TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 10713-1: 2015 iso 15788-1: 1999

TCVN 10713-1:2015

ISO 15788-1:1999

DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH CÁC STIGMASTADIENE TRONG DẦU THỰC VẬT – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ CỘT MAO QUẢN (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)

TCVN 10713-1:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 15788-1:1999;

TCVN 10713-1:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;

Bộ tiêu chuẩn TCVN 10713 (ISO 15788) Dầu mỡ động vật và thực vật – Xác định các stigmastadiene trong dầu thực vật gồm có các phần sau:

- TCVN 10713-1:2015 (ISO 15788-1:1999), Phần 1: Phương pháp sắc kí khí cột mao quản (Phương pháp chuẩn);

- TCVN 17013-2:2015 (ISO 15788-2:2003), Phần 2: Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Một lượng hydrocarbon đáng kể được hình thành trong các loại dầu thực vật do xử lý nhiệt trong quá trình tinh luyện [1]. Trong số các hydrocarbon này, thì 3,5-stigmastadiene và hợp chất steroidal là có nhiều nhất trong tất cả các loại dầu thực vật tinh luyện vì nó có nguồn gốc từ -sitosterol do mất nước [2]. 3,5- stigmastadiene được tạo thành cùng với một lượng nhỏ đồng phân 2,4 và cả hai cho một pic sắc kí khí dễ xác định khi phân đoạn hdrocarbon được phân tích trên cột phân cực thấp [3]. Vì vậy, tổng của cả hai đồng phân có thể dễ dàng định lượng bằng phân tích sắc kí khí phân đoạn hydrocarbon steroidal [2], [4].

Ví dụ, đối với dầu ôliu nguyên chất, các quá trình sản xuất dầu thông thường (ép hoặc ly tâm) không tạo ra các lượng stigmastadiene có thể đo được (nhỏ hơn 0,01 mg/kg). Trong khô dầu ôiliu thô, đã phát hiện một lượng nhỏ các stigmastadien (trong khoảng từ 0,2 mg/kg đến 3 mg/kg) do sử dụng nhiệt độ cao trong quá trình sấy khô dầu ôliu thô.

Trong quá trình tinh luyện, các stigmastadiene được hình thành trong tất cả các bước liên quan đến nhiệt độ cao, như quá trình tẩy trắng và khử mùi, nhưng trong bước đầu tiên sử dụng đất tẩy trắng bằng axit thì các stigmastadien được hình thành với lượng lớn hơn so với bước khử mùi [2]. Tùy thuộc vào các điều kiện áp dụng trong quá trình tinh luyện, các loại dầu thực vật tinh luyện thương phẩm cho nồng độ các stigmastadien dao động từ 1 mg/kg đến 120 mg/kg và vì vậy việc đánh giá các stigmastadien cho phép không chỉ xác định các loại dầu được xử lý nhiệt mà còn cho phép phát hiện một lượng nhỏ các loại dầu thực vật tinh luyện trong các loại dầu nguyên chất.

Phương pháp xác định các stigmastadien và các kết quả nghiên cứu cộng tác được thực hiện dưới sự bảo trợ của Hội đồng Dầu Ôliu quốc tế đã được chuyển cho Liên minh Quốc tề về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng (IUPAC), Ủy ban về dầu, Chất béo và các Dẫn xuất. Hàm lượng các stigmastadiene được chấp nhận như là một tiêu chí nhận biết các loại dầu ô liu nguyên chất và các phương pháp phân tích này đã được chấp nhận làm phương pháp chuẩn quốc tế.
DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH CÁC STIGMASTADIENE TRONG DẦU THỰC VẬT – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ CỘT MAO QUẢN (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)

Animal and vegetable fats and oils – Determination of stigmastadienes in vegetable oils – Part 1: Method using capillary-column gas chromatography (Reference method)

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định các stigmastadiene trong các loại dầu thực vật nguyên chất có nồng độ các hydrocarbon thấp, đặc biệt trong dầu ôliu nguyên chất.

Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các loại dầu thực vật cho dù các phương pháp đó chỉ đáng tin cậy khi hàm lượng các hydrocarbon từ 0,01 mg/kg đến 4,0 mg/kg. Phương pháp này thích hợp để phát hiện sự có mặt của dầu thực vật tinh tinh luyện (dầu ô liu, bã dầu ô liu, dầu hướng dương, dầu cọ v.v…) trong dầu ô liu nguyên chất, vì dầu tinh luyện chứa các stigmastadiene và các loại dầu thực vật chiết lạnh thì không chứa các stigmastadiene.

2. Nguyên tắc

Các chất không xà phòng hóa được phân lập. Phân đoạn hydrocacbon steroidal được tách bằng sắc kí cột trên silica gel và được phân tích bằng sắc kí khí mao quản.

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có các qui định khác.

Hexan phải được chưng cất lại để loại bỏ tạp chất.

Thêm 10 ml nước vào 50 g kali hydroxit, khuấy, rồi pha loãng đến 500 ml bằng etanol.

Dung dịch kali hydroxit trong ancol chuyển màu nâu khi để yên. Cần chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng và bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh sẫm màu có nắp đậy kín.

3.5. Silica gel 60¹⁾, dùng cho sắc kí cột, cỡ 70 mesh đến 230 mesh.

Thông thường, có thể sử dụng silica gel trực tiếp từ vật chứa mà không cần xử lý. Tuy nhiên, một số mẻ silica có thể có hoạt tính thấp làm cho tách sắc kí kém, khi đó silica gel phải được xử lý bằng cách sau đây:

Hoạt hóa silica gel bằng cách nung ít nhất 4 h ở 550 ^oC. Sau khi nung, đặt silica gel vào bình hút ẩm để cho nguội sau đó chuyển silica gel vào bình có nắp đậy kín. Thêm 2 % nước và lắc cho đến khi silica gel hết vón cục và thành bột chảy tự do.

Nếu các mẻ silica gel cho sắc kí đồ có các pic gây nhiễu thì silica gel phải được xử lý như trên. Cách khác, nên sử dụng silica gel 60 ¹⁾ có độ tinh khiết cao.

CHÚ THÍCH Nếu bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 ^oC, thì các dung dịch (3.6) và (3.7) không bị giảm chất lượng trong ít nhất 4 tháng.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể sau đây:

4.1. Bình cầu, dung tích 250 ml, phù hợp để dùng với sinh hàn hồi lưu.

4.2. Phễu chiết, dung tích 500 ml.

4.3. Bình cầu đáy tròn, dung tích 100 ml.

4.4. Bộ cô quay.

4.5. Cột sắc kí thủy tinh, đường kính trong 1,5 cm, dài 50 cm, có khóa Teflon và nút bông thủy tinh hoặc đĩa thủy tinh thiêu kết ở đáy.

Để chuẩn bị cột silica gel, rót hexan vào cột sắc kí đến độ sâu khoảng 5 cm và đổ đầy huyền phù silicagel trong hexan (15 g trong 40 ml) với sự hỗ trợ của các phần hexan. Để lắng và sau đó rung nhẹ. Thêm một lớp natri sulfat khan (3.3) có chiều cao đến khoảng 0,5 cm. Cuối cùng, tháo bỏ hexan dư.

CHÚ THÍCH Có thể sử dụng các loại cột tương tự khác hoặc cột có độ phân cực thấp hơn.

5. Cách tiến hành

Nếu tạo nhũ, không tách lớp nhanh được thì thêm một lượng nhỏ etanol.

Phân đoạn đầu tiên chứa các hydrocarbon bão hòa [xem Hình 1a)] và phân đoạn thứ hai chứa các hydrocacbon steroidal. Khi rửa giải tiếp, sẽ cho các hydrocacbon không bão hòa và các hợp chất tương tự. Để tách tốt các hydrocacbon bão hòa và hydrocacbon steroidal, cần tối ưu hóa các phần thể tích. Để thực hiện điều này, thể tích của phân đoạn đầu tiên cần được chỉnh sao cho khi phân đoạn thứ hai được phân tích thì các pic đại diện cho các hydrocarbon bão hòa là thấp [xem Hình 1 c)]; nếu các pic này không xuất hiện cường độ pic chuẩn thấp, thì cần giảm thể tích. Tuy nhiên, việc tách hoàn toàn giữa các thành phần của phân đoạn thứ nhất và phân đoạn thứ hai là không cần thiết, vì không có sự chồng lấn của các pic trong quá trình phân tích GC nếu các điều kiện GC được điều chỉnh như trong 5.3.1.

CHÚ THÍCH Thông thường, không cần tối ưu hóa thể tích phân đoạn thứ hai vì vẫn có thể tách tốt với các thành phần khác. Tuy nhiên, sự có mặt của pic rộng với thời gian lưu thấp hơn khoảng 1,5 min so với thời gian lưu của chất chuẩn là do hydrocarbon không bão hòa và điều này làm cho tách kém.

5.2.2. Làm bay hơi phân đoạn thứ hai trong bộ cô quay ở 30 ^oC trong điều kiện áp suất giảm cho đến khi khô và hòa tan ngay phần cặn trong 0,2 ml hexan. Giữ dung dịch này trong tủ lạnh cho đến khi phân tích.

Phần cặn còn lại từ các bước 5.1.3 và 5.2.2 không được để khô hoặc để ở nhiệt độ phòng. Ngay sau khi thu được phần cặn, thêm dung môi và bảo quản các dung dịch này trong tủ lạnh.

Các điều kiện này phải như sau:

– nhiệt độ bơm: 300 ^oC;

– nhiệt độ detector: 320 ^oC;

– máy tích phân: các thông số tích phân phải cố định sao cho đánh giá đúng các diện tích; nên tích phân phần lõm xuống.

– độ nhạy: tối thiểu khoảng 16 lần;

– lượng dung dịch được bơm, 1 l;

– nhiệt độ chương trình lò: ban đầu, 235 ^oC trong 6 min, sau đó tăng với tốc độ 2 ^oC/min đến 285 ^oC;

– bơm có bộ chia dòng 1:5;

– khí mang: khí heli hoặc hydro ở áp suất khoảng 120 kPa và 85 kPa, tương ứng.

Các điều kiện này có thể được điều chỉnh phù hợp với các đặc tính của các thiết bị sắc kí khí và cột để cho sắc kí đồ đáp ứng các yêu cầu sau đây:

– pic của chất chuẩn nội trong vòng khoảng 5 min của thời gian nêu trong 5.3.2.

– pic của chất chuẩn nội phải ít nhất 80 % trên toàn bộ thang đo.

Hệ thống sắc kí khí phải được kiểm tra bằng cách bơm hỗn hợp dung dịch gốc 3,5-cholestadiene (3.6) và dung dịch n-nonacosan (3.8). Pic 3,5-cholestadiene phải xuất hiện trước pic của n-nonacosan [Hình 1c)]. Nếu không, thì có thể thực hiện hai thao tác: giảm nhiệt độ lò và/hoặc sử dụng cột phân cực thấp hơn.

Nếu sử dụng heli làm khí mang, thì pic của chất chuẩn nội xuất hiện ở khoảng 19 min và pic của stigmastadiene ở thời gian lưu tương đối 1,29 [xem Hình 1b)]. Nếu sử dụng khí hydro, thì pic của chất chuẩn nội xuất hiện ở khoảng 13 min và pic của các stigmastadiene ở thời gian lưu tương đối 1,35. Chuẩn đối chứng đối với pic của các stigmastadiene có thể thu được bằng cách phân tích dung dịch 3,5-stigmastadiene (3.9).

CHÚ THÍCH Nếu không có sẵn 3,5-stigmastadiene (24-ethyl-cholesta-3,5-diene) thì chuẩn đối chứng sắc ký đối với các stigmastadiene có thể thu được bằng cách phân tích từ 1 g đến 2 g dầu thực vật tinh luyện. Các stigmastadiene cho pic rõ ràng và dễ nhận biết.

Pic của các stigmastadiene là pic sắc kí đơn lẻ thu được từ hỗn hợp của 3,5-stigmastadiene và một lượng nhỏ đồng phân 2,4. Tuy nhiên, nếu cột có độ phân cực lớn và có độ phân giải cao, thì đồng phân 2,4 có thể xuất hiện là một pic nhỏ đứng trước và gần với pic của 3,5-stigmastadiene (Hình 2). Để đảm bảo rằng cả hai stigmastadiene cũng được rửa giải như một pic, thì nên thay cột bằng một cột khác phân cực kém hơn hoặc có đường kính trong rộng hơn.

a) Phân đoạn thứ nhất (30 ml) từ dầu nguyên chất, có thêm chuẩn.

b) Phân đoạn thứ hai (40 ml) từ dầu ô liu chứa các stigmastadiene hàm lượng 0,10 mg/kg.

c) Phân đoạn thứ hai (40 ml) chứa tỷ lệ nhỏ phân đoạn thứ nhất.