TỐI Ưu hoá quy trình sắc ký LỎng hiệu năng cao đỊnh lưỢng đỒng thời các thuốc kháng hiv trong dịch sinh họC

Mục đích: Hiện tại ở Việt nam, phác đồ điều trị HIV/ AIDS phải kết hợp đồng thời nhiều thuốc, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu dược động học và kiểm soát hiệu quả trị liệu thì việc xây dựng một quy trình HPLC định lượng đồng thời các hoạt chất là rất cần thiết. Công nghệ thông minh ngày càng được ứng dụng có hiệu quả trong nghiên cứu và phát triển. Vì vậy, mục tiêu của đề tài là phân tích các mối liên quan nhân quả, thực hiện tối ưu hóa đa đáp ứng và thẩm định phương pháp đã tối ưu để định lượng đồng thời 5 thuốc kháng HIV với sự trợ giúp của bộ công cụ phần mềm thông minh.

Đối tượng & Phương pháp: Đối tượng nghiên cứu: các thuốc kháng HIV 3TC, d4T, AZT, NVP, EFV trong huyết tương người. Thiết bị và dung môi: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 Series, cột: Inertsil ODS - 3 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). Dung môi methanol, acetonitril (Merck, Đức). Điều kiện HPLC và xử lý mẫu: Mẫu huyết tương được xử lý bằng cách tủa protein và chiết pha rắn. Khảo sát các điều kiện HPLC ảnh hưởng đến độ nhạy, hiệu quả tách và tính chọn lọc của phương pháp như pH pha động, tốc độ dòng, chương trình rửa giải. Áp dụng các phần mềm (của Intelligensys Ltd., Anh): FormData v3 (2010) - thiết kế thí nghiệm, FormRules v3.3 (2007) - phân tích liên quan nhân quả, và INForm v4.0 (2010) - tối ưu hóa thông số.

Kết quả: Nghiên cứu thăm dò: Mẫu được xử lý bằng phương pháp chiết pha rắn, điều kiện HPLC: pH của pha động, tốc độ dòng, chương trình rửa giải được chọn lựa theo mô hình D-Optimal. Phân tích liên quan nhân quả: Các dữ liệu thực nghiệm được phân tích bởi phần mềm thông minh FormRules về xu hướng, mức độ, quy luật liên quan giữa các điều kiện HPLC (thành phần pha động, tốc độ dòng, chương trình rửa giải) với kết quả của HPLC (như: thời gian lưu, diện tích pic, chiều cao pic, hệ số đối xứng, độ phân giải).

Kết luận: Xây dựng thành công quy trình HPLC tối ưu để định lượng đồng thời 5 thuốc kháng HIV trong dịch sinh học. Bộ công cụ phần mềm thông minh đã được chứng minh là hữu ích trong xây dựng quy trình. Phương pháp nghiên cứu có triển vọng để ứng dụng trong các nghiên cứu dược động học, theo dõi quá trình điều trị đối với bệnh nhân nhiễm HIV và đánh giá tương đương sinh học các thuốc đa thành phần.

Việc điều trị HIV gặp nhiều khó khăn bởi phải dùng đồng thời nhiều thuốc, tỷ lệ kháng thuốc cao và đặc điểm bệnh tật của mỗi bệnh nhân, sự không tuân thủ đúng phác đồ điều trị... Do đó, việc thất bại trong vấn đề điều trị chiếm một tỷ lệ rất lớn. Hiện tại, ở Việt Nam có 2 phác đồ điều trị HIV và phác đồ chủ lực để điều trị HIV vẫn là nhóm I của phác đồ bậc 1 {stavudin(d4T) hoặc zidovudin(AZT) + lamivudin(3TC) + nevirapin(NVP) hoặc efavirenz(EFV)}[1]. Do tính chất phức tạp của việc sử dụng đồng thời nhiều thuốc nên các đề tài nghiên cứu về dược động học của các thuốc dùng phối hợp trong các phác đồ tương ứng tại Việt Nam, hiện còn rất hạn chế. Một quy trình phân tích có thể định lượng được đồng thời nhiều hoạt chất sẽ mang lại thuận lợi rất lớn trong việc theo dõi hiệu quả điều trị. Các phương pháp phân tích truyền thống trước đây rất khó cho kết quả định lượng đồng thời nhiều chất được chính xác với lượng mẫu rất nhỏ đặc biệt là trong một nền mẫu phức tạp như dịch sinh học. Để xây dựng một quy trình định lượng đồng thời nhiều thuốc kháng HIV trong một phác đồ điều trị bằng HPLC, thông thường nhà phân tích có thể chọn phương pháp thăm dò theo kinh nghiệm. Tuy nhiên, việc làm này mất rất nhiều thời gian, công sức và chi phí mà kết quả nhiều khi không thành công như mong đợi. Nếu nhà phân tích có được một phương pháp phân tích tối ưu từ sự trợ giúp hữu hiệu của các phần mềm thông minh thì có thể tiết kiệm thời gian, công sức và gặt hái được nhiều thành công hơn.

Xuất phát từ những yêu cầu thực tế này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời các thuốc kháng HIV trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với sự trợ giúp của phần mềm thông minh nhằm góp phần nâng cao hiệu quả điều trị cho những bệnh nhân nhiễm HIV.

II. THỰC NGHIỆM

1. Thiết bị và hóa chất

1.1. Thiết bị và phần mềm:

*Thiết bị:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200Series với detector DAD

- Máy đo pH TOADK HM 25R, cân phân tích 4 chữ số Shimadzu UXW 220, bộ chiết pha rắn, tủ đông sâu -70 ^oC, máy ly tâm, một số thiết bị phụ trợ khác và dụng cụ thủy tinh các loại

*Phần mềm:

- FormData v3 (2010) của Intelligensys Ltd., Anh.

- FormRules v3.3 (2007) của Intelligensys Ltd., Anh.

- INForm v4.0 (2010) của Intelligensys Ltd., Anh.

- Chất chuẩn; hóa chất: Stavudin, Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin, Efavirenz, Abacavir(ABC) từ Hetero Labs Limited - Ấn Độ; KH2PO4, H3PO4, Methanol, Acetonitril, huyết tương trắng của người, nước cất 2 lần.

- Dung dịch chuẩn: dung dịch các chất chuẩn các loại

- Mẫu thử tự tạo bằng cách thêm hỗn hợp các chất chuẩn vào huyết tương trắng.

- Một số mẫu thực tế.

* Thăm dò quy trình HPLC

- Thăm dò các điều kiện HPLC: Trên cơ sở tham khảo các tài liệu đã công bố, khảo sát tìm điều kiện sắc ký phù hợp

- Thăm dò điều kiện xử lý mẫu huyết tương: Phương pháp tủa protein và chiết pha rắn

- Đề xuất điều kiện HPLC: Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy, hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp được khảo sát như thành phần pha động, tốc độ dòng, kiểu rửa giải…

* Xây dựng quy trình HPLC tối ưu

- Thiết kế mô hình thí nghiệm:

+ Chọn biến số: gồm biến số độc lập (x₁: Thành phần pha động, x₂: Chương trình rửa giải gradient, x₃: Tốc độ dòng) và biến số phụ thuộc (y_1a, y_1b, y_1c, y_1d, y_1e, y_1f lần lượt là thời gian lưu của 3TC, d4T, AZT, ABC, NVP, EFV; y_2a, y_2b, y_2c, y_2d, y_2e, y_2f lần lượt là diện tích pic của 3TC, d4T, AZT, ABC, NVP, EFV; y_3a, y_3b, y_3c, y_3d, y_3e, y_3f lần lượt là chiều cao pic của 3TC, d4T, AZT, ABC, NVP, EFV; y_4a, y_4b, y_4c, y_4d, y_4e, y_4f lần lượt là hệ số đối xứng của 3TC, d4T, AZT, ABC, NVP, EFV; y_5a, y_5b, y_5c, y_5d, y_5e, y_5f lần lượt là độ phân giải của 3TC và d4T, d4T và AZT, AZT và ABC, ABC và NVP, NVP và EFV, EFV và pic tạp)

+ Áp dụng phần mềm: FormData v3 (2010)

+Đầu ra: Mô hình D-Optimal, n = 15

• 
  Phân tích nhân quả:
  

+ Áp dụng phần mềm: Phần mềm thông minh FormRules v3.3 (2007).

+ Đầu ra: Xu hướng, mức độ, quy luật liên quan giữa các biến số độc lập và phụ thuộc.

• 
  Tối ưu hóa các thông số:
  

+ Áp dụng phần mềm: Phần mềm thông minh INForm v4.0 (2010), thuật toán (mặc định), nhóm

+ Đầu ra: Thông số tối ưu: đối với các biến số độc lập và giá trị dự đoán: đối với các biến số phụ thuộc

Kiểm chứng công thức tối ưu: Lặp lại quy trình HPLC ít nhất trên 3 mẫu, so sánh kết quả dự đoán (bởi INForm) với kết quả thực nghiệm (trung bình).

* Thẩm định phương pháp

Đánh giá độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD); độ đúng thông qua tỷ lệ thu hồi (Rev); xác định giới hạn định lượng dưới bằng tỷ số S/N  5; đánh giá tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và tỷ số diện tích pic thông qua hệ số tương quan R, độ ổn định của mẫu thử và mẫu chuẩn trong các điều kiện khác nhau.

Tiến hành khảo sát trên cột sắc ký C18, với ba hệ pha động và kiểu rửa giải tiệm tiến (Gradient), phân tích tại nhiệt độ phòng thí nghiệm với thể tích tiêm 30 µl, bước sóng 254 nm được lựa chọn để phát hiện đồng thời các thuốc kháng HIV (ARV).

Phương pháp kết tủa protein còn lẫn nhiều tạp chất. Lựa chọn phương pháp chiết pha rắn, chọn cột SPE C18 3 ml, sau khi cho dịch ly tâm (Hút 100 µl dung dịch nội chuẩn nồng độ 2 ppm trong methanol, cho vào 600 µl huyết tương, vortex 5 phút, ly tâm 15000 vòng/ phút trong 10 phút) chảy qua cột (không dùng bơm hút chân không), khoảng 10 phút sau tiến hành rửa cột với 2 ml methanol 5% và rửa giải với 1 ml methanol. Dịch rửa giải thu được ít tạp hơn, hiệu suất chiết cao và tương đương giữa các thuốc.

Các kết quả thăm dò điều kiện sắc ký cho thấy pH pha động, tốc độ dòng và chương trình rửa giải gradient có ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp. Vì vậy các điều kiện sắc ký sau đây được đề xuất cho giai đoạn thiết kế mô hình thí nghiệm.

• 
  Pha động: Nước acid phosphoric pH 4,4 – acetonitril
  

Nước acid phosphoric pH 6,4 – acetonitril

• 
  Cột: Inertsil ODS - 3 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)
  
• 
  Tốc độ dòng: 0,8; 1,0; 1,2 ml/ phút
  
• 
  Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng 25 ^oC
  
• 
  Đầu dò DAD: 254 nm
  
• 
  Thể tích tiêm mẫu: 30 µl
  
• 
  Kiểu rửa giải: Gradient 1, Gradient 2, Gradient 3
  

Bảng 1. Mô hình thực nghiệm kiểu D-Optimal (n = 15)

x₁ = Thành phần pha động:

4,4 = Acetonitril – Nước acid pH 4,4

5,4 = Acetonitril – Nước acid pH 5,4

6,4 = Acetonitril – Nước acid pH 6,4

x₂ = Chương trình rửa giải gradient: G1 = Gradient 1; G2 = Gradient 2; G3 = Gradient 3

x₃: Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút; 1,0 ml/ phút; 1,2 ml/ phút

2.2. Dữ liệu thực nghiệm

Với mô hình thực nghiệm trên, thông tin về điều kiện tiến hành sắc ký (x_i) và các kết quả HPLC (y_i) như thời gian lưu, diện tích pic, độ phân giải…trong quá trình thực nghiệm sẽ dùng làm các dữ liệu đầu vào cho phần mềm FormRules để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện HPLC. Sau đó dữ liệu tổng hợp sẽ được dùng làm đầu vào cho phần mềm INForm để tối ưu hóa các thông số của quy trình HPLC.

Kết quả phân tích bởi phần mềm thông minh FormRules cho thấy xu hướng và mức độ liên quan giữa y_i và x_i được tổng hợp lại như trong bảng 2 (chỉ chọn lọc các xu hướng và mức độ liên quan đáng kể)

Từ kết quả phân tích liên quan nhân quả, các biến số độc lập (x_i) và biến số phụ thuộc (y_i) có thể được chọn làm đầu vào cho giai đoạn tối ưu hóa điều kiện, kết quả tối ưu hoá như sau:

x₁ = Thành phần pha động: Acetonitril – nước acid pH = 5,34

x₂ = Chương trình rửa giải gradient: G1

x₃ = Tốc độ dòng: 0,99 ml/ phút

Quy trình HPLC tối ưu được áp dụng để phân tích trên 3 mẫu huyết tương tự tạo chứa các thuốc kháng HIV. Kết quả phân tích được so sánh với dự đoán của phần mềm INForm và được trình bày trong bảng 3

Tiến hành sắc ký mẫu huyết tương trắng, mẫu thử tự tạo (mẫu huyết tương chứa các thuốc ARV và nội chuẩn ABC) và mẫu chuẩn pha trong dung môi methanol có nồng độ tương ứng với mẫu tự tạo, kết quả như sau:

- Thời gian lưu của các thuốc ARV trong mẫu thử tương đương thời gian lưu của các pic tương ứng trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng không có pic ở các vị trí tương ứng.

- Pic của các thuốc ARV tách hoàn toàn trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tự tạo.

- Phổ UV tại thời gian lưu của các thuốc ARV trong mẫu thử giống phổ UV tại thời gian lưu của các pic tương ứng trong mẫu chuẩn.

4.2. Hiệu suất chiết

Tiến hành sắc ký các mẫu thuốc ARV trong huyết tương ở 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao, riêng nồng độ của nội chuẩn cố định là 2,0 µg/ ml ở cả 3 mức. So sánh với diện tích pic của các thuốc ARV ở nồng độ tương ứng trong dung môi methanol, không qua quá trình chiết (xem như tỷ lệ thu hồi 100%). Mỗi nồng độ thực hiện 6 mẫu. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của các thuốc ARV và chuẩn nội ABC cho hiệu suất chiết các thuốc ARV trong huyết tương tương đối cao và ổn định ở cả 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao.

Xây dựng các khoảng nồng độ có 6 - 7 mức cho mỗi chất, riêng với nồng độ của ABC (nội chuẩn) sẽ cố định trong tất cả các mẫu ở nồng độ 2,0 µg/ ml.

Bảng 4. Khoảng nồng độ của các thuốc kháng HIV

Biểu đồ 1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ các thuốc ARV trong huyết tương

và tỷ số diện tích pic

Bảng 5. Phương trình hồi quy và giá trị hệ số tương quan của các thuốc ARV

Ở nồng độ 3TC, d4T, AZT, ABC, NVP, EFV lần lượt là 0,1 g/ml; 0,25 g/ml; 0,07 g/ml; 0,15 g/ml; 0,03 g/ml và 0,15 g/ml, các kết quả sau khi phân tích đều cho tỷ số S/N lớn hơn 5 và đạt độ chính xác, độ đúng theo qui định. Do đó, các nồng độ này được chấp nhận là giới hạn định lượng dưới.

Khảo sát độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày của mẫu huyết tương có chứa các thuốc ARV ở 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao. Mỗi mức nồng độ khảo sát 6 mẫu. Từ kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 6 cho thấy phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đúng (tỷ lệ phục hồi từ 85% - 115%) và độ chính xác (RSD < 15%).

Bảng 6. Độ đúng - độ chính xác trong ngày và khác ngày

	Nồng độ lý thuyết (g/ml)	Trong ngày			Khác ngày
		NĐ tìm thấy (TB ± CL; g/ml)	(RSD%)	Tỷ lệ phục hồi (%)	NĐ tìm thấy (TB ± CL; g/ml)	(RSD%)	Tỷ lệ phục hồi (%)
Lamivudin	0,50	0,52 ± 0,02	5,14	105,8	0,53 ± 0,01	4,94	106,0
	1,50	1,58 ± 0,06	3,53	105,7	1,58 ± 0,03	3,88	105,7
	2,50	2,69 ± 0,06	1,60	107,7	2,72 ± 0,03	2,20	109,0
Stavudin	0,35	0,38 ± 0,01	2,96	108,8	0,38 ± 0,01	3,46	108,5
	0,60	0,64 ± 0,02	4,12	107,3	0,65 ± 0,01	4,01	108,3
	1,00	1,08 ± 0,03	4,67	108,4	1,09 ± 0,01	3,25	109,4
Zidovudin	0,50	0,45 ± 0,02	3,56	90,7	0,45 ± 0,01	4,28	90,9
	1,50	1,62 ± 0,06	5,54	108,6	1,60 ± 0,03	3,99	106,7
	2,50	2,31 ± 0,11	3,92	92,7	2,37 ± 0,05	4,56	95,1
Nevirapin	0,50	0,44 ± 0,05	3,64	89,7	1,49 ± 0,02	3,65	99,4
	1,50	1,47 ± 0,01	4,53	98,3	2,93 ± 0,08	5,82	97,8
	3,00	2,79 ± 0,02	3,83	93,2	1,49 ± 0,02	3,65	99,4
Efavirenz	1,00	1,12 ± 0,02	2,29	112,3	1,11 ± 0,01	2,20	111,9
	3,00	3,32 ± 0,21	1,56	111,0	3,35 ± 0,02	1,48	111,8
	5,00	5,28 ± 0,05	3,87	105,7	5,36 ± 0,10	3,83	107,2

4.6. Độ ổn định của mẫu thử và mẫu chuẩn

Độ ổn định của dung dịch gốc, chuẩn nội và các mẫu thử tự tạo được đánh giá ở các điều kiện bảo quản khác nhau: ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, ở -70 ^oC trong khoảng 1 tháng, sau 3 chu kỳ đông, rã đông ở nhiệt độ -70 ^oC và sau khi xử lý mẫu 12 tiếng ở nhiệt độ phòng. Bằng phép phân tích phương sai một yếu tố cho thấy các giá trị tìm lại trung bình của các thuốc ARV trong huyết tương sau các quá trình bảo quản khác nhau không có ý nghĩa thống kê ( p = 0,05).

Với các kết quả thực nghiệm thu được, phương pháp định lượng đồng thời các thuốc ARV đạt yêu cầu thẩm định của quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học về tính đặc hiệu, hiệu suất chiết, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, độ ổn định theo hướng dẫn của FDA Hoa Kỳ.

5. Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế

Áp dụng quy trình đã được thẩm định để phân tích trên 2 mẫu huyết tương của bệnh nhân đang điều trị HIV bằng 3 thuốc ARV với liều dùng như trong nhóm I/ phác đồ bậc 1 do Trung tâm phòng chống và điều trị HIV/AIDS tỉnh Thừa Thiên Huế cung cấp, kết quả thu được ở bảng 7

Bảng 7. Các thông số HPLC và nồng độ thuốc ARV trong huyết tương bệnh nhân (n=2)

	Thuốc	tr (phút)	Tỷ số diện tích pic (S/SIS)	NĐ trong mẫu phân tích (µg/ml)	NĐ trong huyết tương (µg/ml)
Bệnh nhân 1	3TC	6,03	14,6	0,40	0,68
	AZT	12,97	5,7	0,11	0,19
	NVP	17,79	149,6	2,12	3,53
Bệnh nhân 2	3TC	6,04	12,9	0,35	0,58
	AZT	12,67	24,9	0,49	0,81
	EFV	22,09	269,6	2,81	4,69

Bệnh nhân 1: Nồng độ của NVP gần với giá trị Cmax = 4,5 ± 1,9 µg/ ml [4], còn nồng độ của 3TC và AZT nằm trong khoảng nồng độ xác định được của thuốc trong huyết tương là 0,05 – 10 µg/ µl đối với 3TC [2] và 0,025 – 10 µg/ µl đối với AZT [2].

Bệnh nhân 2: Nồng độ của EFV gần với giá trị Cmax = 4,0 ± 1,1 µg/ ml [3], còn nồng độ 3TC và AZT nằm trong khoảng nồng độ xác định được của thuốc trong huyết tương [2].

Từ các kết quả phân tích trên cho thấy: nồng độ của các thuốc này trong huyết tương bệnh nhân phù hợp với các tài liệu đã công bố.

IV. KẾT LUẬN

Đã xây dựng được quy trình tối ưu để định lượng đồng thời stavudin, zidovudin, lamivudin, nevirapin và efavirenz trong dịch sinh học bằng HPLC với sự trợ giúp của các phần mềm thông minh và bước đầu đã ứng dụng thành công quy trình này để định lượng trên mẫu huyết tương của bệnh nhân nhiễm HIV đang được điều trị. Phương pháp đã nghiên cứu có thể được ứng dụng để đánh giá tương đương sinh học của các thuốc phiên bản, theo dõi hiệu quả điều trị và nghiên cứu dược động học.

1. 
   Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS. Quyết định số 3003/QĐ-BYT ngày 29/05/2009, tr. 2.
   
2. 
   Notari Stefania, Alessio Bocedi, Giuseppe Ippolito, Pasquale Narciso, Leopoldo Paolo Pucillo, Gianna Tossini, Raffaele Perrone Donnorso, Francesco Gasparrini, Paolo Ascenzi (2006), “Simultaneous determination of 16 anti-HIV drugs in human plasma by high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography B 831, pp. 258–266.
   
3. 
   SUSTIVA^® (efavirenz) capsules and tablets (2011), Highlights of prescribing information, Bristol-Myers Squibb, p. 7.
   
4. 
   Viramune^® (nevirapine) tablets (2011), Highlights of prescribing information, Boehringer Ingelheim, p. 10.