TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8379: 2010

TÔM VÀ SẢN PHẨM TÔM –

PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH HOẠI TỬ DƯỚI VỎ VÀ CƠ QUAN TẠO MÁU (IHHNV) BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP (PCR)

Shrimp and shrimp products –

Detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) by polymerase chain reaction (PCR)

Lời nói đầu

TCVN 8379 : 2010 do Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

CẢNH BÁO – Để đảm bảo an toàn cho nhân viên, các thao tác phân tích chỉ được thực hiện trong các phòng thử nghiệm được trang bị thích hợp, dưới sự kiểm soát của cán bộ thử nghiệm có kinh nghiệm. Etidi bromua (EB) là chất có khả năng gây ung thư. Vì vậy phải mang găng tay, đeo kính và mặc quần áo bảo hộ để tránh tiếp xúc. Nên đánh dấu rõ ràng thiết bị và dụng cụ tiếp xúc với EB và không di chuyển chúng ra khỏi khu vực quy định. Để chất thải có chứa EB trong vật chứa và có phương pháp loại bỏ thích hợp.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện virut gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) trên tôm và sản phẩm của tôm thuộc chi Tôm he (Penaeus) bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

ISO 22174 : 2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi trùng hợp để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu chung và định nghĩa).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

Virut gây bệnh ở tôm, thuộc chi Brevidensovirus, họ Parvoviridae, có kích thước từ 20 nm đến 22 nm, không có màng bao icosahedron, mật độ 1,40 g/ml trong CsCl, chứa DNA mạch đơn dạng thẳng có kích thước ước khoảng 4,1 kb và có capsid gồm bốn polypeptide với khối lượng phân tử 74, 47, 39 và 37,5 kDa.

Việc xác định sự có hoặc không có virut IHHNV (3.1) trong một khối lượng cụ thể của sản phẩm khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

Trong mọi trường hợp, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích thích hợp cho các ứng dụng sinh học phân tử. Việc pha chế, bảo quản và sử dụng thuốc thử phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhìn chung, nên lấy lượng cần thiết vừa đủ các dung dịch phản ứng cho phép thử PCR và bảo quản chúng trong điều kiện thích hợp.

Mồi đặc hiệu của virut IHHNV sử dụng trong kỹ thuật PCR gồm hai cặp mồi: cặp mồi 309F/309R khuếch đại đoạn DNA của IHHNV và cặp mồi MG831F/MG831R khuếch đại trình tự DNA của tôm tương đồng với DNA của virut IHHNV. Mồi có trình tự cụ thể như sau:

Sử dụng nước cất hai lần vô trùng ít hơn thể tích cuối cùng để hòa tan Tris, EDTA và NaCl, khuấy và đảo đều dung dịch. Ở pH thấp, EDTA sẽ tan dễ dàng. Sử dụng HCl để chỉnh pH dung dịch về giá trị 8,0. Cuối cùng thêm lượng SDS cần thiết vào dung dịch và thêm nước cho đủ thể tích cuối. Nên hấp khử trùng dung dịch này để bất hoạt DNA nhiễm vào và giữ được dung dịch đệm lâu hơn.

CHÚ THÍCH 1 Trước khi sử dụng dung dịch đệm ly trích nên bổ sung thêm proteinaza K với nồng độ như trên. Ví dụ: thêm 50 ml dung dịch Proteinaza K nồng độ gốc 20mg/ml vào mỗi 10ml dung dịch đệm ly trích.

CHÚ THÍCH 2 Nên sử dụng thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành bộ chế phẩm dạng thương mại lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây.

Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong trường hợp sử dụng thuốc thử và vật liệu riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho sinh học phân tử.

CHÚ THÍCH 3 Có nhiều quy trình dùng để tách chiết axit nucleic (DNA) từ mô động vật. Đối với mô tôm, việc tách chiết DNA là không quá khó, vì vậy trong quy trình trên đề cập đến phương pháp tách chiết bằng dung dịch đệm ly trích là phương pháp đơn giản, dễ thực hiên. Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào việc sử dụng sản phẩm PCR vào mục đích tạo dòng, lai… nên chọn các phương pháp thích hợp và tối ưu hơn, ví dụ như phương pháp dùng hệ thống cột ly tâm để tách chiết DNA hoặc sử dụng các bộ chế phẩm tách chiết thương mại có bán sẵn.

urê 4M, Tris 200 mM, NaCl 20 mM, EDTA 200 mM, có pH 7,4. Bảo quản ở 25 ^oC.

Guanidin-HCl 6M, urê 10 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 20 % (phần thể tích), có pH 4,4. Bảo quản ở 25 ^oC.

Thêm vào 20 ml etanol tinh khiết guanidin-HCl 5 M và Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Bảo quản ở 25 ^oC.

Thêm vào 80 ml etanol tinh khiết NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5.

Tris-HCl 10 mM, có pH 8,5. Bảo quản ở 25 ^oC.

Hòa tan Tris 10 mM với EDTA 1 mM, chỉnh pH về giá trị 7,6 bằng dung dịch HCl.

Sử dụng thang đo phù hợp để ước lượng được đoạn khuếch đại 309 bp và 831 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 309 bp và 831 bp đã biết trước.

Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng mới pha loãng với nước cất vô trùng thành dung dịch đậm đặc 0,5 lần.

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước rồi chỉnh cho dung dịch có pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 4 N. Sau đó, thêm nước cất cho đủ 500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Hoà tan các thành phần: Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM.

Trộn 0,1 % (phần thể tích) dietypyrocarbonat vào nước cất, lắc khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 ^oC trong 15 min.

Đun tan hoàn toàn 1,5 g agaroza trong 100 ml dung dịch đệm TBE đậm đặc 0,5 lần. Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 10 min (đạt 55 °C đến 60 °C).

Chuyển agaroza vừa đun vào một chai chuyên dùng để pha etidi bromua, sau đó cho vào 4ml etidi bromua 10 mg/ml (cho 4 ml etidi bromua 10 mg/ml vào 100 ml dung dịch agaroza), trộn đều (tránh tạo bọt khí). Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, sau đó đổ agaroza vào khuôn đạt độ dày khoảng 3 mm đến 5 mm. Để đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt bảng thạch vào trong máng điện di, các giếng của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE đậm đặc 0,5 lần cho đến khi ngập bảng thạch trước khi cho mẫu vào để điện di.

Sau khi điện di, ngâm bảng thạch vào dung dịch etidi bromua 10 mg/ml (5 µl hoà tan trong 100 ml nước cất). Dung dịch này phải bao phủ toàn bộ bảng thạch. Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Sau đó, vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa với nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề mặt bảng thạch.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

Có thể sử dụng một trong hai phương pháp tách chiết DNA sau:

CHÚ THÍCH Do nguồn mẫu khác nhau có hàm lượng DNA không giống nhau, vì vậy cần điều chỉnh nồng độ DNA bằng cách hoà tan DNA vào các thể tích dung dịch DEPC hoặc dung dịch TE phù hợp theo lượng DNA thu được. Việc xác định hàm lượng DNA có thể tiến hành bằng cách đo giá trị mật độ quang (OD) của dịch pha loãng theo tỉ lệ 1:5 (10 µl dịch DNA thu được: 40 µl nước) ở bước sóng 260 nm (OD₂₆₀) hoặc bằng cách điện di 10 µl dịch DNA thu được ở nồng độ thạch 1,5 %.

Nếu các mẫu phải bảo quản trong thời gian dài, nên sử dụng dung dịch đệm TE để hoà tan cặn DNA và bảo quản ở –20 ^oC. Sử dụng ngay dịch này cần phải bảo quản ở 2 ^oC đến 8 ^oC.

7.3 Khuếch đại DNA

Để đảm bảo kết quả phân tích có độ tin cậy cao nên quá trình khuếch đại cần chuẩn bị đầy đủ các yếu tố sau:

a) DNA của mẫu đã biết trước không có virut IHHNV;

b) DNA của mẫu đã biết trước dương tính IHHNV (bao gồm mẫu mô, máu hoặc plasmid); DNA mẫu trắng (nước cất hai lần).

1 µl dịch chiết DNA cho vào ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

1 µl mẫu kiểm chứng dương tính cho vào một chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

1 µl mẫu kiểm chứng âm tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR (5.4.1 hoặc 5.4.2).

Sau khi cho dịch tách chiết mẫu, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính vào ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR đã được đánh dấu, đậy nắp ống thật chặt, ly tâm nhẹ để dung dịch tụ hết xuống đáy ống không còn dính trên thành ống. Đặt các ống chứa hỗn hợp phản ứng khuếch đại PCR vào máy luân nhiệt thực hiện phản ứng theo chương trình sau:

CHÚ THÍCH Dung dịch đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm là chỉ thị bromphenol blue; màu xanh nhạt là chỉ thị xylen cyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng gel agaroza, dừng quá trình điện di.

Để đảm bảo kết quả phân tích có độ tin cậy cao, cần tiến hành điện di mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu kiểm chứng dương tính, thang DNA chuẩn, mẫu phân tích.

7.4.4 Nhuộm etidi bromua bảng thạch (chỉ áp dụng cho nhuộm ngoài)

Xem 5.6.5.4.

Đọc kết quả điện di theo trình tự như sau:

Theo phần diễn giải các kết quả, ghi lại phát hiện hoặc không phát hiện virut IHHNV trong phần mẫu thử.

Kết quả được coi là âm tính khi:

– phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

– không phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

– thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

– mẫu phân tích không có vạch DNA đích.

Kết quả được coi là dương tính khi:

– phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

– không phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

– thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

– mẫu phân tích xuất hiện vạch DNA đích.

Khi thử nghiệm cho kết quả nghi ngờ (không phát hiện vạch sáng ở mẫu kiểm chứng dương tính, phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính hoặc thang DNA không phân vạch rõ ràng...), thì phải tiến hành phân tích lại.

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu có);

– phương pháp thử sử dụng;

– chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có);

– kết quả thử nghiệm thu được;

– báo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.