TI£u chuèn ngµnh 10 tcn 208 95

Tiªu chuÈn nµy ¸p dông cho viÖc x¸c ®Þnh, kiÓm tra ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬

Ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ (Ph©n ®¹m vi sinh) lµ s¶n phÈm chøa mét hoÆc nhiÒu chñng vi sinh vËt cè ®Þnh nit¬ (VSVC§N) tån t¹i trªn nÒn chÊt mang thanh trïng hay kh«ng thanh trïng.

2.1. Yªu cÇu chung:

• 
  Ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ ph¶i cã hiÖu qu¶ trªn ®ång ruéng nh­ ®· ghi trªn nh·n giíi thiÖu, gåm c¶ møc t¨ng n¨ng xuÊt n«ng phÈm hay tiÕt kiÖm ph©n bãn h÷u c¬ vµ v« c¬.
  
• 
  Ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ kh«ng g©y ®éc h¹i cho ng­êi, ®éng vËt, thùc vËt vµ m«i tr­êng sinh th¸i.
  

C¸c chØ tiªu kü thuËt cña ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ ph¶i phï hîp víi c¸c møc quy ®Þnh trong c¸c b¶ng quy ®Þnh sau:

3.1. LÊy mÉu:

LÊy ngÉu nhiªn 10 gãi, mçi gãi 25-30g hay 25-30ml ®èi víi ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ trªn nÒn chÊt mang thanh trïng hoÆc 500-600g ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ trªn nÒn chÊt mang kh«ng thanh trïng trong mét ®ît s¶n xuÊt cña nhµ m¸y hay c¸c cöa hµng b¸n lÎ, trong ®ã 5 gãi dïng ®Ó kiÓm tra chÊt l­îng hiÖn t¹i vµ 5 gãi kh¸c ®­îc b¶o qu¶n trong ®iÒu kiÖn b×nh th­êng dïng ®Ó kiÓm tra chÊt l­îng lóc cuèi thêi h¹n sö dông.

3.2. KiÓm tra:

3.2.1. ThiÕt bÞ dông cô kiÓm tra:

• 
  B×nh tam gi¸c 250ml.
  
• 
  èng nghiÖm 15x 150mm, 18x 180mm.
  
• 
  PipÐt 1ml, 5ml, 10ml.
  
• 
  Hép lång.
  
• 
  Nåi hÊp khö trïng, tñ sÊy, tñ Êm.
  
• 
  Buång cÊy v« trïng.
  

- M«i tr­êng nu«i cÊy VSVC§N céng sinh (m«i tr­êng YMA)

Manitol 10,0g

K₂HPO₄ 0,5g

MgSO₄. 7H₂O 0,2g

NaCl 0,lg

Cao nÊm men 1,0g

N­íc cÊt võa ®ñ l000ml

Th¹ch 20g

Congo ®á 1% 2,5ml

pH 6,8

- M«i tr­êng nu«i cÊy VSVC§N héi sinh vµ tù do (m«i tr­êng Ashby)

K₂HPO₄ 0,2g

MgSO₄. 7H₂O 0,2g

NaCl 0,2g

K₂SO₄ 0,1g

CaCO₃ 5,0g

N­íc cÊt võa ®ñ l000ml

Th¹ch 20g

pH 6,5-7,0

- M«i tr­êng Glucose peptone (m«i tr­êng GP)

Glucose 5,0g

Pepton 10,0g

Th¹ch 20,0g

Bromocresol 1% trong cån 10,0ml

- M«i tr­êng trång c©y chØ thÞ (m«i tr­êng Jensen)

CaHPO₄ 1,0g

K₂HPO₄ 0,2g

MgSO₄.7H₂O 0,2g

NaCl 0,2g

FeCl₃ 0,1 g

N­íc cÊt võa ®ñ l000ml

Th¹ch 8,0g

Dung dÞch vi l­îng * 1,0ml

pH 6,5-7,0

* Dung dÞch vi l­îng cã thµnh phÇn nh­ sau:

Bo^-: 0,05% Mn^-: 0,05%

Zn^-: 0,005% Mo^- : 0,05 %

Cu^-: 0,02%

C©n vµ hoµ tan c¸c thµnh phÇn m«i tr­êng trong n­íc theo thø tù nh­ trªn. Ph©n m«i tr­êng vµo c¸c b×nh tam gi¸c, lµm nót b«ng ®Ëy kÝn vµ ®em khö trïng. LÊy ra ®Ó nguéi tíi nhiÖt ®é 40-45^oC råi ®æ v« trïng vµo c¸c hép lång ®· khö trïng. §èi víi m«i tr­êng trång c©y chØ thÞ còng lµm nh­ trªn nh­ng ®æ m«i tr­êng vµo c¸c èng nghiÖm 18 x 180mm (kho¶ng 1/3 èng). Lµm nót b«ng vµ khö trïng nh­ trªn, sau ®ã lÊy ra vµ ®Æt nghiªng èng th¹ch víi gãc 45^o.

3.2.3. TiÕn hµnh kiÓm tra:

3.2.3.1. X¸c ®Þnh mËt ®é vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ sèng tù do vµ héi sinh:

MËt ®é VSVC§N sèng tù do vµ héi sinh ®­îc x¸c ®Þnh theo ph­¬ng ph¸p cÊy trªn th¹ch ®Üa víi m«i tr­êng Ashby (Ph­¬ng ph¸p Koch). C¸ch tiÕn hµnh nh­ sau:

C©n 10 g hay 10 ml ph©n cho vµo b×nh tam gi¸c 250ml chøa 90ml n­íc cÊt v« trïng, v« ®¹m. §Ëy kÝn nót b«ng råi ®­a lªn m¸y l¾c, l¾c víi tèc ®é 200 vßng/ phót trong thêi gian 15 phót. Sau ®ã dïng pipÐt v« trïng lÊy lml dung dÞch cho vµo 1 èng nghiÖm chøa 9ml n­íc cÊt v« trïng, v« ®¹m l¾c, khuÊy èng nghiÖm ®Ó trén ®Òu dung dÞch. Dïng pipÐt v« trïng kh¸c lÊy tõ èng nghiÖm nµy ra lml dung dÞch vµ ®­a vµo èng nghiÖm kh¸c còng chøa 9ml n­íc cÊt v« trïng, v« ®¹m nh­ trªn. Trén ®Òu hçn hîp. Qu¸ tr×nh nµy ®­îc tiÕp tôc tiÕn hµnh ®Õn èng nghiÖm thø 7. Tõ èng nghiÖm thø 5, thø 6 vµ thø 7 lÊy ra mçi èng 3 giät dung dÞch (mçi giät t­¬ng ®­¬ng víi 0,04ml) cho vµo 3 hép lång chøa m«i tr­êng th¹ch ®· chuÈn bÞ s½n, mçi hép lång 1 giät. Dïng que g¹t thuû tinh v« trïng dµn ®Òu dung dÞch trªn bÒ mÆt ®Üa th¹ch. §Ó hép lång vµo tñ Êm ë nhiÖt ®é 28^oC vµ tiÕn hµnh nu«i trong thêi gian 48 giê. Sau thêi gian nu«i cÊy lÊy hép lång ra vµ tiÕn hµnh ®Õm sè khuÈn l¹c mäc trªn ®Üa th¹ch (chó ý chØ ®Õm hép lång cã chøa sè khuÈn l¹c tõ 30-300).

S
è l­îng VSVC§N ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau:

N: Sè l­îng VSVC§N/g hay ml

a: Sè l­îng khuÈn l¹c trung b×nh/ hép lång

n: Sè thø tù èng nghiÖm pha lo·ng

* §èi víi lo¹i ph©n vi sinh vËt cè ®Þnh ni t¬ d¹ng tiÒm sinh tr­íc tiªn cÇn ho¹t ho¸ tÕ bµo trong m«i tr­êng Ashby láng chøa 2% rØ ®­êng trong thêi gian 2 giê, sau ®ã tiÕn hµnh kiÓm tra b×nh th­êng nh­ trªn.

3.2.3.2. X¸c ®Þnh sè l­îng VSVC§N sèng céng sinh víi c©y hä ®Ëu (Rhizobium)

§èi víi tÊt c¶ VSVC§N sèng céng sinh cã thÓ dïng ph­¬ng ph¸p cÊy pha lo·ng trªn m«i tr­êng YMA. Ph­¬ng ph¸p ®­îc tiÕn hµnh nh­ phÇn 3.2.3.1. Riªng ®èi víi ph©n VSVC§N dïng cho c©y ®Ëu ®en, ®Ëu xanh, l¹c vµ ®Ëu t­¬ng cã thÓ dïng ph­¬ng ph¸p nhiÔm lªn c©y chØ thÞ, trong ®ã dïng h¹t Sirato (Macroptiliumatropurpureus) cho c©y ®Ëu xanh, ®Ëu ®en, l¹c vµ h¹t ®Ëu t­¬ng d¹i (Glycine ussurieusis) dïng cho ®Ëu t­¬ng. Ph­¬ng ph¸p ®­îc tiÕn hµnh nh­ sau:

Pha lo·ng ph©n nh­ phÇn 3.2.3.1

H¹t Sirato ng©m trong H₂SO₄ ®Æc trong 4 phót sau ®ã röa s¹ch nhanh b»ng n­íc cÊt 4-5 lÇn. H¹t c©y chØ thÞ kh¸c ®­îc thanh trïng 3-4 phót trong dung dÞch HgCl₂ 1/1000 hay cån etylic 90^oC trong 2 phót vµ röa s¹ch b»ng n­íc cÊt v« trïng nhiÒu lÇn. Ng©m h¹t trong n­íc cÊt v« trïng cho ®Õn khi b¾t ®Çu nÈy mÇm (kho¶ng 24-36 giê) råi ®Æt vµo èng th¹ch ®· ®­îc chuÈn bÞ víi m«i tr­êng Jensen nh­ phÇn 3.2.3. Rãt lml dÞch kiÓm tra cã ®é pha lo·ng 10⁶, l0⁷, l0⁸, l0⁹ vµo mçi èng th¹ch. Mçi ®é pha lo·ng lµm 3 èng. §Ëy kÝn nót b«ng vµ ®Æt vµo phßng sinh tr­ëng cã nhiÖt ®é 28⁰C. Sau 10-15 ngµy kiÓm tra sù h×nh thµnh nèt sÇn vµ x¸c ®Þnh mËt ®é tÕ bµo cã trong ph©n b»ng c¸ch kiÓm tra nh­ b¶ng 3 (trang bªn).

3.2.3.3. X¸c ®Þnh vi sinh vËt t¹p:

Sè l­îng vi sinh vËt t¹p ®­îc x¸c ®Þnh b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy trªn th¹ch ®Üa víi m«i tr­êng GP. Ph­¬ng ph¸p ®­îc tiÕn hµnh nh­ phÇn 3.2.3.1.

3.2.3.4. X¸c ®Þnh ®é Èm:

§é Èm cña ph©n ®­îc x¸c ®Þnh b»ng ph­¬ng ph¸p sÊy kh« ë nhiÖt ®é l05⁰C tíi khi träng l­îng mÉu kh«ng thay ®æi (c©n 3 lÇn).

Ph©n VSVC§N ph¶i ®­îc b¶o qu¶n trong c¸c bao gãi tèt chèng ®­îc c¸c ¶nh h­ëng bÊt lîi bªn ngoµi. Nh·n hiÖu ph¶i cã ®Çy ®ñ c¸c néi dung sau:

• 
  §èi t­îng sö dông
  
• 
  Tªn vi sinh vËt h÷u Ých cã chøa trong s¶n phÈm
  
• 
  MËt ®é VSVC§N
  
• 
  Khèi l­îng tÞnh, khèi l­îng bao
  
• 
  Ph­¬ng ph¸p, kü thuËt sö dông vµ b¶o qu¶n
  
• 
  Ng­êi vµ ngµy kiÓm tra chÊt l­îng xuÊt x­ëng
  
• 
  Ngµy vµ ®Þa ®iÓm s¶n xuÊt
  
• 
  Thêi h¹n sö dông