TI£u chuèn ngµnh 10 tcn 348 99

Tiªu chuÈn nµy ¸p dông cho viÖc b¶o qu¶n ng¾n h¹n nguån gien vi sinh vËt dÞ d­ìng hiÕu khÝ sö dông trong n«ng nghiÖp víi nguån vËt liÖu di truyÒn lµ tÕ bµo sinh d­ìng, bµo tö trong ®iÒu kiÖn v« trïng b»ng ph­¬ng ph¸p b¶o qu¶n trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng vµ d­íi líp dÇu kho¸ng.

2.1. Nguån gien vi sinh vËt n«ng nghiÖp ®­îc hiÓu lµ nguån tµi nguyªn di truyÒn c«ng nghÖ bao gåm c¸c nhãm chñng vi sinh vËt kh¸c nhau nh­ vi khuÈn, x¹ khuÈn, nÊm men, nÊm mèc, vi khuÈn lam ®ang lµ ®èi t­îng ®­îc nghiªn cøu vµ sö dông trong n«ng nghiÖp (trõ vi sinh vËt trong lÜnh vùc thó y, bao gåm c¶ c¸c chñng ®ang ®­îc khai th¸c ®Ó l¹i t¹o vµ c¸c chñng cã tiÒm n¨ng ®· ®­îc kiÓm ®Þnh, ®­îc Bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn n«ng th«n cho phÐp sö dông.

2.2. B¶o qu¶n nguån gien vi sinh vËt lµ b¶o qu¶n c¸c mÉu gièng thuÇn khiÕt sau khi ®· chän läc, trong ®iÒu kiÖn phï hîp b¶o ®¶m ®é sèng sãt cao vµ b¶o tån c¸c tÝnh tr¹ng ban ®Çu ®Ó sö dông trong c¸c tr­êng hîp cÇn thiÕt.

2.3. B¶o qu¶n ng¾n h¹n lµ b¶o qu¶n c¸c mÉu gièng trong thêi gian d­íi 2 n¨m. Trong ®ã ¸p dông mét sè yÕu tè lµm gi¶m tèc ®é sinh tr­ëng cña nguån vËt liÖu di truyÒn nh­ h¹ thÊp nhiÖt ®é nu«i cÊy, ®­a thªm c¸c chÊt øc chÕ sinh tr­ëng v.v...

2.4. §Æc tÝnh sinh häc lµ kh¶ n¨ng cña vi sinh vËt th«ng qua ho¹t ®éng sèng cña chóng cã t¸c dông ®Õn qu¸ tr×nh sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña c©y trång, vËt nu«i, kiÓm so¸t sinh häc vµ sinh th¸i m«i tr­êng.

2.5. M«i tr­êng nu«i cÊy chän läc lµ m«i tr­êng phï hîp cho sù ph¸t triÓn cña mét loµi hay mét nhãm vi sinh vËt nµo ®ã nh­ng Ýt thuËn lîi hay hoµn toµn bÊt lîi ®èi víi sù ph¸t triÓn cña loµi hay nhãm vi sinh vËt kh¸c.

2.6. M«i tr­êng chÈn ®o¸n ph©n biÖt (m«i tr­êng chØ thÞ) lµ m«i tr­êng cho phÐp ph©n biÖt nhanh chãng mét loµi vi sinh vËt nµy víi mét loµi vi sinh vËt kh¸c.

2.7. MÉu gièng:

MÉu gièng lµ gièng do t¸c gi¶ chän läc, lai t¹o hay lÊy tõ quÜ gien cã tÝnh di truyÒn æn ®Þnh.

- Mét mÉu gièng vËt liÖu cÇn gi÷ mét l­îng mÉu lÆp l¹i Ýt nhÊt ba lÇn.

- Kh«ng ®­îc chän nh÷ng khuÈn l¹c riªng biÖt trong c¸c lÇn cÊy chuyÓn ®Ó lµm gièng (tr¸nh ®ét biÕn sinh tr­ëng).

- ViÖc lÊy mÉu ®­îc tiÕn hµnh sao cho mÉu kiÓm tra ph¶i lµ mÉu thuÇn.

- Ng­êi lÊy mÉu ph¶i ®­îc huÊn luyÖn vµ cã kinh nghiÖm trong viÖc lÊy mÉu.

- Trong qu¸ tr×nh lÊy mÉu, vËn chuyÓn vµ xö lý mÉu ph¶i ®¶m b¶o tr¸nh sù t¹p nhiÔm tõ bªn ngoµi vµ ®¶m b¶o ®­îc tÝnh nguyªn tr¹ng ban ®Çu.

2.8. Thêi gian cÊy chuyÓn lµ kho¶ng thêi gian c¸c mÉu gièng ®­îc l­u gi÷ tr­íc khi cÇn cÊy chuyÓn, phô thuéc vµo ®Æc ®iÓm sinh häc mÉu vËt liÖu, ph­¬ng tiÖn vµ kinh nghiÖm ng­êi gi÷ mÉu gièng.

2.9. §é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng lµ tû lÖ phÇn tr¨m gi÷a l­îng tÕ bµo sèng sãt trong c¸c mÉu gièng b¶o qu¶n vµ mÉu gièng gèc míi ®­îc nu«i cÊy vµ ph¸t triÓn æn ®Þnh. §é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng cho phÐp ®Þnh thêi gian cÊy chuyÓn mÉu gièng.

2.10. Håi phôc lµ qu¸ tr×nh cÊy chuyÓn mÉu b¶o qu¶n trªn m«i tr­êng dinh d­ìng chän läc sau khi ®· lo¹i bá chÊt øc chÕ sinh tr­ëng (dÇu parafin).

3. Néi dung:

3.1. Ph­¬ng ph¸p b¶o qu¶n trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng:

3.1.1. ChuÈn bÞ:

3.1.1.1 Trang thiÕt bÞ:

• 
  Tñ sÊy (thiÕt bÞ tiÖt trïng kh«) vµ nåi hÊp (thiÕt bÞ tiÖt trïng ­ít).
  
• 
  Tñ Êm.
  
• 
  C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c tíi 0,01g.
  
• 
  Que cÊy.
  
• 
  Que g¹t thñy tinh.
  
• 
  èng nghiÖm thñy tinh.
  
• 
  èng ®ong: l00ml, 500ml, l000ml
  
• 
  B×nh tam gi¸c: 250ml, 500ml.
  
• 
  §Üa petri (hép lång).
  
• 
  Pipet chia ®é: chuyªn dïng cho vi sinh cã dung tÝch 1ml; 5ml, l0ml.
  
• 
  §Ìn cån hoÆc ®Ìn gas.
  

3.1.1.2. ChuÈn bÞ dông cô:

C¸c dông cô dïng trong x¸c ®Þnh vi sinh vËt ph¶i tiÖt trïng b»ng mét trong c¸c ph­¬ng ph¸p d­íi ®©y:

• 
  Trong tñ sÊy ë nhiÖt ®é tõ 160-175^oC trong Ýt nhÊt 2 giê.
  
• 
  Trong nåi hÊp 121⁰C (1 atmotphe) kh«ng Ýt h¬n 20 phót.
  

M«i tr­êng nu«i cÊy lµ m«i tr­êng nu«i cÊy chän läc (xem môc 3.6).

C©n vµ hoµ tan c¸c thµnh phÇn m«i tr­êng trong n­íc cÊt theo thø tù ®· cho. Ph©n m«i tr­êng vµo c¸c èng nghiÖm (5-6ml/èng nghiÖm). §Ëy nót b«ng, tiÖt trïng ë 121^oC trong 30 phót. §Ó nguéi m«i tr­êng ®Õn 45-50^oC, ®Æt nghiªng èng nghiÖm kho¶ng 45^o. §îi bÒ mÆt th¹ch kh« tiÕn hµnh cÊy gièng.

3.1.2. TiÕn hµnh:

CÊy gièng: Tõ c¸c mÉu gièng gèc, b»ng thao t¸c v« trïng cÊy ria trªn m«i tr­êng nu«i cÊy thÝch hîp. Sau khi tÕ bµo ®· ph¸t triÓn æn ®Þnh, tiÕn hµnh cÊt gi÷ trong tñ l¹nh hay phßng (cã thÓ dïng giÊy b¹c hoÆc tói plastic bao ®Çu èng gièng ®Ó tr¸nh sù mÊt n­íc cña m«i tr­êng)

NhiÖt ®é cÊt gi÷ 4-10^oC. §Þnh kú cÊy chuyÓn. Tuú tõng lo¹i gièng mµ qui ®Þnh thêi gian ph¶i cÊy chuyÓn l¹i cã thÓ sau 5-7 ngµy, 2-4 tuÇn hay 3-4 th¸ng.

3.1.3. KiÓm tra mÉu gièng:

§Þnh kú sau 12 th¸ng kiÓm tra ®é phÇn tr¨m sèng sãt vµ ®Æc tÝnh sinh häc cña mÉu gièng.

3.1.3.1. §é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng :

- M«i tr­êng ®Ó kiÓm tra:

M«i tr­êng ®Ó kiÓn tra ®­îc sö dông lµ m«i tr­êng mu«i cÊy chän läc. M«i tr­êng ®­îc pha chÕ theo thø tù c¸c ho¸ chÊt trong thµnh phÇn ®· cho, sau ®ã ph©n phèi vµo c¸c dông cô thuû tinh ®· chuÈn bÞ tr­íc råi khö trïng ë 121^oC trong 30 phót. §Ó nguéi m«i tr­êng ®Õn 45-50^oC, ph©n phèi m«i tr­êng vµo c¸c ®Üa petri ®· khö trïng ë ®iÒu kiÖn v« trïng.

- DÞch pha lo·ng lµ dung dÞch muèi sinh lý (NaCl 0,85%), kh«ng chøa c¸c hîp chÊt nit¬, cã ®é pH lµ 7,0 sau khi khö trïng ë 121^oC trong 30 phót.

Ph©n phèi dÞch pha lo·ng vµo c¸c èng nghiÖm hoÆc c¸c b×nh tam gi¸c cã dung tÝch thÝch hîp víi mét l­îng sao cho sau khi khö trïng, mçi èng nghiÖm chøa 9 ml vµ mçi b×nh tam gi¸c chøa 90ml. Lµm nót b«ng vµ khö trïng ë 121 ^oC trong 30 phót.

NÕu ch­a sö dông ngay, dÞch pha lo·ng cÇn ®­îc b¶o qu¶n trong tñ l¹nh ë nhiÖt ®é 4-10^oC, thêi gian b¶o qu¶n kh«ng qu¸ 1 th¸ng kÓ tõ ngµy chuÈn bÞ.

- ChuÈn bÞ dÞch huyÒn phï vi khuÈn (suspension): LÊy èng gièng b¶o qu¶n cÇn kiÓm tra ra khái nhiÖt ®é b¶o qu¶n, ®Ó nhiÖt ®é cña èng gièng b¶o qu¶n b»ng nhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm b¾t ®Çu tiÕn hµnh kiÓm tra. LÊy sinh khèi vi sinh tõ mét èng gièng ®­a vµo b×nh tam gi¸c chøa 90ml dÞch pha lo·ng, trén ®Òu b»ng l¾c tay hay thiÕt bÞ l¾c c¬ häc ®Ó ®¶m b¶o c¸c vi sinh vËt ®­îc ph©n bè ®ång ®Òu. Dung dÞch t¹o ra ®­îc gäi lµ dÞch huyÒn phï vi khuÈn ban ®Çu.

Dïng pipet ®· v« trïng lÊy 1 ml dÞch huyÒn phï ban ®Çu cho vµo 9 ml dÞch pha lo·ng, tr¸nh ch¹m pipet vµo dÞch pha lo·ng. Trén kü b»ng c¸ch dïng mét pipet v« trïng kh¸c hót lªn xuèng 10 lÇn hoÆc b»ng dông cô trén c¬ häc trong 5-l0 gi©y, tÇn sè quay cña dông cô nµy sÏ ®­îc chän sao cho chÊt láng khi cuén xo¸y d©ng lªn c¸ch mÐp lä chøa kho¶ng 2-3 cm ®Ó cã ®­îc dung dÞch pha lo·ng l0^-2. LÆp l¹i c¸c thao t¸c nµy ®Ó thu ®­îc dÞch pha lo·ng 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8.

CÊy mÉu: dïng pipet v« trïng riªng cho tõng ®é pha lo·ng, lÊy ra tõ dÞch mÉu mét l­îng mÉu dÞch 0,05 ml (1 giät) cÊy vµo 1 ®Üa petri chøa m«i tr­êng ®· chuÈn bÞ s½n (xem 3.l.3.l). Mçi mÉu ®­îc cÊy lÆp l¹i 3 ®Üa petri.

Dïng que g¹t v« trïng g¹t ®Òu ®Ó dÞch mÉu dµn tr¶i trªn bÒ mÆt th¹ch, ®îi kh« bÒ mÆt th¹ch, óp ng­îc ®Üa petri, nu«i trong tñ Êm ë nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp.

§Õm sè l­îng khuÈn l¹c ®Æc tr­ng cña mÉu gièng c¸c chñng gièng vi sinh vËt trªn mçi ®Üa petri.

MËt ®é vi sinh vËt trªn mét ®¬n vÞ kiÓm tra (gam hay ml) ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau:

Trong ®ã:

A: sè khuÈn l¹c/ml dÞch

a: sè khuÈn l¹c trung b×nh cã trong ®Üa petri

d: nång ®é dÞch pha lo·ng

20: sè giät dÞch trong 1 ml dÞch

Sè l­îng tÕ bµo mÉu gièng b¶o qu¶n

% ®é sèng sãt = --------------------------------------------- x l00

Sè l­îng tÕ bµo mÉu gièng gèc

3.1.3.2. X¸c ®Þnh ®Æc tÝnh sinh häc:

TiÕn hµnh theo nh÷ng ph­¬ng ph¸p cô thÓ (phô thuéc vµo kh¶ n¨ng sinh ho¹t tÝnh cña tõng nhãm c¸c chñng vi sinh vËt)

3. 2. Ph­¬ng ph¸p b¶o qu¶n d­íi líp dÇu kho¸ng

3.2.1. ChuÈn bÞ:

3.2.1.1. Trang thiÕt bÞ, dông cô : xem 3.1.1.1

3.2.1.2. ChuÈn bÞ dông cô : xem 3.1.1.2

3.2.1.3. M«i tr­êng nu«i cÊy:

• 
  ChuÈn bÞ m«i tr­êng : xem 3.1.1.3
  
• 
  DÇu parafin cã tû träng 0,865-0,890 ®­îc khö trïng ë 121^oC trong 30 phót, sau ®ã ®Ó nhiÖt ®é phßng cho bay hÕt n­íc lÉn trong dÇu.
  

CÊy gièng: xem 3.1.2

Khi tÕ bµo ®· ph¸t triÓn æn ®Þnh, b»ng thao t¸c v« trïng ®æ parafin ®· chuÈn bÞ ë 3.2.1.3 lªn bÒ mÆt th¹ch nghiªng ®· cÊy gièng sao cho khi dùng ®øng èng th¹ch lªn th× bÒ mÆt líp dÇu kho¸ng c¸ch mÐp trªn cña líp th¹ch kho¶ng 1 cm. èng gièng khi ®­a vµo b¶o qu¶n ph¶i ®¹t ®é thuÇn khiÕt 100%.

NhiÖt ®é cÊt gi÷ 4 - 10⁰C, ®Þnh kú cÊy chuyÓn sau 12 th¸ng

3.2.3. KiÓm tra mÉu gièng.

§Þnh kú sau 12 th¸ng kiÓm tra ®é phÇn tr¨m sèng sãt vµ ®Æc tÝnh sinh häc cña mÉu gièng.

3.2.3.1. §é phÇn tr¨m sèng sãt cña mÉu gièng: xem 3.1.3.1

Tr­íc khi lÊy sinh khèi vi sinh vËt ®Ó chuÈn bÞ dÞch huyÒn phï vi khuÈn cÇn lo¹i bá toµn bé líp dÇu kho¸ng b»ng c¸ch dïng pipÐt hót hÕt dÇu kho¸ng, sau ®ã dïng giÊy läc thÊm kh« hÕt dÇu kho¸ng dÝnh trªn bÒ mÆt èng gièng.