TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10783-1: 2015 iso/ts 15216-1: 2013



tải về 0.5 Mb.
trang1/3
Chuyển đổi dữ liệu02.06.2018
Kích0.5 Mb.
  1   2   3
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10783-1:2015

ISO/TS 15216-1:2013

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH VIRUS VIÊM GAN A VÀ NOROVIRUS TRONG THỰC PHẨM SỬ DỤNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE PHIÊN MÃ NGƯỢC THỜI GIAN THỰC – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG



Microbiology of food and animal feed – Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR – Part 1: Method for quantification

Lời nói đầu

TCVN 10783-1:2015 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 15216-1:2013;

TCVN 10783-1:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 10783 (ISO/TS 15216), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Xác định virus viêm gan A và norovirus trong thực phẩm sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực gồm các phần sau đây:

- TCVN 10783-1:2015 (ISO/TS 15216-1:2013), Phần 1: Phương pháp định lượng;

- TCVN 10783-2:2015 (ISO/TS 15216-2:2013), Phần 2: Phương pháp phát hiện định tính.

Lời giới thiệu

Virus viêm gan A (HAV) và norovirus (NoV) là các tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm cho người. Chưa có phương pháp thông thường để nuôi cấy các virus này từ nền mẫu thực phẩm. Do đó, việc phát hiện phải dựa trên phương pháp phân tử, sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR). Vì nhiều nền thực phẩm chứa chất gây ức chế phản ứng RT-PCR, nên cần sử dụng phương pháp tách chiết để thu được ARN tinh sạch cao phù hợp với mục đích sử dụng. Đối với bề mặt thực phẩm, loại bỏ virus bằng cách dùng gạc lau. Đối với quả mềm và rau salat, tách chiết virus bằng cách rửa giải đồng thời khuấy trộn sau đó cho kết tủa với PEG/NaCl. Đối với nước đóng chai, hấp thụ và rửa giải sử dụng màng lọc tích điện sau đó cô đặc bằng bộ lọc màng cực tím và đối với động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, thì tách chiết virus ra khỏi các mô của tuyến tiêu hóa có xử lý bằng dung dịch proteinase K. Đối với tất cả các nền mẫu không đề cập trong tiêu chuẩn này, cần phải đánh giá xác nhận lại phương pháp này. Tất cả các nền mẫu sử dụng cùng một phương pháp tách chiết ARN thường dựa trên capsid virus phân rã với thuốc thử chaotropic, sau đó hấp thụ ARN từ các hạt silica. Kiểm soát quá trình phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực (real-time RT-PCR) khuếch đại qua chuỗi PCR bằng cách đo độ kích thích của phân tử được đánh dấu huỳnh quang. Trong phép phân tích real-time RT-PCR phát huỳnh quang 5’ nuclease, các chất đánh dấu huỳnh quang được gắn vào mẫu dò nucleotid có trình tự đặc hiệu (mẫu dò thủy phân) cũng có thể nhận biết đồng thời với khuôn mẫu đích. Sự cải biến này làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR và cần phòng ngừa đối với các bước nhận biết sản phẩm khuếch đại tiếp sau phản ứng PCR. Vì sự phức tạp của phương pháp, nên cần có một bộ kiểm soát toàn diện. Phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này có thể phát hiện định tính ARN virus trong mẫu thử. Sơ đồ của quy trình thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.
VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH VIRUS VIÊM GAN A VÀ NOROVIRUS TRONG THỰC PHẨM SỬ DỤNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE PHIÊN MÃ NGƯỢC THỜI GIAN THỰC – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

Microbiology of food and animal feed – Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR – Part 1: Method for quantification

1. Phạm vi áp dụng



Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng các mức HAV và NoV có ARN nhóm gen I (GI) và NoV có ARN nhóm gen II (GII), từ mẫu thử thực phẩm hoặc bề mặt thực phẩm. Sau khi virus giải phóng ra khỏi mẫu thử, ARN virus được tách chiết bằng cách phân giải trong guanidin thiocyanat và hấp phụ trên cột silica. Trình tự đích trong ARN virus được khuếch đại và phát hiện bằng real-time RT-PCR.

Tiêu chuẩn này cũng dùng để phát hiện virus đích trên vật truyền bệnh hoặc phát hiện virus khác gây bệnh cho người có trong thực phẩm, trên bề mặt thực phẩm hoặc trên vật truyền bệnh, sau khi được đánh giá xác nhận thích hợp và sử dụng mồi đích đặc hiệu và các bộ mẫu dò.

2. Tài liệu viện dẫn



Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu chung và định nghĩa).

3. Thuật ngữ và định nghĩa



Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa nêu trong ISO 22174 và các thuật ngữ, định nghĩa sau:

3.1. Thực phẩm (foodstuff)

Chất được sử dụng hoặc được chuẩn bị để dùng làm thực phẩm.

CHÚ THÍCH 1: Trong tiêu chuẩn này, định nghĩa này bao gồm cả nước uống đóng chai.

3.2. Bề mặt thực phẩm (food surface)

Bề mặt của thực phẩm, bề mặt chuẩn bị hoặc bề mặt tiếp xúc với thực phẩm.

3.3. Vật truyền bệnh (fomite)

Thực thể vô sinh hoặc vật liệu là tác nhân lây truyền bệnh.

3.4. Virus viêm gan A (hepatitis A virus)

HAV

Virus thuộc họ Picornaviridae gây bệnh viêm gan.

CHÚ THÍCH 1: Nhìn chung, HAV có thể chia thành sáu kiểu gen dựa trên vùng VP1/2A (kiểu gen 1, 2, và 3 đã được tìm thấy trên người, trong khi kiểu gen 4, 5 và 6 có nguồn gốc từ khỉ). Đây chỉ là một kiểu huyết thanh.

CHÚ THÍCH 2: Sự lây truyền xuất hiện theo đường phân-miệng do tiếp xúc từ người sang người, qua việc ăn phải thực phẩm bị nhiễm bẩn, do tiếp xúc với nước hoặc bề mặt thực phẩm bị nhiễm bẩn hoặc tiếp xúc với vật truyền bệnh nhiễm bẩn. Virus hepatitis A được phân thành tác nhân sinh học nhóm 2 theo hiệp hội Châu Âu và nhóm nguy cơ 2 tác nhân gây bệnh theo Bộ y tế của Mỹ.

3.5. Norovirus (norovirus)

Virus thuộc họ Caliciviridae gây ra bệnh viêm dạ dày-ruột cấp tính không thường xuyên.

CHÚ THÍCH 1: Nhìn chung, norovirus có thể chia thành năm nhóm gen riêng rẽ.

CHÚ THÍCH 2: Ba nhóm gen GI, GII và GIV đã được đề cập trong sinh bệnh học gây bệnh cho người. Nhóm gen GI và GII gây ra phần lớn các trường hợp lâm sàng. Sự lây truyền xuất hiện theo đường phân-miệng do tiếp xúc từ người sang người, qua sự tiêu hóa thực phẩm bị nhiễm hoặc qua sự tiếp xúc với nước hoặc bề mặt thực phẩm bị nhiễm bẩn hoặc tiếp xúc với vật truyền bệnh. Các norovirus nhóm gen I và các norovirus nhóm gen II phân thành tác nhân sinh học nhóm 2 theo hiệp hội Châu Âu và nhóm nguy cơ 2 gây bệnh theo Bộ y tế của Mỹ.

3.6. Định lượng virus viêm gan A (quantification of hepatitis A virus)

Ước tính số lượng bản sao ARN của HAV trong một lượng hoặc một thể tích thực phẩm hoặc trên một diện tích bề mặt thực phẩm xác định.

3.7. Định lượng norovirus (quantification of norovirus)

Ước tính số lượng bản sao ARN của norovirus trong một lượng hoặc một thể tích thực phẩm hoặc trên một diện tích bề mặt thực phẩm xác định.

3.8. Virus kiểm soát quá trình (process control virus)

Virus được cho vào phần mẫu thử ở thời điểm sớm nhất trước khi tách chiết virus để kiểm soát hiệu quả của quá trình chiết.

3.9. ARN của virus kiểm soát quá trình (process control virus RNA)

ARN giải phóng khỏi virus kiểm soát quá trình để tạo dữ liệu đường chuẩn khi ước tính hiệu quả của quá trình chiết.

3.10. Kiểm soát quá trình chiết ARN âm tính (negative RNA extraction control)

Kiểm soát sự giải phóng ARN đích qua tất cả các bước tách chiết ARN và quy trình phát hiện để đánh giá mọi sự nhiễm bẩn chéo.

3.11. Kiểm soát quá trình âm tính (negative process control)

Mẫu nền thực phẩm không chứa vi sinh vật đích gây bệnh được chạy xuyên suốt mọi giai đoạn của quy trình phân tích.

3.12. Mẫu dò thủy phân (hydrolysis probe)

Mẫu dò huỳnh quang được kết cặp với hai phân tử huỳnh quang được tách vô trùng bằng hoạt tính enzym của 5’-3’-exonuclease trong suốt quá trình khuếch đại.

3.13. Kiểm soát RT-PCR âm tính (negative RT-PCR control)

Một lượng nước có độ tinh khiết cao được sử dụng trong phản ứng real-time RT-PCR để kiểm soát sự nhiễm bẩn thuốc thử dùng trong real-time RT-PCR.

3.14. ARN kiểm soát bên ngoài (external control RNA)

ARN đối chứng có thể được dùng làm đích đối với phép phân tích real-time RT-PCR, ví dụ ARN được tái tổng hợp bằng phiên mã in-vitro từ plasmid mang bản sao của gen đích, được thêm vào dung dịch lỏng của ARN mẫu với một lượng xác định, để kiểm soát khuếch đại trong phản ứng tách chiết.

3.15. Giá trị Cq (Cq value)

Chu trình định lượng; chu trình PCR mà tại đó gen đích được định lượng trong phản ứng real-time PCR đã cho.

CHÚ THÍCH 1: Giá trị này tương ứng với điểm mà phản ứng huỳnh quang vượt quá ngưỡng.

3.16. Giới hạn phát hiện lý thuyết (theoretical limit of detection)

tLOD

Mức có lượng vi sinh vật đích nhỏ nhất có thể được phát hiện theo lý thuyết.

CHÚ THÍCH: Mức này tương ứng với một bản sao hệ gen trong một thể tích ARN được thử nghiệm trong phản ứng đích, nhưng thay đổi theo nền mẫu thử và số lượng của vật liệu khởi động.

3.17. Giới hạn phát hiện thực tế (practical limit of detection)

pLOD

Nồng độ gen đích thấp nhất trong mẫu thử có thể được phát hiện tái lập (độ tin cậy 95 %) trong các điều kiện thực nghiệm quy định trong phương pháp, được chứng minh bằng phép thử cộng tác hoặc đánh giá xác nhận khác.

CHÚ THÍCH: pLOD liên quan đến phần mẫu thử, chất lượng hoặc số lượng ARN khuôn mẫu và tLOD của phương pháp.

3.18. Giới hạn định lượng (limit of quantification)

LOQ

Nồng độ gen đích thấp nhất trong mẫu thử có thể xác định được bằng cách định lượng với độ chụm và độ chính xác có thể chấp nhận được, trong các điều kiện thực nghiệm quy định của phương pháp, được chứng minh bằng phép thử cộng tác hoặc phép đánh giá xác nhận khác.

CHÚ THÍCH: LOQ liên quan đến phần mẫu thử và định tính hoặc định lượng của ARN khuôn.

4. Nguyên tắc



4.1. Tách chiết virus

Các thực phẩm và bề mặt thực phẩm đề cập trong tiêu chuẩn này thường là các nền mẫu rất phức tạp và có thể có virus đích ở nồng độ thấp. Do đó, cần tiến hành tách chiết và/hoặc cô đặc virus nền-đặc hiệu để thu được cơ chất cho quá trình tiếp theo. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào nền mẫu.

4.2. Tách chiết ARN

Cần sử dụng phương pháp tách chiết ARN sao cho thu được các ARN sạch để giảm ảnh hưởng của chất ức chế PCR. Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuốc thử chaotropic guanidin thiocyanat để phá vỡ vỏ capsid của virus. ARN sau đó được hấp thụ vào silica để tham gia vào quá trình tinh sạch qua vài giai đoạn rửa. ARN của virus đã tinh sạch được giải phóng ra khỏi silica vào chất đệm trước khi tiến hành phản ứng real-time RT-PCR.

4.3. Phản ứng real-time RT-PCR

Trong tiêu chuẩn này sử dụng phản ứng real-time RT-PCR một bước dùng các mẫu dò thủy phân. Trong phản ứng real-time RT-PCR một bước, phiên mã ngược và khuếch đại PCR được tiến hành liên tiếp trong cùng một ống.

Trong phản ứng real-time PCR sử dụng các mẫu dò thủy phân với mẫu dò ADN ngắn có chất đánh dấu huỳnh quang và chất hấp thụ huỳnh quang được gắn ở các đầu đối diện. Phép thử hóa học cần đảm bảo việc tăng số lượng của sản phẩm khuếch đại, bẻ gãy mẫu dò và tín hiệu huỳnh quang từ chất đánh dấu tăng tương ứng. Có thể đo được huỳnh quang ở từng giai đoạn trong chu trình. Điểm đầu tiên trong chu trình PCR mà tại đó có thể phát hiện được sự khuếch đại đối với mỗi phản ứng là tỷ lệ với số lượng khuôn mẫu, do đó, việc phân tích đồ thị huỳnh quang có thể xác định được số lượng trình tự gen đích có trong mẫu.

Do mức khuôn mẫu virus thường có trong thực phẩm thấp và tính đa dạng của virus đích nên việc chọn thuốc thử real-time RT-PCR một bước, các mồi PCR và các mẫu dò thủy phân thích hợp đối với virus đích là rất quan trọng. Các hướng dẫn lựa chọn thuốc thử, mồi và mẫu dò được nêu trong 5.2.17 và 5.2.18. Chi tiết về thuốc thử, mồi thử và mẫu dò nêu trong Phụ lục B và Phụ lục C.

4.4. Các vật liệu kiểm soát

4.4.1. Virus kiểm soát quá trình

Có thể có hao hụt virus đích ở một vài giai đoạn trong quá trình tách chiết virus mẫu và tách chiết ARN. Để kiểm soát sự hao hụt này, trước khi tiến hành mẫu được thêm chuẩn với lượng xác định virus kiểm soát quá trình. Mức thu hồi virus kiểm soát quá trình phải được xác định cho từng mẫu.

Virus được chọn để kiểm soát quá trình phải là virus mang ARN thử nghiệm dương tính không có vỏ bọc có thể nuôi cấy, có kích thước giống với virus đích để cho kiểu hình thái và hóa lý tốt. Virus kiểm soát quá trình phải ổn định trong môi trường tương tự với virus đích. Virus này phải có thể phân biệt được gen di truyền với virus đích, sao cho các phép phân tích PCR đối với virus đích và virus kiểm soát quá trình không phản ứng chéo và virus này thường không xuất hiện tự nhiên trong các loại thực phẩm cần kiểm tra.

Ví dụ về chuẩn bị virus kiểm soát quá trình được nêu trong Phụ lục D.

4.4.2. Kiểm soát ADN mạch kép (dsADN)

Đối với phép định lượng virus đích, các kết quả phải liên quan đến nồng độ chuẩn đã biết. Sử dụng dãy pha loãng của ADN mạch kép mang trình tự đích quan tâm (5.3.8) và được định lượng bằng máy đo quang phổ để dựng đường chuẩn tính theo số bản sao mẫu trong một microlit. Tham khảo đường chuẩn để định lượng số bản sao gen virus phát hiện được trong một microlit có trong mẫu.

4.4.3. Kiểm soát ARN kiểm soát khuếch đại bên ngoài (EC)

Nhiều thực phẩm chứa các chất ức chế phản ứng RT-PCR và cũng có thể mang các chất ức chế này sang các giai đoạn tiếp theo. Để kiểm soát sự ức chế RT-PCR trong các mẫu riêng rẽ, cần bổ sung các ARN kiểm soát bên ngoài (EC) (các ARN mang trình tự đích được quan tâm, 5.3.9) vào mẫu ARN lỏng và được thử nghiệm bằng phương pháp RT-PCR. So sánh các kết quả của phương pháp này với các kết quả thu được của phương pháp EC ARN trong phép xác định mức ức chế RT-PCR trong từng mẫu thử không có ARN mẫu.

Ngoài các phương pháp kiểm soát ức chế RT-PCR, có thể sử dụng phương pháp EC ARN cho kết quả tương đương.

4.5. Kết quả thử nghiệm

Phương pháp này cho kết quả biểu thị bằng số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một mililit, trong một gam hoặc trong một centimet vuông. Trong các mẫu không phát hiện có virus, thì các kết quả này phải được báo cáo là “không phát hiện được; < z số bản sao hệ gen virus có thể phát hiện được trong một mililit, trong một gam hoặc trong một centimet vuông” trong đó z là giới hạn phát hiện (LOD) của mẫu.

5. Thuốc thử



5.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

Đối với thực hành phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218) [10].

5.2. Thuốc thử đã chuẩn bị sẵn để sử dụng

5.2.1. Nước loại dùng cho sinh học phân tử

5.2.2. Glycol polyetylen (PEG), khối lượng phân tử tương đối trung bình 8 000.

5.2.3. Natri clorua (NaCl).

5.2.4. Kali clorua (KCl).

5.2.5. Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4).

5.2.6. Kali dihydrophosphat (KH2PO4).

5.2.7. Tris base [tris(hydroxymetyl)aminometan].

5.2.8. Glyxin.

5.2.9. Bột chiết thịt bò.

5.2.10. Proteinase K (30 U/mg).

5.2.11. Pectinase từ Aspergillus niger hoặc A.aculeatus.

5.2.12. Cloroform.

5.2.13. Butanol.

5.2.14. Natri hydroxit (NaOH).

5.2.15. Axit clohydric (HCl).

5.2.16. Silica, chất phân giải, dung dịch đệm rửadung dịch đệm rửa giải để tách chiết ARN virus.

Thuốc thử phải có thể xử lý được 500 µl virus chiết được, sử dụng chất phân giải cùng dung dịch đệm chaotropic chứa guanidin thioxyanat (Tài liệu viện dẫn [1]) và sử dụng silica làm nền mẫu liên kết ARN. Tiếp theo, xử lý liên kết ARN-silica bằng dung dịch đệm rửa để loại bỏ tạp chất, ARN phải được rửa giải trong 100 µl dung dịch đệm rửa giải.

Chế phẩm ARN phải có chất lượng và nồng độ thích hợp với mục đích dự kiến. Xem Phụ lục E nêu chi tiết về các thuốc thử tách chiết ARN.

5.2.17. Thuốc thử dùng cho phản ứng real-time RT-PCR một bước

Các thuốc thử này phải xử lý được 5 µl ARN trong tổng thể tích 25 µl. Các thuốc thử này phải thích hợp cho phản ứng RT-PCR một bước sử dụng mẫu dò thủy phân (ADN polymerase được sử dụng phải có hoạt tính 5’-3’ exonuclease) và đủ nhạy để phát hiện các mức ARN virus điển hình tìm thấy được trong thực phẩm nhiễm virus. Xem Phụ lục B nêu chi tiết về thuốc thử real-time RT-PCR một bước.

5.2.18. Mồi và mẫu dò thủy phân dùng để phát hiện HAV và norovirus GI và norovirus GII

Trình tự mồi và mẫu dò thủy phân được công bố trên tạp chí uy tín và được kiểm chứng khi sử dụng dựa vào phổ rộng các chủng virus đích. Các mồi để phát hiện HAV phải hướng đến vùng 5’ không mã hóa của hệ gen. Các mồi để phát hiện norovirus GI và norovirus GII phải có đích liên kết ORF1/ORF2 của hệ gen. Xem Phụ lục C nêu chi tiết về mồi và mẫu dò thủy phân.

5.2.19. Mồi và mẫu dò thủy phân dùng để phát hiện virus kiểm soát quá trình

Trình tự mồi và mẫu dò thủy phân phải được công bố trên tạp chí uy tín và được kiểm chứng khi sử dụng dựa vào chủng virus kiểm soát quá trình được sử dụng. Các chủng này phải được chứng minh là không phản ứng chéo với virus đích.

5.3. Thuốc thử đã chuẩn bị

Do số lượng thuốc thử được sử dụng nhiều nên chi tiết về thành phần và chuẩn bị được nêu cụ thể trong Phụ lục F.

5.3.1. Dung dịch 5 x PEG/NaCl (PEG 8 000 nồng độ 500 g/l, NaCl 1,5 mol/l). Xem F.1.

5.3.2. Hỗn hợp cloroform/butanol. Xem F.2.

5.3.3. Dung dịch proteinase K. Xem F.3.

5.3.4. Dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS). Xem F.4.

5.3.5. Dung dịch đệm tris/glyxin/chất chiết thịt bò (TGBE). Xem F.5.

5.3.6. Vật liệu virus kiểm soát quá trình

Dung dịch virus kiểm soát quá trình gốc phải được pha loãng tối thiểu là 10 lần trong dung dịch đệm thích hợp, ví dụ: PBS (5.3.4). Dung dịch pha loãng này cho phép phát hiện hệ gen virus kiểm soát quá trình không bị ức chế, sử dụng phản ứng real-time RT-PCR , nhưng vẫn đủ nồng độ để dùng cho phép xác định tái lập của dung dịch pha loãng nhất được dùng cho đường chuẩn ARN của virus kiểm soát quá trình (8.4.2.2). Chia vật liệu của virus kiểm soát quá trình đã pha loãng thành các phần nhỏ để dùng cho mỗi lần và bảo quản ở (–80 ± 5) °C. Xem Phụ lục D nêu chi tiết về cách chuẩn bị virus kiểm soát quá trình.

5.3.7. Hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR dùng cho virus đích và virus kiểm soát quá trình

Bổ sung thuốc thử với các lượng quy định theo nhà sản xuất (5.2.17) để cho 20 µl hỗn hợp mastermix trên một phản ứng trong tổng thể tích 25 µl. Sử dụng mồi và nồng độ mẫu dò tối ưu theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử. Xem Phụ lục B nêu chi tiết về hỗn hợp mastermix real-time RT-PCR .

5.3.8. Vật liệu kiểm soát ADN mạch kép (dsADN)

Tách chiết các plasmid đã tinh sạch mang trình tự đích đối với từng virus đích được sử dụng. Các chế phẩm này sẽ không được gây ức chế phản ứng RT-PCR.

Nồng độ của từng dsADN gốc tính bằng số bản sao khuôn mẫu trong một microlit phải được xác định, sau đó pha loãng gốc từ nồng độ 1 x 104 đến 1 x 105 bản sao khuôn mẫu trong một microlit. Chia dsADN đã pha loãng (vật liệu kiểm soát dsADN) thành các phần nhỏ để dùng cho mỗi lần sử dụng và bảo quản lạnh ở –15 °C hoặc ở nhiệt độ thấp hơn. Xem Phụ lục G nêu chi tiết về cách chuẩn bị dsADN.

5.3.9. Vật liệu kiểm soát ARN kiểm soát bên ngoài (EC)

Tách các ssARN tinh sạch riêng rẽ mang trình tự đích đối với từng virus đích được sử dụng. Các ssARN này phải chứa mức nhiễm ADN đích không cao hơn 0,1 % và không gây ức chế phản ứng RT- PCR. Cần phải xác định nồng độ của từng EC ARN gốc tính bằng số bản sao có trong một microlit và EC ARN gốc phải được pha loãng từ nồng độ 1 x 106 đến 1 x 108 bản sao mẫu trong một microlit. Chia các chế phẩm EC ARN đã pha loãng (vật liệu kiểm soát EC ARN ) thành các phần nhỏ để dùng cho mỗi lần sử dụng và bảo quản lạnh ở –15 °C hoặc ở nhiệt độ thấp hơn. Xem Phụ lục G nêu chi tiết về cách chuẩn bị của EC ARN.

6. Thiết bị, dụng cụ và vật liệu



Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh chuẩn [xem TCVN 6404 (ISO 7218) [10]] và cụ thể như sau:

6.1. Micropipet và đầu tip với các dải cỡ, ví dụ: 1 000 µl, 200 µl, 20 µl, 10 µl. Nên sử dụng đầu tip bền với sol khí trừ khi yêu cầu đầu tip thẳng, ví dụ: dùng để hút.


: data -> 2017
2017 -> Tcvn 6147-3: 2003 iso 2507-3: 1995
2017 -> Các Cục Hải quan tỉnh, thành phố
2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10256: 2013 iso 690: 2010
2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17/02/2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
2017 -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8400-3: 2010
2017 -> TIÊu chuẩn nhà NƯỚc tcvn 3133 – 79
2017 -> Căn cứ Luật Tổ chức chính quyền địa phương ngày 19 tháng 6 năm 2015
2017 -> Căn cứ Nghị định số 15/2017/NĐ-cp ngày 17 tháng 02 năm 2017 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
2017 -> Btvqh10 ngày 25 tháng 5 năm 2002 của Ủy ban Thường vụ Quốc hội về tự vệ trong nhập khẩu hàng hóa nước ngoài vào Việt Nam


  1   2   3


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương