TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 9661: 2013 iso 17129: 2006

SỮA BỘT - XÁC ĐỊNH PROTEIN ĐẬU TƯƠNG VÀ PROTEIN ĐẬU HÀ LAN SỬ DỤNG ĐIỆN DI MAO QUẢN CÓ MẶT NATRI DODECYL SULFAT (SDS-CE) - PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC

TCVN 9661:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 17129:2006;

TCVN 9661:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Đối với nhiều sản phẩm sữa yêu cầu thành phần không được có các protêin ngoài protein từ sữa. Tuy nhiên, do các protein không phải từ sữa có giá rẻ nên dễ bị sử dụng để độn, hiện nay chưa có các phương pháp chuẩn để xác định các protein không phải từ sữa có trong sữa bột và các sản phẩm sữa.

Phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này đã được xây dựng với hai mục tiêu sau:

a) để kiểm soát tính xác thực của sản phẩm;

b) để hỗ trợ cho việc kiểm soát và hạn chế sự gian lận.

Việc chọn và đánh giá lần đầu về phương pháp do dự án EU SMT4-CT97-2205 (Chương trình khung IV) thực hiện.

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định protein đậu tương và protein đậu Hà Lan trong sữa bột xử lý nhiệt thấp, dùng điện di mao quản với sự có mặt natri dodecyl sulfat (SDS-CE).

Phương pháp này không thích hợp đế phát hiện sự có mặt của protein thực vật đã thủy phân có trong sữa bột.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8100 (ISO 14891), Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hàm lượng nitơ - Phương pháp thông dụng theo nguyên tắc đốt cháy Dumas.

TCVN 8099 (ISO 8968) (tất cả các phần), Sữa - Xác định hàm lượng nitơ

Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Phần khối lượng của protein đậu tương và đậu Hà Lan xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Protein đậu tương và đậu Hà Lan được biểu thị bằng phần khối lượng của hàm lượng protein tổng trong mẫu. Hệ số để tính hàm lượng protein tổng có trong mẫu thử là 6,38 x N %, trong đó N là hàm lượng nitơ.

4. Nguyên tắc

Các protein sữa có trong phần mẫu thử được tách chọn lọc bằng cách sử dụng chất đệm EDTA tetraborat để tăng khả năng phát hiện các lượng nhỏ các protein thực vật được thêm vào. Chất đệm tris-HCl được bổ sung vào với sự có mặt của natri dodecyl sulfat và chất khử để hòa tan kết tủa, để tách và phá vỡ mọi protein dính kết hình thành bởi các liên kết S-S. Protein được tách ra và được xác định bằng điện di mao quản. Lượng Protein thực vật được định lượng bằng phép hiệu chuẩn trước.

Chỉ sử dụng thuốc thử loại phân tích và nước cất hai lần hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

Hòa tan 1,14 g dinatri tetraborat ngậm mười phần tử nước (Na₂B₄O₇.10H₂O) và 1,49 g muối axit etylendiaminetetraaxetic dinatri ngậm hai phần tử nước (EDTA; C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2H₂O) trong khoảng 80 ml nước đựng trong ống đong (6.1). Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn.

Kiểm tra để chắc chắn rằng pH của chất đệm chiết là 8,30,1. Nếu giá trị pH cuối cùng nằm ngoài dải này thì lặp lại việc chuẩn bị chất đệm chiết trong khi thay đổi tất cả các thuốc thử. Không dùng hóa chất để chỉnh pH.

5.2. Chất đệm mẫu

Hòa tan 606 mg tris(hydroxymethyl)aminomethane (C₄H₁₁NO₃), 1,00 g muối natri dodecyl sulfat (SDS; C₁₂H₂₅O₄SNa) và 37 mg EDTA (C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2H₂O) trong khoảng 80 ml nước đựng trong ống đong (6.1) và trộn. Thêm 14,7 ml axit clohydric có nồng độ chất c(HCl) = 0,1 mol/l và 2 ml 2-mercaptoethanol. Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn.

Kiểm tra để chắc chắn rằng pH của chất đệm mẫu là 8,7  0,1. Nếu giá trị pH cuối cùng nằm ngoài dải này thì lặp lại việc chuẩn bị chất đệm mẫu trong khi thay đổi tất cả các thuốc thử. Không dùng hóa chất để chỉnh pH.

5.3. Chất đệm điện di, ví dụ: chất đệm gel Beckman eCAP^TMSDS 14-200¹⁾ hoặc tương đương.

5.4. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l.

5.5. Hỗn hợp thử đối chứng, chứa các protein có khối lượng phân tử từ 10 kDa đến 200 kDa.

CHÚ THÍCH: Hỗn hợp thử đối chứng có bán sẵn trên thị trường.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

8. Chuẩn bị mẫu thử

8.1. Hàm lượng protein của mẫu thử

Xác định hàm lượng protein tổng số của mẫu thử bằng phương pháp quy định trong TCVN 8100 (ISO 14891) hoặc phương pháp quy định trong phần tương ứng của TCVN 8099 (ISO 8968).

Nếu hàm lượng protein của mẫu thử nằm trong khoảng từ 30% đến 40% phần khối lượng thì cân 126 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào lọ nhỏ có nắp vặn (6.3). Nếu hàm lượng protein của mẫu thử nằm ngoài dải này thì thay khối lượng mẫu thử tương ứng.

Trên 1 ml chất đệm chiết (5.1) vào phần mẫu thử đựng trong lọ nhỏ. Trộn dung dịch thu được bằng máy trộn Vortex (6.7) trong 1,5 min ở khoảng 2 500 r/min. Để yên 5 min rồi trộn lại dung dịch thu được trong 1,5 min. Ly tâm hỗn hợp 30 min ở khoảng gia tốc 6 500 g. Dùng pipet Pasteur cẩn thận loại bỏ phần nổi phía trên ra khỏi phần cặn.

Rửa cặn bằng 1ml chất đệm chiết (5.1). Ly tâm phần cặn đã rửa ở khoảng 6 500 g trong 20 min. Dùng pipet Pasteur cẩn thận loại bỏ phần nổi phía trên. Rửa phần cặn còn lại một lần nữa theo cùng một quy trình.

Thêm 250 l chất đệm mẫu (5.2) vào cặn đã rửa đựng trong lọ nhỏ. Đậy nắp, làm nóng lọ 10 min ở nhiệt độ 95⁰C trong khi vẫn xoay lọ trên bộ trộn gia nhiệt (6.8) đã cài đặt ở tốc độ khoảng 1 000 r/min. Làm nguội lọ trong nước đá hoặc trên đá lạnh. Sau khi nguội, ly tâm lọ cùng với lượng chứa bên trong ở gia tốc 3 000 g trong 5 min. Chuyển khoảng 200 l phần trong nổi phía trên sang lọ bơm thích hợp để dùng làm dung dịch thử.

Sau khi gia nhiệt, mẫu đựng trong lọ nhỏ có thể được bảo quản trong tủ lạnh đông.

Có thể bỏ qua bước ly tâm nói trên nếu lượng chứa trong lọ nhỏ đã trong.

9. Cách tiến hành

9.1. Điều kiện vận hành

9.1.1. Điều kiện chạy của điện di mao quản (CE)

Chỉ duy trì cột mao quản ( 6.9.1) cần sử dụng cho quy trình phân tích này. Nếu sử dụng mới thì cho nước chảy qua cột. Trước mỗi dãy phân tích, cho dung dịch natri hydroxit (5.4) chảy qua cột mao quản đã sử dụng trong 0,5 min, sau đó cho chất đệm điện di (5.3) chảy qua trong 5 min.

Trong mỗi lần tách, cho chất đệm điện di (5.3) chảy lại qua cột mao quản, tốt nhất là theo chiều ngược lại, với áp lực 241 325 Pa (35 psi) trong 1 min.

Cho điện di ở 25⁰C. Bắt đầu điện di bằng thiết bị điện di mao quản (6.9) cài đặt ở 2 kV sau đó với gradient điện áp tuyến tính từ 2 kV đến 7kV quá 1,7 min. Sau đó giữ điện áp ổn định ở 7 kV cho đến tổng thời gian điện di là 16 min. Dòng điện cần ở khoảng 20 A và thiết bị phải được tiếp đất ở phía bơm. Cài đặt detector ở bước sóng 214 nm, thu thập dữ liệu ở 2 Hz và thời gian tăng ở 0,5 s.

Dựa vào các đặc tính của thiết bị, người vận hành cần điều chỉnh các điều kiện vận hành cho thích hợp để thu được việc tách có hiệu quả.

9.1.2. Bơm

Bơm dung dịch thử (8.2) ở 3 447,5 pa (0,5 psi) trong 60s. Sau đó nhúng phía bơm của mao quản trong lọ nước 6 s, sau đó bơm dung dịch đệm điện di (5.3) từ lọ đựng dung dịch đệm điện di ở 3 447,5 Pa (0,5 psi) trong 5 s. Tiến hành điện di sau bước này.

Không sử dụng mao quản với các loại chất đệm khác. Sau khi sử dụng, cho nước chảy qua mao quản. Bảo quản cả hai đầu mao quản trong nước. Tùy thuộc vào sự chênh lệch áp lực trong thiết bị mà điều chỉnh tốc độ chảy và thời gian bơm tương ứng.

9.2. Kiểm tra sự phù hợp của thiết bị

Bơm hỗn hợp thử đối chứng (5.5) ba lần. Kiểm tra sự phù hợp của thời gian điện di và diện tích pic của protein từ hỗn hợp thử nghiệm. Sự khác nhau thu được phải nhỏ hơn 5% (tương đối).

Cột mao quản mới có thể hấp thụ protein, dẫn đến tăng diện tích pic với các lần lặp lại của cùng mẫu thử. Để tránh điều này xảy ra, cho mẫu đối chứng (8.2) chảy nhanh qua cột mao quản theo chiều thuận trong khoảng 6s. Sau đó cho chất đệm điện di (5.3) chảy qua cột theo cùng hướng.

CHÚ THÍCH: Sự sai lệch về sơ đồ điện di có thể đo:

- mao quản (kể cả đường dẫn của mao quản cắt không đều).

- nhiệt độ của mao quản không ổn định (ví dụ: mức của dung dịch làm mát quá thấp).

- đèn detơri bị hỏng hoặc

- có sự trục trặc khác của thiết bị.

Phân tích dung dịch thử (8.2) trong các điều kiện vận hành trong 9.1.

Nhận biết các pic của mẫu thử thu được bằng cách so sánh với điện di đồ nêu trong Hình A.1, A.2 và A.3. Các điện di đồ này cho thấy các mẫu pic của sữa bột gầy xác thực và các mẫu pha trộn đậu tương và đậu Hà Lan tương ứng.

Phân tích dung dịch thử (8.2), mẫu trắng (9.4.2) và các mẫu đối chứng (5.6) trong các điều kiện vận hành như trong 9.1.

Bơm chất đệm mẫu (5.2) ở 3 447,5 pa (0,5 psi) trong 50s. Đường nền thu được phải tương đối thẳng.

Áp dụng trình tự sau đây để đo:

a) mẫu đối chứng (5.6);

b) mẫu trắng (9.4.2);

c) dung dịch thử (8.2);

d) mẫu trắng (9.4.2);

e) mẫu đối chứng (5.6).

Lặp lại trình tự này khi số lượng mẫu thử nhiều hơn 10 đến 15 mẫu.

Nhận biết các pic thu được các mẫu thử theo mô tả trong 9.3.2. Các sơ đồ điện di trong Hình A.1 đến Hình A.3 cho thấy các mẫu pic của sữa bột gây xác thực và các mẫu pha trộn đậu tương và đậu Hà Lan tương ứng.

Chỉnh các thông số tích phân sao cho việc tích phân có thể so sánh được như trong Hình A.2 hoặc Hình A.3 (đường nối giữa hai chân pic). Không gom một số pic thành một pic vì sẽ không xác định khi tính diện tích pic tổng số.

Tính diện tích pic đã chuẩn hóa A_ni, của từng pic của protein (i), bằng công thức sau:

A_ni = A_i/t_i

Trong đó:

A_i là diện tích pic của protein i;

t_i là thời gian chuyển dịch của pic i, tính bằng phút (min).

Đối với protein đậu tương, sử dụng tổng của các diện tích pic đã chuẩn hóa tính được tương ứng.

CHÚ THÍCH: Phần mềm để thu được dữ liệu mẫu cho phép tính diện tích pic đã chuẩn hóa.

9.4.6. Hiệu chuẩn

9.4.9.1. Mẫu đối chứng

Tốt nhất là sử dụng hai mẫu đối chứng (5.6) có phần trăm protein thực vật đã biết nằm trong dải do yêu cầu. Đo các mẫu đối chứng theo quy định trong 9.4.3. Tính các diện tích pic của chúng theo 9.4.5.

Tính hệ số đáp ứng, R_fi, đối với mỗi chất hiệu chuẩn (i) trong các mẫu đối chứng (5.6) theo công thức sau đây:

R_fi = P_c/A_ci

Trong đó:

P_c là phần khối lượng của protein thực vật có trong protein tổng số của chất hiệu chuẩn, tính bằng phần trăm (xem 8.1);

A_ci là diện tích pic đã chuẩn hóa của chất hiệu chuẩn đối chứng (xem 9.4.5).

Nếu hệ số đáp ứng thu được đối với chuẩn hiệu chuẩn, R_fi, sai khác quá 5%, thì sử dụng hệ số đáp ứng trung bình tính được, R_f. Nếu không, tính hằng số hồi quy tuyến tính R_fi.

10. Tính và biểu thị kết quả

10.1. Phân tích định tính

Phân loại mẫu là "nghi ngờ" nếu sơ đồ điện di của mẫu thử (Điều 8) cho các pic khác với các pic của mẫu sữa xác thực như trong Hình A.1.

Mẫu điện di của các pic nhận biết được theo Hình A.2 và A.3 có nghĩa là có mặt đậu tương và đậu Hà Lan, dựa vào tính nhất quán của các đặc trưng pic dưới các điều kiện phân tích quy định.

Đưa mẫu điện di của các mẫu "nghi ngờ" để phân tích định lượng theo 10.2.

Tính phần khối lượng của protein thực vật trộn lẫn, P_s, theo phần trăm protein tổng số có trong mẫu thử, sử dụng công thức sau:

P_s = R_f x A_nsi

Trong đó:

R_f là hệ số đáp ứng trung bình (xem 9.4.6.2);

A_nsi là diện tích pic đã chuẩn hóa của mẫu thu được dùng công thức trong 9.4.5.

Khi sử dụng công thức hồi quy nêu trong 9.4.6.2, thì thay A_nsi và R_f trong công thức và tính P_s.

10.2.2. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân.

Chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp này được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử nghiệm liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người phân tích, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn:

- mức hàm lượng protein là 0,99%: r = 0,37 %

- mức hàm lượng protein là 1,96%: r = 0,98%.

- mức hàm lượng protein là 4,76%: r = 1,48%.

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn:

- mức hàm lượng protein là 0,99%: R = 1,29 %

- mức hàm lượng protein là 1,96%: R = 1,88%.

- mức hàm lượng protein là 4,76%: R = 3,58%.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ ĐIỆN DI

CHÚ DẪN:

Y là độ hấp thụ ở bước sóng 214 nm.

CHÚ DẪN:

Y là độ hấp thụ ở bước sóng 214 nm.

CHÚ DẪN:

Y là độ hấp thụ ở bước sóng 214 nm.

(Tham khảo)

PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Phép thử cộng tác liên phòng quốc tế gồm có tám phòng thử nghiệm tham gia tiến hành trên hai mẫu khác nhau của ba loại protein được bổ sung với cùng một lượng vào sữa bột xử lý nhiệt thấp. Các mẫu thử thu được này được chia lại thành 22 mẫu kép mù. Các mẫu hiệu chuẩn được nêu trong Bảng B.1. Phép thử này do Viện Khoa học Sữa, Lodi, Italy tổ chức. Tất cả các giá trị được biểu thị bằng phần khối lượng.

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] MANSO, M.A., CATTANEO, T.M., BARZAGHI, S., PEREZ, M.D., SANCHEZ, L, CALVO, M., OLIEMAN, C, BRETT, G., LOPEZ-FANDINO, R. IDF Bulletin, 371, pp. 24-50.

[5] MANSO, M.A., CATTANEO, T.M.P, BARZAGHI, S., OLIEMAN, C, LOPEZ-FANDINO, R. Determination of vegetal proteins in milk powder by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis: Interlaboratory study, J. AOAC International, 85 (5), 2002, pp. 1090-1095.