân tử này sẽ được sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH [20].


2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS

Hai gen CYP21A2 và CYP21A2P có trình tự tương đồng nhau. Trình tự của gen giả CYP21A2P có các loại đột biến thường thấy trên bệnh nhân TSTTBS. Điều này có thể giải thích là do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể dẫn tới việc các trình tự ở vùng gen giả CYP21A2P chuyển sang CYP21A2 gây nên đột biến gen CYP21A2. Theo thống kê, 95% các đột biến trên gen CYP21A2 là do chuyển đoạn từ gen giả CYP21A2P, 5% còn lại là do gen CYP21A2 bị đột biến. Các đột biến thường gặp trên gen CYP21A2 là xóa đoạn hoặc chuyển đoạn lớn (Large deletion/convertion), IVS- 13A/C → G, I172N. Ngoài ra còn có các đột biến Q138X, R365W, R473W, P30L, del- 8 bp cũng có tỷ lệ tương đối cao [28].


Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [4],[35],[39]

Đột biến

Vị trí nucleotide

Exon/Intron

Tỷ lệ %

Kiểu hình

Mất đoạn gen







25-30

MM

Pro30Leu

89C→T

exon 1

5-10

KCĐ

I2g

656A/C→G

I2

20-25

MM- NHĐT

Mất 8bp

∆708-715

E3

5-10

MM

Ile 172Asn

1001T→A

E4

5-10

NHĐT

Ile236Asn,

Val237Glu,

Met239Lys


1382T→A,

1385T→A,


1391T→A

E6

5-10

MM

Val281Leu

1685G→T

E7

5-10

KCĐ

Phe306+1nt

1759+T

E7

<5

MM

Gln318Stop

1996C→T

E8

5-10

MM

Arg356Trp

2110C→T

E8

10

MM



Các nucleotid được đánh số bắt đầu từ nucleotid A trong mã ATG đầu tiên của trình tự mã hóa. Các intron cũng được tính.


  • Mất đoạn và chuyển đoạn gen lớn 30kb

Thông thường các mất đoạn có chiều dài khoảng 30kb từ vị trí giữa exon 3 và 8 của gen CYP21A2P xuyên qua gen C4B đến vị trí tương ứng ở trên gen CYP21A2. Kết quả là gen đơn CYP21A2 còn lại với đầu tận cùng 5’ tương ứng CYP21A2P và đầu 3’ tương ứng CYP21A2. Mất đoạn ngăn cản sự tổng hợp protein và phá hủy tất cả hoạt tính enzym 21- hydroxylase [25]. Trao đổi chéo không tương xứng có thể xảy ra bất cứ vị trí nào bên trong đơn vị RCCX (kích thước 30 kb) bao gồm gen RP, C4, CYP21A2, TNX và tạo nên các nhiễm sắc thể có 1 hoặc 3 bản sao đơn vị 30 kb này. Các vị trí trao đổi chéo nằm trong hay ở đầu 3’ của CYP21A2 gây thiếu hụt enzym 21- hydroxylase.


  • Đột biến mất đoạn 8 bp trên exon 3

Đột biến mất đoạn 8 bp trên exon 3 (có trình tự GAGACTAC) xuất hiện do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp NST dẫn tới việc các trình tự vùng giả gen sẽ chuyển sang gen CYP21A2 gây nên hiện tượng lệch khung dịch mã và làm ngừng quá trình dịch mã sớm. Kết quả là không tổng hợp được enzym 21-OH và theo cơ chế đã trình bày ở trên, gây nên thể mất muối trên lâm sàng [24]. Hoạt tính enzym 21-OH trong đột biến mất 8 bp trên exon 3 đã được chứng minh trên thực nghiệm là 0% [35].

2.2. Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS

TSTTBS do thiếu enzym 21- OH là một bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên NST thường nên tuân theo quy luật di truyền Mendel. Bệnh chỉ xảy ra ở người mang đồng hợp tử gen lặn.

Aa Aa


AA Aa aa


(25%) (50%) (25%)
Hình 1.4. Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường
Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ. Thường gặp bệnh xuất hiện trong cùng một thế hệ. Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh là như nhau.

+ Nếu cha mẹ là hai dị hợp tử (Aa x Aa) khả năng con bị bệnh (aa) là 25%, con dị hợp tử (Aa) mang gen lặn là 50%, con bình thường hoàn toàn (AA) là 25%. Trong quần thể trường hợp này hay gặp nhất.

+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường (AA) kết hôn với người mang gen dị hợp tử (Aa) thì khả năng sinh ra con bình thường (AA) là 50%, con bị dị hợp tử (Aa) là 50%.

+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường kết hôn với người bị bệnh (aa) thì khả năng sinh con mang gen dị hợp tử (Aa) là 100%



AA


I

AA

AA

Aa

Aa

AA


II



AA

Aa

Aa

Aa

AA

Aa

Aa

AA

III

AA


AA

AA

Aa

Aa

Aa

aa

Aa

aa

aa

Hình 1.5. Phả hệ của một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường (Autosome Recessive)

Thế hệ I, II, không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh.

Đặc điểm của bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường là có người lành mang gen bệnh, với kiểu hình là người hoàn toàn bình thường, khỏe mạnh nhưng khi xây dựng gia đình với người mang gen bệnh và sinh con thì truyền bệnh cho con theo tỷ lệ phân ly gen bệnh của qui luật Mendel. Bệnh truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.

Tần xuất người mang gen bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH là 1/60 tùy thuộc vào chủng tộc. Tần số đột biến tự nhiên mới phát sinh cần có cả hai đột biến về cùng một gen ở cả hai bên bố mẹ nên xác xuất xảy ra vô cùng nhỏ. Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bị bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần thể [3],[19],[32].

2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử

Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử chứa các đột biến gen CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thượng thận cao hơn những người bình thường không mang gen [19], [26].

Chẩn đoán bệnh dựa vào lâm sàng và xét định lượng nồng độ 17- OHP, testosteron, xét nghiệm tìm đột biến gen CYP21A2. Trong đó, nồng độ 17-OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất để tổng hợp enzym 21- OH nên giá trị 17- OHP tăng sớm và tăng cao ở trên bệnh nhân và người mang gen, người ta còn ứng dụng giá trị này để làm sàng lọc chẩn đoán sớm bệnh ở các nước phát triển [1].

2.4. Phát hiện người lành mang gen bệnh

Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tính trạng ra ngoài. Người mang gen bệnh thường có dấu hiệu về lâm sàng hoặc sinh học nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì. Tuy vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằng phương pháp sinh hóa. Định lượng 17- OHP cho những người là thành viên của gia đình người bệnh, với 17- OHP < 300 ng/ml thì là bình thường và 17- OHP > 300 - 1499 ng/ml được chứng minh là dị hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằng corticotropin (Lee HH el al 2000). Do thiếu hụt enzym 21-OH có liên quan đến typ HLA, nên có thể xác định đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện người lành mang gen bằng cách phân loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và tế bào ối thai nhi hoặc đối tượng có nguy cơ cao. Nếu kết quả typ HLA giống nhau và có thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH hoặc người lành mang gen với độ tin cậy cao [4], [19].


Nồng độ 17-OHP sau nghiệp pháp kích thích ACTH


Nồng độ 17-OHP ng/dl

Hình 1.6. Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các thể bệnh và người mang gen dị hợp tử [36].

Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc người mang gen được tiến hành ở gia đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để quản lý người mang gen và người bệnh. Qua sàng lọc này để có thể đưa ra lời khuyên di truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn trong cùng dòng họ cũng như tránh kết hôn giữa những người mang gen bệnh (Aa x Aa) hoặc giữa người mang gen bệnh với người bị bệnh (Aa x aa). Nếu kết hôn giữa các đối tượng có nguy cơ cao thì cần phải được tư vấn, quản lý thai nghén về phương diện di truyền và làm sàng lọc sơ sinh [4].

3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS

3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng

3.1.1. Chẩn đoán xác định

- Định lượng 3 sản phẩm cuối cùng của hormon vỏ thượng thận: Aldosteron, cortisol, và testosteron; 3 chất chuyển hóa trong nước tiểu là 17- CS, 17- OHCS, pregnanetriol. Các xét nghiệm này không đặc hiệu bởi vì những thay đổi nồng độ các chất chuyển hóa trên có thể gặp trong u tuyến yên và u vỏ thượng thận [27], [28].

- Định lượng 17- OHP: 17- OHP là chỉ số đặc trưng để chẩn đoán TSTTBS do thiếu enzym 21- OH và tăng nồng độ trong máu hoặc tăng nồng độ qua nghiệm pháp ACTH [28].

Chẩn đoán TSTTBS sớm trong giai đoạn sơ sinh:

+ Trẻ sơ sinh có triệu chứng nôn nhiều, nhất là từ 2- 3 tuần tuổi.

+ Trẻ có bộ phận sinh dục ngoài không rõ ràng, không sờ thấy tinh hoàn.

+ Điện giải đồ: natri máu giảm, kali máu tăng.

+ Nồng độ 17- OH tăng.

Chẩn đoán TSTTBS ở trẻ lớn:

+ Trẻ trai 2-3 tuổi có các dấu hiệu dậy thì sớm giả, dương vật phát triển nhanh.

+ Trẻ gái 2-3 tuổi có âm vật phì đại nhanh như dương vật, không có tinh hoàn.

+ Cả 2 giới: Chiều cao tăng nhanh, có lông mu, trứng cá, phát triển cơ bắp.

+ Xét nghiệm: Định lượng 17- OHP tăng cao, testosteron tăng, FSH và LH giảm.

+ Xét nghiệm nhiễm sắc thể để xác định giới tính.

3.1.2. Chẩn đoán phân biệt

- Dậy thì sớm thật đồng giới, trẻ trai có tinh hoàn phát triển cùng với dương vật, thể tích tinh hoàn > 4 ml. Nồng độ FSH và LH tăng cao, không có các rối loạn hormon khác.

- Dậy thì sớm giả khác giới ở trẻ gái do u thượng thận nam hóa (Carcinome). U thường lớn 3- 6 cm. Phát hiện u nhờ các chẩn đoán hình ảnh. 17- CS nước tiểu tăng cao. Dehydroepiandosterone (DHEA) huyết tương tăng. 17- OHP máu không tăng. Khi làm test ức chế bằng dexamethason, nồng độ DHEA huyết tương và nồng độ 17- CS niệu đều không giảm, giúp chẩn đoán phân biệt với TSTTBS [28].

- U buồng trứng gây nam hóa: Ít gặp, DHEA huyết tương và 17- CS niệu không tăng.

- Buồng trứng đa nang: Nguyên nhân thường gặp nhất do tăng tiết androgen do buồng trứng, triệu chứng nam hóa ít gặp. Hay gặp nhất là triệu chứng rậm lông, bệnh nhân có thể mập phì, tăng insulin máu, rối loạn dung nạp glucose. FSH và LH tăng, testosterol tăng ít, andostenedion huyết tương tăng cao [28].

* Các đối tượng cần được xác định người mang gen, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh với bệnh TSTTBS:



+ Những bà mẹ đã được phát hiện là dị hợp tử mang gen đột biến CYP21A2 khi mang thai cần được chẩn đoán trước sinh.

+ Các bà mẹ đã một lần sinh con bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH có thai cần thiết chẩn đoán trước sinh.

+ Các bà mẹ mang thai mà trong gia đình nội, ngoại có cô, chú, bác ruột, cậu ruột, dì ruột, bị bệnh thì cũng cần thiết chẩn đoán trước sinh.

+ Các anh, chị em họ bị bệnh cùng thế hệ với thai nhi.

3.2. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS

3.2.1. Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA mới bổ sung và cần phải có các mồi oligonucleotid để khởi đầu quá trình tổng hợp.

Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và điều hòa bởi nhiệt độ:



- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.

- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn DNA khuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bền với nhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo mồi, thường nhiệt độ khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc vào kích thước và Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.

- Giai đoạn 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi đôi mới được tạo thành sẽ tiếp tục được dùng làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong các chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [13].

Giống như nhiều bệnh lý di truyền, PCR được sử dụng rộng rãi để khuếch đại gen CYP21A2 xác định các đột biến xoá đoạn và phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử khác để xác định đột biến đặc hiệu. Tuy nhiên do gen giả CYP21A2P có tính tương đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại gen CYP21A2 không dễ thực hiện do đó việc thiết kế mồi phải có trình tự đặc hiệu với gen CYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22].


Hình 1.7. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR

3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing)

Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của cả deoxynucleotid và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau. Nucleotid tận cùng trên các sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy đồng thời 4 phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang đặc hiệu khác nhau. Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách bằng điện di trên gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn DNA kém nhau 1 nucleotid. Trình tự các nucleotid được xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid [12].

3.2.3. Kỹ thuật Souther blot

Souther blot là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện đột biến xóa đoạn gen lớn, đột biến lặp đoạn… Đây là phương pháp mất nhiều thời gian và công sức nhưng lại rất hiệu quả. Các đoạn dò DNA đặc hiệu được sử dụng để phát hiện đoạn gen CYP21A2 sau khi DNA được cắt bằng enzym giới hạn, điện di trên gel agarose và được biến tính trên màng nilon hay nitrocellulose, màng đã được lai với đầu dò được xác định nhờ film có độ nhạy đặc biệt với phóng xạ. So sánh kết quả lai giữa người bình thường và người bệnh để có thể xác định được vị trí đột biến [12], [13].

3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification)

Nguyên tắc của MLPA là sử dụng các đoạn dò DNA (probe) có khả năng lai đặc hiệu với các phân tử DNA đích. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotid dài và ngắn [32].

+ Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:

 Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 2130 nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe.

 Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid của đoạn này giống nhau cho các probe. Đây là vị trí gắn với mồi Y để khuếch đại probe khi tiến hành phản ứng PCR [32].



Hình 1.8. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA

+ Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:

 Đoạn 1’ chứa 25  43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’.

 Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho các probe. Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe.

 Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’ và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di.

Trong mỗi phản ứng có chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên đỉnh tương ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả. Ngoài ra trong kỹ thuật MLPA có sử dụng chứng là DNA của người bình thường, chạy song song cùng mẫu bệnh nhân để so sánh [32].

Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó [32].

Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm các probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương với các đột biến mất đoạn 8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ thể (C4A, C4B). Ngoài ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. Vị trí và kích thước của các probe được mô tả như bảng 1.3.

Bảng 1.3. Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR


trong Kit MLPA P050B2 (MRC- Holland)



STT


Tên probe

Vị trí của probe trên gen

Kích thước

(bp)

1

X-fragment

X chromosome

100

2

C4B probe 02357-L02586

C4B Exon 19

154

3

CYP21A2 probe 01974-L01507

Exon 3

172

4

C4A probe 04802-L04177

C4A Exon 26

178

5

CYP21A2 probe 04804-L04179

Exon 1

202

6

CYP21A2 probe 01975-L01508

Exon 4

210

7

CYP21A2 probe 01976-L01509

Exon 6

229

8

UTY probe 01071-L00464

Yq11

240

9

CYP21A1P probe 04805-L04180

5’ exon 1

265

10

CYP21A2 probe 05477-L04895

Exon 8

283

11

CYP21A1P probe 04807-L04182

Exon 10

352

12

CYP21A1P probe 04806-L04181

Intron 2

382


Ex 1

Hình 1.9. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2



Chú thích: Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các probe tương ứng với các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các probe tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P; C4A, C4B là probe tương ứng với gen C4A, C4B.

Hình 1.10. Hình ảnh minh họa kết quả MLPA



Chú thích: Trục hoành biểu hiện kích thước sản phẩm PCR tăng dần theo chiều từ trái sang phải. Trục tung thể hiện nồng độ của các sản phẩm phẩm PCR tỉ lệ thuận với chiều cao của các đỉnh. Bệnh nhân có đột biến xóa đoạn khi không xuất hiện đỉnh tương ứng với exon bị xóa đoạn và là người lành mang gen bệnh khi chiều cao đỉnh bằng ½ so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng. Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2. E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P. C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B. Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y.

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương; các thành viên trong gia đình bệnh nhân bao gồm bố, mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhân.

Tiêu chuẩn chẩn đoán: Bệnh nhân có biểu hiện mất muối, mất nước từ nhẹ đến nặng, Na+ giảm và K+ tăng; biểu hiện mơ hồ giới tính sau sinh ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai. Nồng độ 17- OH tăng trên 10.000 ng/dl ở thể cổ điển và tăng từ 200-10.000 ng/dl ở thể không cổ điển [2] [28].

Tất cả các thành viên trong gia đình gồm: Cha, mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhân được khám xét lâm sàng theo phương pháp mô tả, tư vấn để tiến hành xét nghiệm phát hiện đột biến gen CYP21A2.

2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị


  • Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA).

  • Pipet, đầu côn các loại dùng cho kỹ thuật sinh học phân tử.

  • Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO).

  • Máy điện di: Mupid (Nhật Bản).

  • Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA).

  • Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức).

  • Lò vi sóng.

  • Máy giải trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ).

2.2.2. Hoá chất

Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử như để tách chiết DNA, điện di DNA được cung cấp từ hãng invitrogen).

Hóa chất để thực hiện phản ứng MLPA:

- SALSA MLPA Kit P050- B2- CAH.

- Hãng MRC - Holland, Amsterdam, HàLan.

- Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland): Kit này gồm các Probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gene CYP21 gọi là P050- B2.

- Thành phần hóa chất:



SALSA MLPA Buffer: KCl, Tris- HCl, EDTA và PEG- 6000, pH 8,5

SALSA Ligase- 65: Glycerol, BRIJ 0,05%, EDTA, KCl, Tris- HCl, Beta-Mercaptoethanol 0.1%, pH 7,5, Ligase- 65 enzyme (từ vi khuẩn).

Ligase buffer A: NAD (nguồn gốc vi khuẩn), pH 3,5

Ligase buffer B: Tris- HCl, non- ionic detergents, MgCl2, pH 8,5

SALSA PCR Primer Mix: Chứa oligonucleotides tổng hợp có gắn huỳnh quang Cy5, dNTPs, Tris- HCl, KCl, EDTA, BRIJ 0.04%, pH 8,0

SALSA Polymerase: Glycerol, BRIJ 0,5%, EDTA, DTT 0,1%, KCl, Tris- HCl, Polymerase enzyme (nguồngốc vi khuẩn), pH 7,5

Probemix: Chứa oligonucleotides tổng hợp, oligonucleotides tinh chế từ vi khuẩn, Tris- HCl, EDTA, pH 8,0

Bảo quản: Hóa chất được bảo quản ở nhiệtđộ -250C đến -150C, bảo quản trong hộp và tránh ánh sáng.



Thành phần hỗn hợp probe (probemix): Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho exon 1, 3, 4, 6 và 8 của gene CYP21A2, tương đương với các đột biến mất đoạn 8bp, I172, E6 cluster and Q318. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gene CYP21A2P. 19 probe đặc trưng cho gene của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng trong đó có 3 probe trên nhiễm sắc thể số 6 nhưng ngoài vùng 6p21.3. Kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán trước sinh còn có thể xác định chính xác giới tính của thai nhi dựa vào probe đặc trưng cho nhiễm sắc thể X (có độ lớn là 100 bp) và 1 probe đặc trưng cho nhiễm sắc thể Y (gene UTY- có độ lớn là 105 bp).

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đề tài được tiến hành tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền và Phòng Xét nghiệm Sinh hóa, Huyết học, Chẩn đoán hình ảnh của Bệnh viện Nhi Trung ương là nơi chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân.

- Các xét nghiệm sinh học phân tử thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.



- Thời gian nghiên cứu 1 năm: từ tháng 9 năm 2014 đến 9 năm 2015.

2.4. Đạo đức trong nghiên cứu

Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có sự đồng ý của đối tượng nghiên cứu: Tham gia tự nguyện vào nghiên cứu.

Bệnh nhân và các thành viên gia đình bệnh nhân được giải thích rõ ràng về mục tiêu nghiên cứu, được thông báo về kết quả xét nghiệm gen, đồng thời giải thích về khả năng điều trị và phòng bệnh của con họ để gia đình sẵn sàng hợp tác với các bác sĩ trong quá trình điều trị và thực hiện tư vấn di truyền. Bác sĩ di truyền sẽ lập hồ sơ theo dõi lâu dài cho thai nhi và các thành viên gia đình. Các thông tin của bệnh nhân và gia đình sẽ được đảm bảo bí mật.

Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ các quy định đạo đức trong nghiên cứu Y- sinh học.

2.5. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang.

2.5.1. Thiết kế nghiên cứu



Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.5.2 Tiến hành xét nghiệm

2.5.2.1. Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu và tách chiết DNA

Bệnh nhân và các thành viên của gia đình bệnh nhân lấy 2 - 5 ml máu ngoại vi. Tách chiết DNA bằng Phenol/Chloroform theo phương pháp thường quy của Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein. Đo và kiểm tra nồng độ DNA bằng máy đo nồng độ Nano Drop 1000, chỉ những mẫu DNA có độ tinh sạch 1,8 - 2 mới được sử dụng phát hiện đột biến gen.



Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform:

Bước 1: Phá vỡ hồng cầu

Cho vào ống Eppendorf 1.5 ml: 1 ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer – RBC) + 0,5 ml máu toàn phần được chống đông bằng EDTA.

Lắc nhẹ , Voltex, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút/ 4ºC.

Loại dịch nổi, thu cặn.

Lặp lại quy trình từ 2 - 3 lần cho tới khi thấy có tủa trắng (Bạch cầu).



Bước 2: Rửa bạch cầu

Cho thêm 1 ml dung dịch phá vỡ bạch cầu (PBS) vào ống Eppendorf chứa cặn tế bào.

Lắc nhẹ, Voltex, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút/ 4ºC.

Loại dịch nổi, thu cặn.

Bước 3: Phá vỡ bạch cầu

Cho thêm 650 µl lysis buffer HD + 5 µl protein K.

Ủ ở 56ºC cho tới khi tủa tan hết.

Bước 4: Loại bỏ protein

Sau khi ủ, cho thêm 500 µl dung dịch PCI (Phenol: Chloroform: Isoamyl tỷ lệ 25: 24: 1) là dung dịch tủa protein.

Trộn đều. Ly tâm 15000 vòng/10 phút/ 4ºC.

Hỗn hợp phân thành 3 lớp. Thu lớp trên trong suốt ra một ống Eppendorf 1.5 ml sạch đã được đánh dấu sẵn.

Cho thêm vào ống Eppendorf 500 µl dung dịch CI( Chloroform: Isoamyl tỷ lệ: 24: 1).

Trộn đều. Ly tâm 15000 vòng/ 10 phút/ 4ºC.

Hỗn hợp phân thành 2 lớp. Thu lớp trên cùng trong suốt chứa DNA ra một ống Eppendorf mới.

Bước 5: Tủa DNA và thu DNA

Cho thêm vào ống Eppendorf 2.5V Ethanol 100% + 0.1V Sodium acetate (CH3COONa).

Lắc đều, quan sát tủa.

Ủ dung dịch ở -20ºC trong 2 - 3h để kết tủa DNA.

Sau 2 - 3h, lấy sản phẩm đem ly tâm 15000 vòng/ 15 phút/ 4ºC → Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.

Cho thêm 1 ml Ethanol 70% để rửa tủa.

Trộn đều → Ly tâm 15000 vòng/ 15 phút/ 4ºC.

Thu tủa DNA, để khô tự nhiên.

Cho thêm 60 µl dung dịch TE để hòa tan tủa.

2.5.2.5. Kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn

- Nguyên tắc: Trong phản ứng MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) việc thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Thông thường, mỗi probe chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau.

Trong mỗi phản ứng có chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên đỉnh tương ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả. Ngoài ra trong kỹ thuật MLPA có sử dụng chứng là DNA của người bình thường, chạy song song cùng mẫu bệnh nhân để so sánh.

Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó.

Bệnh nhân có đột biến xóa đoạn khi không xuất hiện đỉnh tương ứng với exon bị xóa đoạn và là người lành mang gen bệnh khi chiều cao đỉnh bằng ½ so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng. Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2. E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P. C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B. Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y.



Hình 2.2. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 [4]



Chú thích: Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các probe tương ứng với các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các probe tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P; C4A, C4B là probe tương ứng với gen C4A, C4B.

Trục hoành biểu hiện kích thước sản phẩm PCR tăng dần theo chiều từ trái sang phải. Trục tung thể hiện nồng độ của các sản phẩm phẩm PCR tỉ lệ thuận với chiều cao của các đỉnh.
Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm các probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương với các đột biến mất đoạn Δ8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ thể C4A, C4B (C4A, C4B). Ngoài ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính.

- Tiến hành phản ứng MLPA

+ Bước 1: Biến tính DNA.

Cho 5 l dung dịch DNA (nồng độ 10  20 ng/l) cần phân tích vào ống PCR, biến tính ở 98°C trong 5 phút, chuyển về giữ ở 25°C.

+ Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đích.

 Chuẩn bị hỗn hợp lai:



Thành phần

Thể tích

Dung dịch đệm MLPA

1,5 l

Hỗn hợp probe

1,5 l

Tổng số

3 l

 Cho 3 l hỗn hợp lai vào mẫu DNA đã biến tính, nâng nhiệt độ lên 95°C trong 1 phút để biến tính probe, hạ nhiệt độ xuống 60°C, ủ qua đêm (1224h). Đây là nhiệt độ để probe gắn đặc hiệu vào đoạn gen đích.

+ Bước 3: Nối 2 đầu probe

 Chuẩn bị dung dịch đệm gắn probe: các dung dịch hóa chất cần vortex nhẹ cho đều trước khi pha dung dịch đệm


Thành phần

Thể tích

Dung dịch đệm A

3 l

Dung dịch đệm B

3 l

Nước

25 l

Enzym ligase 65

1 l

Tổng số

32 l

 Cho 32 l dung dịch đệm gắn probe vào hỗn hợp lai ủ qua đêm ở trên khi mẫu ở 54oC, tiếp tục chạy theo chu trình nhiệt sau: 54oC/ 15 phút→ 98oC/5 phút→ 4oC/ ∞. Sản phẩm lai này sẽ lưu trữ được 1 tuần/ 4oC, hoặc lâu hơn ở -20oC.

+ Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe).

 Dung dịch đệm phản ứng PCR: 4 l dung dịch đệm PCR, 26 l nước. Cho thêm vào hỗn hợp 10 l sản phẩm lai, đưa vào máy giữ ở 60oC.

 Pha hỗn hợp phản ứng PCR gồm primer (có gắn huỳnh quang) 2 l, dung dịch đệm 2 l, nước 5,5 l, Tag polymerase 0,5 l. Cho 10 l hỗn hợp phản ứng PCR này vào hỗn hợp đang trong máy giữ ở 60oC. Tiếp tục chu trình nhiệt: (95oC/30 giây, 60oC/30 giây, 72oC/1 phút) x 35 chu kỳ, 72oC/ 20 phút, giữ ở 4oC.

Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự gen để phân tích kết quả.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA

DNA mẫu máu của 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh và 22 thành viên gia đình sau khi tách chiết theo quy trình Phenol/ Chloroform/ Isoamyl Alcohol được đo nồng độ và độ tinh sạch đồng thời điện di đánh giá chất lượng DNA.



Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 414.57 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
  1   2   3




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương