TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 7700-1 : 2007 iso 11290-1 : 1996 with amendment 1: 2004
tải về 0.57 Mb.
|
| TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 7700-1 : 2007 ISO 11290-1 : 1996 WITH AMENDMENT 1:2004 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG LISTERIA MONOCYTOGENES - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
TCVN 7700-1:2007 hoàn toàn tương đương với ISO 11290-1:1996, sửa đổi 1:2004; TCVN 7700-1:2007 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. TCVN 7700:2007 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogens, bao gồm: - Phần 1: Phương pháp phát hiện; - Phần 2: Phương pháp định lượng. Lời giới thiệu Do tính đa dạng của thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nên phương pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp này, có thể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu hoàn toàn chỉ vì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp này khi có thể. Khi tiêu chuẩn này được soát xét thì cần phải tính đến mọi thông tin liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm đĩa này phải tuân theo và các nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trong trường hợp các sản phẩm cụ thể. Việc hài hòa các phương pháp thử có thể không thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm có thể tồn tại các tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn này. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn cho sản phẩm cần thử nghiệm thì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Thông thường khi các tiêu chuẩn như thế được soát xét, thì chúng phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, sao cho cuối cùng chỉ còn các sai lệch với phương pháp đếm đĩa này là các lý do kỹ thuật được thừa nhận. VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG LISTERIA MONOCYTOGENES - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 1: Detection method CẢNH BÁO - Để đảm bảo an toàn cho nhân viên phòng thử nghiệm, cần chú ý rằng các phép thử phát hiện Listeria monocytogenes phải thực hiện trong các phòng thử nghiệm được trang bị đúng, dưới sự kiểm soát của các nhà vi sinh vật học có kinh nghiệm và hết sức thận trọng với công việc thải tất cả các nguyên vật liệu đã nuôi ấm. Đặc biệt, phụ nữ mang thai không được tiếp xúc trực tiếp với dịch cấy L. monocytogenes. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp phát hiện Listeria monocytogenes. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi như đã nêu trong lời giới thiệu. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi. TCVN 6507 (ISO 6887), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1. Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes) Vi sinh vật tạo thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường đặc chọn lọc và cho thấy rõ các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa như đã mô tả, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này. 3.2. Phát hiện Listeria monocytogenes (Detection of Listeria monocytogenes) Xác định sự có mặt hay không có mặt các vi sinh vật, tính theo khối lượng hoặc theo thể tích sản phẩm, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc Trong giới hạn của tiêu chuẩn này thì việc phát hiện L. monocytogenes cần đến ít nhất bốn giai đoạn liên tiếp (Xem sơ đồ trong phụ lục A). CHÚ THÍCH 1: Listeria spp. có thể có mặt với một lượng nhỏ và thường đi kèm với một lượng lớn đáng kể các chi (loài) khác, do đó cần phải có bước tăng sinh chọn lọc. Cũng cần phát hiện các Listeria spp. bị tổn thương và môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu với chất ức chế có nồng độ giảm, được thực hiện ở cuối công đoạn này.
Nuôi cấy môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu chứa một thể tích liti clorua và một nửa thể tích acriflavin và axit nalidixic (canh thang nửa Fraser), đồng thời canh thang này cũng được sử dụng làm dịch pha loãng cho phần mẫu thử (9.1). Ủ phần mẫu thử ở 30 °C trong 24 giờ.
Nuôi cấy môi trường thứ cấp tăng sinh lỏng nồng độ đầy đủ (canh thang Fraser) với dịch cấy thu được trong 4.1. Ủ canh thang Fraser ở 35 °C hoăc 37 °C trong 48 giờ.
Từ dịch cấy thu được trong 4.1 và 4.2, cấy đĩa trên hai môi trường đặc chọn lọc: Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti (ALOA1)) (Xem [1] và B.3); - bất kỳ môi trường đặc chọn lọc khác do phòng thử nghiệm chọn bổ sung cho Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti, như Oxford hoặc PALCAM. Ủ Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti ở 37 °C ± 1 °C và kiểm tra sau 24 giờ ± 3 giờ, và sau 24 giờ ± 3 giờ tiếp theo, nếu cần, để kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ là L. monocytogenes. Ủ môi trường chọn lọc thứ hai ở nhiệt độ thích hợp và kiểm tra môi trường này sau một khoảng thời gian tương ứng. 4.4. Khẳng định Cấy truyền các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định lên đĩa theo 4.3 và khẳng định bằng các thử nghiệm hình thái, sinh lý và sinh hóa thích hợp. 5. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử
Về thực hành trong phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218). CHÚ THÍCH 2: Do trong tiêu chuẩn sử dụng một lượng lớn môi trường nuôi cấy và thuốc thử, để cho nội dung tiêu chuẩn được gọn nên thành phần và cách chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử được đưa riêng vào trong phụ lục B.
Xem B.1.
5.3. Môi trường tăng sinh chọn lọc thứ cấp: Canh thang Fraster với các chất chọn lọc có nồng độ đầy đủ (canh thang Fraser) Xem B.2.
5.4. Môi trường chọn lọc đặc đổ đĩa 5.4.1. Môi trường thứ nhất: Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti (ALOA1)) [1] Xem B.3.
5.4.2. Môi trường thứ hai Việc chọn môi trường thứ hai là để cho phòng thử nghiệm tự chọn. Nếu sử dụng môi trường bán sẵn thì phải tuân thủ hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất một cách chính xác. 5.5. Môi trường nuôi cấy đặc: Thạch từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEA) Xem B.5.
5.6. Môi trường nuôi cấy lỏng: Canh thang từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEB) Xem B.6.
5.7. Thạch huyết cừu Xem B.7.
5.8. Canh thang sử dụng cacbohydrat (ramnoza và xyloza) Xem B.8.
5.9. Thạch di động (tùy chọn) Xem B.9.
5.10. Môi trường CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen) và các chủng xét nghiệm Xem B.10. 5.11. Dung dịch hydro peroxit Xem B.11. 5.12. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) Xem B.12. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau: 6.1. Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) 6.2. Tủ sấy hoặc tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 25 °C ± 1 °C đến 50 °C ± 1 °C. 6.3. Tủ ấm, có thể duy trì môi trường, các đĩa và các ống nghiệm trong dải nhiệt độ sau: a) ở 25 °C ± 1 °C; b) ở 30 °C ± 1 °C và c) Ở 35 °C ± 1 °C hoặc 37 °C ± 1 °C. 6.4. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 47 °C ± 2 °C. 6.5. Que cấy vòng, bằng hợp chất platin/iridin hoặc niken/crom, có đường kính khoảng 3 mm, và que cấy bằng cùng chẩt liệu, hoặc đũa thủy tinh uốn cong một đẩu hoặc que cấy vòng sử dụng một lần. 6.6. Máy đo pH, có thể đọc chính xác tới 0,01 đơn vị pH ở nhiệt độ 25 °C và có thể đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH. 6.7. Ống nghiệm hoặc bình thủy tinh, có dung tích thích hợp, để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy và nuôi ấm môi trường lỏng. 6.8. Ống đong, dung tích 50 ml đến 1 000 ml, để chuẩn bị các dung dịch pha loãng và môi trường hoàn chỉnh. 6.9. Pipet chia độ xả hết, dung tích danh định 1 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng là 0,1 ml và 0,5 ml. 6.10. Đĩa Petri, đường kính từ 90 mm đến 100 mm. 6.11. Bình, thích hợp cho việc ủ trong môi trường vi hiếu khí (tùy chọn). 6.12. Hỗn hợp khí (tùy chọn), có thành phần qui định dùng để ủ vi hiếu khí: hàm lượng CO2 từ 5 % đến 12%, O2 từ 5 % đến 15 % và N2 là 75 % 6.13. Thiết bị dùng cho phép thử rọi Henry (tùy chọn) Xem phụ lục C. 6.14. Kính hiển vi, tốt nhất là loại phản pha, có lam kính và lamen (coverslip). 7. Lấy mẫu Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu sản phẩm có liên quan thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này. 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn riêng cho sản phẩm có liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn riêng đó thì các bên tự thỏa thuận về vấn đề này. 9. Cách tiến hành
Xem TCVN 6507 (ISO 6887) và tiêu chuẩn thích hợp đối với sản phẩm có liên quan. Để chuẩn bị huyền phù ban đầu, sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu được qui định trong 5.2, làm dịch pha loãng. Nhìn chung, để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho x g hoặc x ml phần mẫu thử vào 9x ml hoặc 9x g môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu (5.2), để thu được tỷ lệ của phần mẫu thử và môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu là 1/10 (khối lượng/thể tích hoặc thể tích/thể tích). 9.2. Tăng sinh ban đầu Ủ huyền phù ban đầu [6.3.b)], đã chuẩn bị theo 9.1, ở nhiệt độ 30 °C trong 24 giờ ± 2 giờ. CHÚ THÍCH 3: Trong quá trình ủ huyền phù có thể xuất hiện màu đen.
CHÚ THÍCH 4: Nhiệt độ môi trường cấy cần được thống nhất giữa các bên có liên quan và ghi lại trong báo cáo kết quả thử nghiệm. 9.4. Cấy ra đĩa và nhận dạng 9.4.1. Từ dịch cấy tăng sinh ban đầu đã ủ 24 giờ ± 2 giờ ở 30 °C (9.2), dùng vòng cấy hoặc đũa thủy tinh (6.5) lấy một phần dịch cấy và cấy lên bề mặt môi trường đổ đĩa chọn lọc thứ nhất, Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti (5.4.1), sao cho thu được các khuẩn lạc tách biệt tốt. Tiến hành tương tự với môi trường đổ đĩa chọn lọc thứ hai (5.4.2). 9.4.2. Từ môi trường tăng sinh thứ cấp đã ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 35 °C hoặc 37 °C (9.3.2), lặp lại các thao tác trong 9.4.1 với hai môi trường chọn lọc đổ đĩa. 9.4.3. Lật ngược các đĩa thu được trong 9.4.1 và 9.4.2 và đặt chúng vào tủ ấm đặt ở 37 °C đối với Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti (5.4.1) và ở nhiệt độ thích hợp đối với môi trường chọn lọc thứ hai (5.4.2). Nếu môi trường thứ hai được sử dụng là loại có bán sẵn thì theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 9.4.4. Sau khi ủ 24 giờ ± 3 giờ (và ủ tiếp 24 giờ ± 3 giờ nếu thấy khuẩn lạc mọc yếu hoặc không quan sát thấy khuẩn lạc nào mọc sau 24 giờ) đối với Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti hoặc trong một thời gian thích hợp (môi trường thạch chọn lọc thứ hai), kiểm tra các đĩa (9.4.3) về sự có mặt các khuẩn lạc nghi ngờ là Listeria spp. 9.4.4.1. Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti: các khuẩn lạc màu xanh được bao quanh bởi quầng sáng đục (các khuẩn lạc điển hình) được coi là L. monocytogenes. Nếu mọc rất thưa, hoặc nếu không quan sát thấy khuẩn lạc nào, hoặc nếu sau khi ủ 24 giờ ± 3 giờ mà không có mặt khuẩn lạc điển hình nào, thì ủ lại các đĩa thêm 24 giờ ± 3 giờ. CHÚ THÍCH 1: Một số chủng L. monocytogenes cho thấy quầng sáng rất yếu (thậm chí không có quầng sáng) trong các trường hợp bị ức chế, cụ thể là ức chế bởi axit. CHÚ THÍCH 2: Một số chủng L. monocytogenes được đặc trưng bởi hoạt tính PIPCL (phospholipaza inositol phosphatidyl C) chậm. Các vi khuẩn như thế được phát hiện khi thời gian ủ tăng lên, ví dụ: 4 ngày. Một số chủng như thế có thể là loại gây bệnh (xem [2]).
Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc thì lấy tất cả để khẳng định. 9.5.1.2. Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt đĩa thạch TSYEA (5.5) đã sấy khô trước sao cho các khuẩn lạc mọc tách biệt rõ. Đặt các đĩa này trong tủ ấm [6.3 c)] ở 35 °C hoặc 37 °C trong 18 giờ đến 24 giờ, hoặc cho đến khi có các khuẩn lạc mọc. CHÚ THÍCH 7: Nhiệt độ của môi trường nuôi cấy do các bên tự thỏa thuận và phải được ghi vào báo cáo kết quả thử nghiệm. Các khuẩn lạc điển hình có đường kính từ 1 mm đến 2 mm, lồi, không màu và toàn bộ mép mờ đục. Nếu các khuẩn lạc không tách biệt rõ thì lấy một khuẩn lạc Listeria điển hình cho vào một đĩa TSYEA khác. Tiến hành các phép thử sau đây trên các khuẩn lạc của dịch cấy thuần khiết trên TSYEA. CHÚ THÍCH 8: Có thể thực hiện phép thử rọi Henry (xem phụ lục C), nếu cần. Đối với phép thử này, thì quan trọng là môi trường thạch phải mỏng (15 ml/đĩa).
Lấy một khuẩn lạc tách biệt tốt thu được trong 9.5.1.2 và hòa vào một giọt dung dịch hydro peroxit (5.11) trên lam kính. Sự hình thành ngay bọt khí chứng tỏ phản ứng dương tính. 9.5.3. Nhuộm gram Tiến hành nhuộm gram các khuẩn lạc đã tách được trong 9.5.1.2. Listeria spp. biểu lộ Gram dương, dạng hình que ngắn và mảnh. 9.5.4. Thử tính di động (nếu cần)2) Lấy một khuẩn lạc tách biệt tốt thu được trong 9.5.1.2 và hòa vào ống nghiệm đựng TSYEB (5.6). Ủ trong tủ ấm [6.3a)] để 8 giờ đến 24 giờ ở 25 °C cho đến khi quan sát thấy môi trường mờ đục. Dùng vòng cấy (6.5) lấy một giọt dịch cấy ở trên cho lên lam kính hiển vi sạch bằng thủy tinh. Đậy lamen lên đỉnh và kiểm tra bằng kính hiển vi (6.14). Listeria spp. có dạng hình que ngắn, mảnh chuyển động hỗn loạn. Các chủng vi khuẩn mọc ở nhiệt độ trên 25 °C có thể không cho thấy chuyển động này. Phải luôn luôn so sánh với một chủng vi khuẩn đã biết trước. Các dạng cầu, trực khuẩn lớn, hoặc các trực khuẩn chuyển động nhanh, dạng bơi thì không phải là Listeria spp. Một phép thử khác để kiểm tra tính di động: sử dụng kim cấy (6.5) lấy dịch cấy từ khuẩn lạc điển hình trên thạch TSYEA (9.5.1.2) cấy đâm sâu vào môi trường thạch di động (5.9), ủ 48 giờ trong tủ ấm [6.3 a)] để ở 25 °C. Kiểm tra kiểu mọc xung quanh vết cấy. Listeria spp. là loại di động, cho kiểu mọc điển hình giống như cái ô. Nếu mọc chưa đủ, thì nuôi ấm thêm 5 ngày và kiểm tra lại vết cấy.
Làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng. Lấy một khuẩn lạc điển hình tách biệt tốt trong 9.5.1.2 và dùng que cấy (6.5) chấm vào mỗi ô một khuẩn lạc. Đồng thời chấm các chủng kiểm tra dương tính (L. monocytogenes) và âm tính (L. innocua). Sau khi ủ ở 35 °C hoặc 37 °C trong 24 giờ ± 2 giờ, kiểm tra các chủng từ mẫu thử và chuẩn so sánh. L. monocytogenes tạo ra các vùng sáng, trong và hẹp (phân giải huyết )3); (xem hình 1) L. innocua có thể tạo ra vùng không trong xung quanh vết chấm. Các L. seeligeri tạo ra vùng phân giải huyết yếu. Còn L. ivanovii thường tạo ra các vùng vạch trong, rộng trong vùng phân giải huyết . Đặt các đĩa vào vùng rọi sáng để so sánh các chủng xét nghiệm với chủng chuẩn.
Hòa một khuẩn lạc vào 150 l TSYEB (B.6), ủ 2 giờ ở 37 °C. Thêm 150 l huyền phù huyết cầu cừu (B.4). Ủ ở 37 °C từ 15 phút đến 60 phút, rồi để khoảng 2 giờ trong tủ lạnh ở 3 °C ± 2 °C. Kiểm tra hoạt tính phân giải huyết cừu. Nếu không xác định đuợc phản ứng thì để tiếp đến 24 giờ ± 3 giờ ở 3 °C ± 2 °C. 9.6.2. Sử dụng hydrat cacbon Dùng que cấy vòng (6.5) lấy dịch cấy thu được từ TSYEB (9.5.4) cấy vào từng ống canh thang hydrat cacbon (5.8). Nuôi ấm ở 35 °C hoặc 37 °C đến 5 ngày. Các phản ứng dương tính (sinh axit) cho màu vàng và phần lớn xảy ra trong vòng từ 24 giờ đến 48 giờ. 9.6.3. Phép thử CAMP Ria cấy các chủng Staphylococcus aureus và Rhodococcus equi (B.10.4) thành những vạch đơn ngang đĩa thạch huyết cừu (5.7 hoặc B.10.3) sao cho hai vệt cấy này song song và cân đối nhau trên đĩa (xem hình 1). Vết cấy cần phải mảnh và đều. Điều này được thực hiện bằng cách giữ que cấy vòng hoặc que cấy (6.5) vuông góc với mặt thạch. Ria cấy chủng xét nghiệm đã chuẩn bị trong 9.5.1.2 theo cách tương tự, vuông góc với các vệt cấy trên sao cho chủng xét nghiệm và các chủng cho phản ứng không chạm nhau nhưng phải rất gần nhau, cách nhau từ 1 mm đến 2 mm. Một vài chủng xét nghiệm có thể được ria cấy trên cùng một đĩa thạch. Đống thời, ria cấy các chủng đối chứng lần lượt từ L. monocytogenes, L. innocua và L. ivanivii. Nếu dùng thạch huyết (5.7), thì nuôi ấm các đĩa ở 35 °C hoặc 37 °C từ 18 giờ đến 24 giờ. Nếu dùng đĩa lớp kép (B.10.3) thì nuôi ấm các đĩa từ 12 giờ đến 18 giờ ở 35 °C hoặc 37 °C. Vùng phân giải huyết ở điểm giao nhau của chủng xét nghiệm với mỗi chủng S. aureus và R. equi tăng lên thì được coi là phản ứng dương tính. Phản ứng dương tính với R.equi cho thấy một quầng phân giải huyết rộng (5 mm đến 10 mm) “hình đầu mũi tên”. Phản ứng được coi là âm tính nếu một quầng phân giải huyết nhỏ trải ra chỉ khoảng 1 mm ở điểm giao nhau của chủng xét nghiệm và vùng khuếch tán của chủng R.equi. Phản ứng dương tính với S.aureus cho thấy một vùng tròn nhỏ từ quầng phân giải huyết lan rộng hơn khoảng 2 mm so với chủng xét nghiệm và nằm trong vùng phân giải huyết yếu do sự phát triển của chủng S. aureus. Các vùng phân giải huyết rộng không xuất hiện xung quanh vệt cấy của chủng S. aureus và L. monocytogenes. 
CHÚ THÍCH 1. Cấy các đĩa thạch huyết lớp mỏng (5.7 hoặc B.10.3). Các vạch thẳng đứng biểu thị các vệt cấy của các chủng S.aureus (S) và R.equi (R). Các đường ngang biểu thị các vệt cấy của chủng xét nghiệm. Các vùng gạch chéo cho thấy các vị trí quầng phân giải huyết tăng lên. 2. Các vùng đánh dấu lấm chấm biểu thị vùng chịu ảnh hưởng của S.aureus. Hình 1 - Cấy và diễn giải các đĩa thử CAMP 9.7. Diễn giải các đặc điểm hình thái và sinh lý và phản ứng sinh hóa Tất cả các chủng Listeria spp. đều là các trực khuẩn nhỏ, Gram dương có tính di động. Chúng dương tính với catalaza. L. monocytogenes được phân biệt với các loài khác bằng các đặc trưng trong bảng 1. 9.8. Khẳng định cuối cùng Các chủng được coi là L. monocytogenes (9.7) có thể gửi tới phòng thử nghiệm chuẩn Listeria đã được công nhận để khẳng định về huyết thanh học hoặc, nếu có thể, về kiểu loại tiềm tan. Việc gửi đến phòng thử nghiệm phải kèm theo tất cả các thông tin có liên quan đến các chủng này. Bảng 1 - Các phản ứng nhận biết Listeria spp.
9.9. Các chủng kiểm chứng Để kiểm tra tính năng của môi trường tăng sinh và môi trường nhận dạng, nhằm đảm bảo cho việc phát triển L. monocytogenes, cần cho dung dịch pha loãng mẫu chuẩn từ chủng L. monocytogenes mới phân lập và các chủng kiểm chứng âm tính (ví dụ: các Steptococcus dạng que) vào bình kiểm chứng đựng môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu (xem 9.2). Cho vào mỗi bình từ 10 tế bào đến 100 tế bào L. monocytogenes hoặc các chủng kiểm chứng âm tính. Tiến hành với các bình kiểm chứng giống như đối với mẫu cấy xét nghiệm để chứng minh rằng thu được chủng kiểm tra dương tính. 10. Biểu thị kết quả Theo diễn giải các kết quả, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Listeria monocytogenes trong phần mẫu thử, theo khối lượng qui định bằng gam hay mililit mẫu thử. CHÚ THÍCH 10: Nếu các loài Listeria khác được tách biệt rõ, thì cũng có thể được ghi trong báo cáo kết quả thử nghiệm, nếu các bên có liên quan nhất trí. 11. Độ chụm
Không thể biểu thị độ chụm của phương pháp định tính bằng cách sử dụng các thông số độ lặp lại và độ tái lập mà chỉ có thể được tính bằng phương pháp định lượng. Do đó các tính năng thực hiện đã được lựa chọn (xem [3]). Các đặc trưng này là: độ đúng (độ nhạy đối với mẫu dương tính, tính đặc hiệu đối với mẫu âm tính), xác suất lặp lại và xác suất tái lập (xem 11.2, 11.3 và 11.4). Các giá trị đặc trưng này đã được xác định bằng phép thử liên phòng thử nghiệm trên phương pháp, được tổ chức trong phạm vi của dự án Châu âu (xem phụ lục D). Các đặc trưng thực hiện đã được xác định trên ba loại mẫu thực phẩm bị nhiễm bẩn ở các mức khác nhau và đối với mẫu chuẩn. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các giá trị đã nêu trong phụ lục D.
Độ đúng là phần trăm mẫu thử được nhận dạng đúng. Đối với các mẫu dương tính, độ đúng được gọi là độ nhạy và là phần trăm mẫu được nhận dạng đúng là dương tính. Đối với mục đích của phép tính này, thì phải thừa nhận rằng tất cả các mẫu dương tính giả định trong thực tế có chứa sinh vật này. Đối với các mẫu âm tính, độ đúng được gọi là tính đặc thù và là phần trăm mẫu được nhận dạng đúng âm tính. 11.2.2. Giá trị tổng thể Như một chỉ thị chung của tính đặc thù (Sp), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Sp = 97,4 %. Như một chỉ thị chung của độ nhạy (Se), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Se = 85,2 %. Đối với các mẫu chuẩn (sử dụng các viên nang chứa 23 CFU, do RIVM, Hà Lan sản xuất), đã thu được giá trị sau đây: Se = 89,5 %. Các giá trị này có thể được diễn giải là trong 85,2 % các trường hợp mẫu chứa L. monocytogenes được công nhận là dương tính khi được phân tích bằng phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này.
Xác suất lặp lại là phần trăm cơ hội tìm thấy kết quả tương tự (nghĩa là cả hai dương tính hoặc cả hai âm tính) từ hai phần mẫu thử giống hệt nhau được phân tích trong cùng một phòng thử nghiệm, trong các điều kiện lặp lại (nghĩa là do cùng một người thao tác, sử dụng cùng thiết bị và cùng thuốc thử trong một khoảng thời gian ngắn nhất có thể). Do đó xác suất lặp lại là tương đương độ lặp lại đối với phương pháp định lượng. Để tính xác suất lặp lại từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm, thì khả năng mà hai mẫu cho cùng kết quả được tính cho lần lượt từng phòng thử nghiệm tham gia và khả năng này là giá trị được tính trung bình cho tất cả các phòng thử nghiệm. 11.3.2. Giá trị tổng thể Là một chỉ thị chung của xác suất lặp lại (Ac), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Ac = 88,7 %. Đối với các mẫu chuẩn (sử dụng các viên nang chứa 23 CFU, do RIVM, Hà Lan sản xuất), đã thu được giá trị sau đây: Ac = 88,2 %. Các giá trị này có thể được diễn giải rằng, nếu hai phần mẫu thử giống hệt nhau có chứa L. monocytogenes do cùng một người phân tích trong một khoảng thời gian ngắn và trong các điều kiện thao tác chính xác như nhau, có 88,7 % cơ hội thu được kết quả tương tự (có mặt L. monocytogenes) đối với hai phần mẫu thử. 11.4. Xác suất tái lập (Concordance) 11.4.1. Định nghĩa Xác suất tái lập là phần trăm cơ hội tìm thấy kết quả tương tự đối với hai mẫu thử giống hệt nhau được phân tích trong hai phòng thử nghiệm khác nhau. Do đó, xác suất tái lập là tương đương độ tái lập đối với phương pháp định lượng. Để tính xác suất tái lập từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm, mỗi quan sát trong mỗi phòng thử nghiệm tham gia được lấy lần lượt, kết cặp với các kết quả thu được đối với mẫu cụ thể của tất cả các phòng thử nghiệm khác. Xác suất tái lập là phần trăm của tất cả các cặp cho kết quả như nhau trên tất cả các cặp của dữ liệu. 11.4.2. Giá trị tổng thể Là một chỉ thị chung của xác suất tái lập (Cc), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Cc = 84,4 %. Đối với các mẫu chuẩn (sử dụng các viên nang chứa 23 CFU, do RIVM, Hà Lan sản xuất), đã thu được giá trị sau đây: Cc = 80,8 %. Các giá trị này có thể được diễn giải rằng, nếu hai phần mẫu thử giống hệt nhau có chứa L. monocytogenes do hai phòng thử nghiệm thực hiện có 84,4 % cơ hội thu được kết quả tương tự (có mặt L. monocytogenes) đối với hai phần mẫu thử. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp đã sử dụng, nhiệt độ ủ và kết quả thu được. Bảo cáo kết quả thử nghiệm cũng cần phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả. Báo cáo thử nghiệm cũng bao gồm các thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử.
(qui định) SƠ ĐỒ QUI TRÌNH 
PHỤ LỤC B (qui định) THÀNH PHẦN VÀ CÁCH CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ
Каталог: data -> 2017 2017 -> Tcvn 6147-3: 2003 iso 2507-3: 1995 2017 -> Các Cục Hải quan tỉnh, thành phố 2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10256: 2013 iso 690: 2010 2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17/02/2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8400-3: 2010 2017 -> TIÊu chuẩn nhà NƯỚc tcvn 3133 – 79 2017 -> Căn cứ Luật Tổ chức chính quyền địa phương ngày 19 tháng 6 năm 2015 2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17 tháng 02 năm 2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2017 -> Btvqh10 ngày 25 tháng 5 năm 2002 của Ủy ban Thường vụ Quốc hội về tự vệ trong nhập khẩu hàng hóa nước ngoài vào Việt Nam tải về 0.57 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||