TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10783-1: 2015 iso/ts 15216-1: 2013



tải về 0.5 Mb.
trang3/3
Chuyển đổi dữ liệu02.06.2018
Kích0.5 Mb.
1   2   3
F.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong (450 ± 5) ml nước (5.2.1), gia nhiệt nhẹ nếu cần. Chỉnh thể tích đến (1 000 ± 10) ml bằng nước và trộn kỹ. Khử trùng bằng hấp áp lực.

F.2. Hỗn hợp cloroform/butanol

F.2.1. Thành phần

Cloroform

(10 ± 0,1) ml

Butanol

(10 ± 0,1) ml

F.2.2. Chuẩn bị

Trộn các thành phần trên với nhau.

F.3. Dung dịch proteinase K

F.3.1. Thành phần

Proteinase K (30 U/mg)

(20 ± 0,1) mg

Nước (5.2.1)

(200 ± 2) ml

F.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan proteinase K trong nước. Trộn kỹ.

Bảo quản với các lượng để sử dụng ở (–20 ± 5) °C trong tối đa 6 tháng. Khi được rã đông, bảo quản ở (4 ± 2) °C và dùng trong 1 tuần.

F.4. Muối đệm phosphat (PBS)

F.4.1. Thành phần

NaCl

(8,0 ± 0,1) g

Kali clorua

(0,2 ± 0,01) g

Dinatri hydrophosphat

(1,15 ± 0,01) g

Kali dihydrophosphat

(0,2 ± 0,01) g

Nước (5.2.1)

(1 000 ± 2) ml

F.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, chỉnh đến pH 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Khử trùng bằng hấp áp lực, nếu cần.

F.5. Đệm Tris/glyxin/chất chiết thịt bò (TGBE)

F.5.1. Thành phần

Tris base [tris(hydroxymetyl)aminometan]

(12,1 ± 0,2) g

Glyxin

(3,8 ± 0,1) g

Chất chiết thịt bò

(10 ± 0,1) g

Nước (5.2.1)

(1 000 ± 1) ml

F.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, chỉnh đến pH 9,5 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Khử trùng bằng hấp áp lực, nếu cần.
PHỤ LỤC G

(Tham khảo)



QUÁ TRÌNH TẠO CÁC GỐC KIỂM SOÁT ADN MẠCH KÉP (DSADN)

G.1. Yêu cầu chung

Các plasmid đối chứng được tạo thành bằng cách gắn trình tự ADN đích vào một vector plasmid thích hợp sao cho trình tự đích là xuôi của trình tự xúc tác đối với ARN polymerase.

G.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ

G.2.1. Các tế bào khả biến chủng JM109.

G.2.2. Canh thang LB, Bacto trypton4) 10 g/l, cao nấm men 5 g/l, NaCl 10 g/l, chỉnh đến pH 7,0.

G.2.3. Thạch LB, canh thang LB bổ sung thạch 15 g/l.

G.2.4. Ampicillin.

G.2.5. Thuốc thử plasmid miniprep

G.2.6. Đá.

G.2.7. Máy ủ, có thể vận hành ở (37 ± 1) °C.

G.2.8. Máy ủ lắc hoặc tương đương, vận hành ở (37 ± 1) °C và khoảng 160 dao động/min.

G.3. Phiên mã

Thêm 1 ng đến 100 ng vật liệu kiểm soát dsADN đã tinh sạch trước vào các tế bào khả biến chủng JM109 (50 ± 0,5) µl và trộn kỹ. Làm lạnh trên đá trong (20 ± 1) min.

Ủ ở (42 ± 1) °C trong (45 ± 2) s sau đó làm lạnh ngay trên đá trong (120 ± 10) s.

Thêm (950 ± 10) µl canh thang LB vào các giếng sau đó lắc ở (37 ± 1) °C khoảng 160 dao động/min trong (90 ± 10) min.

Gạt (100 ± 2) µl canh thang đã ủ lên đĩa thạch LB có bổ sung 50 µg/ml amplicilin.

Ủ đĩa ở (37 ± 1) °C qua đêm, kiểm tra sự phát triển của các khuẩn lạc, sau đó bảo quản ở (4 ± 2) °C cho đến khi cần để tinh sạch ADN plasmid.

G.4. Tinh sạch ADN plasmid

Ủ (5 ± 0,1) ml canh thang LB bổ sung 100 µg/ml ampicilin có khuẩn lạc đơn lẻ chứa plasmid quan tâm.

Ủ ở (37 ± 1) °C qua đêm.

Tinh sạch ADN plasmid từ dịch nuôi cấy sử dụng thuốc thử minprep theo quy trình thích hợp; rửa giải trong (100 ± 2) µl đệm rửa giải.

Bảo quản gốc ADN plasmid ở (–20 ± 5) °C cho đến khi cần để chuẩn bị vật liệu kiểm soát dsADN (5.3.8).

G.5. Định lượng ADN plasmid

Sử dụng máy đo quang phổ xác định độ hấp thụ của gốc plasmid ở 260 nm.

Nhân độ hấp thụ đọc được với 5 x 10-8 để cho nồng độ của ADN, tính bằng gam trên microlit.

Chia số này cho khối lượng phân tử plasmid đơn lẻ, tính bằng gam, để tính nồng độ của ADN, tính bằng số bản sao trong một microlit.

Khối lượng của từng phân tử plasmid có thể tính được bằng cách nhân chiều dài plasmid trong cặp bazơ với 607,4 (khối lượng phân tử tương đối của cặp bazơ trung bình) và chia cho hệ số Avogadro (6,02 x 1023), ví dụ: plasmid kích thước 3 000 bp có khối lượng là 3,02 x 10-18 g.
PHỤ LỤC H

(Tham khảo)



QUÁ TRÌNH TẠO CÁC GỐC ARN KIỂM SOÁT BÊN NGOÀI (EC ARN)

H.1. Yêu cầu chung

Các plasmid kiểm soát được tạo thành bằng cách thắt trình tự ADN đích thành một vector plasmid thích hợp sao cho trình tự đích là xuôi của trình tự xúc tác đối với ARN polymerase.

H.2. Thuốc thử và thiết bị, dụng cụ

H.2.1. Enzym giới hạn dùng để tạo tuyến tính và các dung dịch đệm kết hợp.

H.2.2. Thuốc thử tinh sạch PCR.

H.2.3. Thuốc thử chuyển hóa In vitro ARN (ARN polymerase, NTP, dung dịch đệm .v.v…)

H.2.4. DNase không chứa RNase.

H.2.5. Thuốc thử tinh sạch ARN

H.2.6. Thuốc thử và thiết bị điện di trên gel ADN.

H.2.7. Thuốc thử và thiết bị real-time RT-PCR một bước (sử dụng mẫu dò thủy phân).

H.2.8. Tủ ấm, có thể duy trì ở (37 ± 1) °C

H.3. Tạo tuyến tính ADN plasmid

Cho 100 ng đến 500 ng ADN plasmid kiểm soát đã tinh sạch vào hỗn hợp phản ứng chứa enzym giới hạn thích hợp (để có tuyến tính plasmid ở điểm bắt đầu xuôi của trình tự đích) và các dung dịch đệm theo khuyến cáo của nhà sản xuất enzym.

Ủ ở (37 ± 1) °C trong (120 ± 5) min.

Tinh sạch ADN từ hỗn hợp mastermix sử dụng thuốc thử tinh sạch PCR, rửa giải trong (50 ± 0,5) µl dung dịch đệm rửa giải.

Kiểm tra độ tuyến tính sử dụng điện di gel (so sánh chất lỏng được tinh sạch đã tuyến tính với plasmid không tuyến tính).

H.4. Phiên mã ARN in vitro

Cho 100 ng đến 500 ng plasmid ADN tuyến tính đã tinh sạch vào hỗn hợp phản ứng phiên mã ARN in vitro đã chuẩn bị theo khuyến cáo của nhà sản xuất enzym ARN polymerase .

Ủ ở (37 ± 1) °C trong (120 ± 5) min.

Tinh sạch ARN sử dụng thuốc thử tinh sạch ARN, rửa giải trong (100 ± 1) µl nước (5.2.1).

H.5. Kiểm tra việc nhiễm ADN

Chuẩn bị hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR đích đặc hiệu (5.3.7), tách thành hai phần và bất hoạt enzym RT trong một phần bằng cách gia nhiệt ở (95 ± 2) °C trong (5,0 ± 0,5) min.

Dùng cả hai phần hỗn hợp mastemix phụ thuộc EC ARN gốc vào real-time RT-PCR dọc theo dãy dịch pha loãng dsADN làm đường chuẩn (8.4).

Nếu mức có thể phát hiện được trong phần EC ARN gốc được thử nghiện với hỗn hợp mastemix đã xử lý nhiệt lớn hơn 0,1 % so với mức trong phần mẫu thử với hỗn hợp mastermix chưa xử lý nhiệt (nếu chênh lệch Cq giữa EC ARN gốc được thử với hỗn hợp mastermix xử lý nhiệt và hỗn hợp mastermix chưa xử lý nhiệt nhỏ hơn 10 đối với đường chuẩn dsADN có độ dốc lý tưởng –3,32) thì EC ARN gốc bị nhiễm ADN và phải được xử lý lại bằng DNase (I.3). Nếu mức phát hiện nhỏ hơn 0,1 % thì bảo quản ở (–20 ± 5) °C cho đến khi cần để chuẩn bị vật liệu kiểm soát EC ARN (5.3.8).

H.6. Định lượng EC ARN

Sử dụng máy đo quang phổ xác định độ hấp thụ của EC ARN gốc đã xử lý DNase ở bước sóng 260 nm.

Nhân độ hấp thụ đọc được với 4 x 10-8 để được nồng độ của ARN, tính bằng gam trên microlit.

Chia số này cho khối lượng phân tử EC ARN đơn lẻ, tính bằng gam, để tính nồng độ ARN, tính bằng số bản sao trong một microlit.

Khối lượng của từng phân tử ARN có thể tính được bằng cách nhân chiều dài ARN trong ribonucleotid với 320,5 (khối lượng phân tử tương đối trung bình của ribonucleotid) và chia cho hệ số Avogadro (6,02 x 1023), ví dụ: phân tử ARN của 200 ribonucleotid có khối lượng là 1,06 x 10-19 g.
PHỤ LỤC I

(Tham khảo)



SƠ ĐỒ ĐĨA QUANG ĐIỂN HÌNH

Bảng I.1 – Sơ đồ đĩa quang điển hình



5 µl ARN ( 1 µl EC ARN) và 20 µl hỗn hợp mastermix trong một giếng.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] BOOM R., SOL C.J., SALIMANS M.M., JANSEN C.L., WERTHEIM-VAN DILLEN P.M., VAN DER NOORDAA J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990, 28pp. 495-503.

[2] COSTAFREDA M.I., BOSCH A., PINTÓ R.M. Development, evaluation, and standardization of a real- time TaqMan reverse transcription-PCR assay for quantification of hepatitis A virus in clinical and shellfish samples. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72pp. 3846-3855.

[3] dA SILVA A.K., LE SAUX J.C., PARNAUDEAU S., POMMEPUY M., ELIMELECH M., LE GUYADER F.S. Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: Different behaviors of genogroups I and II. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73pp. 7891-7897.

[4] SVRAKA S., DUIZER E., VENNEMA H., dE BRUIN E., VAN DER VEER B., DORRESTEIJN B. et al. Etiological role of viruses in outbreaks of acute gastroenteritis in The Netherlands from 1994 through 2005. J. Clin. Microbiol. 2007, 45pp. 1389-1394.

[5] LOISY F., ATMAR R.L., GUILLON P., LE CANN P., POMMEPUY M., LE GUYADER F.S. Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish. J. Virol. Methods. 2005, 123pp. 1-7.

[6] KACEYAMA T., KOJIMA S., SHINOHARA M., UCHIDA K., FUKUSHI S., HOSHINO F.B. et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR. J. Clin. Microbiol. 2003, 41pp. 1548-1557.

[7] LE GUYADER F.S., PARNAUDEAU S., SCHAEFFER J., BOSCH A., LOISY F., POMMEPUY M. et al. Detection and quantification of noroviruses in shellfish. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75pp. 618-624.

[8] PINTO R.M., COSTAFREDA M.I., BOSCH A. Risk assessment in shellfish-borne outbreaks of hepatitis A. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75pp. 7350-7355.

[9] MARTIN L.R., DUKE G.M., OSORIO J.E., HALL D.J., PALMENBERG A.C. Mutational analysis of the mengovirus poly(C) tract and surrounding heteropolymeric sequences. J. Virol. 1996, 70pp.2027-2031.

[10] TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

[11] ISO 22118, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection and quantification of food-borne pathogens – Performance characteristics.

[12] ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions.

1) Invitrogen RNA UltrasenseTM là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ Invitrogen. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

2 ATCC® VR-1597TM và ATCC® CCL-2TM là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ Viện giữ giống mẫu của Mỹ (American type culture collection). Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu được chứng minh là đáp ứng được các yêu cầu của quy trình.

3 BioMerieux NucliSens® là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp từ BioMerieux. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

4 Bacto trypton là sản phẩm có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng.

: data -> 2017
2017 -> Tcvn 6147-3: 2003 iso 2507-3: 1995
2017 -> Các Cục Hải quan tỉnh, thành phố
2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10256: 2013 iso 690: 2010
2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17/02/2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8400-3: 2010
2017 -> TIÊu chuẩn nhà NƯỚc tcvn 3133 – 79
2017 -> Căn cứ Luật Tổ chức chính quyền địa phương ngày 19 tháng 6 năm 2015
2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17 tháng 02 năm 2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
2017 -> Btvqh10 ngày 25 tháng 5 năm 2002 của Ủy ban Thường vụ Quốc hội về tự vệ trong nhập khẩu hàng hóa nước ngoài vào Việt Nam


1   2   3


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương