THỊt và CÁc sản phẩm của thịt-xáC ĐỊnh tổng số bacillus cereus



tải về 88.95 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu13.08.2016
Kích88.95 Kb.
#18605



BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

__________________

10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 731-2006



THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊT-XÁC ĐỊNH

TỔNG SỐ BACILLUS CEREUS

(Meat and meat products - Enumeration of Bacillus cereus)

Hà Nội - 2006




TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 731-2006


THỊT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA THỊT-XÁC ĐỊNH

TỔNG SỐ BACILLUS CEREUS

(Meat and meat products - Enumeration of Bacillus cereus)


(Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN

ngày tháng 6 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)



1. Phạm vi áp dụng

Qui trình này để xác định tổng số Bacillus cereus trong thịt và sản phẩm của thịt.



2. Định nghĩa

Bacillus cereus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nguy hiểm với các triệu chứng như nôn mửa và tiêu chảy. B. cereus là vi khuẩn hình gậy, gram dương có nha bào, sản sinh men lecithinase, phản ứng VP và catalase dư­ơng tính. Phần lớn các chủng có phản ứng oxidase âm tính.

3. Thiết bị, dụng cụ thuỷ tinh và giống vi khuẩn

3.1. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh

3.1.1. Tủ lạnh

3.1.2 Tủ sấy

3.1.3. Tủ ấm

3.1.4. Máy đồng nhất mẫu (Stomacher)

3.1.5. Máy trộn tốc độ cao (Vortex)

3.1.6. Nồi hấp cách thuỷ

3.1.7. Nồi hấp áp lực

3.1.8. Đèn Bunse loại nhỏ và lớn

3.1.9. Kính hiển vi

3.1.10. Bình nuôi cấy yếm khí

3.1.11. Que cấy vòng (đường kính 3-4mm)

3.1.12. Đèn cồn

3.1.13. Dụng cụ thuỷ tinh


  • Bình thuỷ tinh 1000ml, 500ml và 200ml

  • Ống đong

  • Pipet các loại 25ml, 10ml, 5ml và 1ml, được chia vạch 0,5ml và 0,1ml

  • Ống nghiệm 13x100mm và 16x125mm

  • Đĩa petri tiệt trùng

  • Phiến kính soi tiêu bản

3.2. Giống vi khuẩn

Chủng chuẩn Bacillus cereus



4. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử (xem phần phụ lục)

4.1. Nước pepton

4.2. Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin (MYP)

4.3. Môi trường và thuốc thử phản ứng Voges-Proskauer (VP)

4.4. Môi trường kiểm tra đặc tính di động

4.5. Thuốc nhuộm gram

4.6. Thạch dinh dưỡng

4.7. Thuốc thử của phản ứng catalase

4.8. Thuốc thử của phản ứng oxidase

5. Lấy mẫu

Theo TCVN 4833 - 2002



6. Cách tiến hành

Tiến hành nuôi cấy chủng chuẩn Bacillus cereus tuần tự theo qui trình nuôi cấy mẫu để kiểm tra chất lượng môi trường và phương pháp.



6.1. Đồng nhất mẫu

- Cân 25g mẫu cho vào túi polymer chuyên dùng kèm máy stomacher, thêm 225ml dung dịch pha loãng pepton (4.1.)

- Sử dụng máy đồng nhất mẫu (stomacher) làm đồng nhất mẫu trong khoảng thời gian 2 phút. Mẫu trong túi đồng nhất có độ pha loãng là 10-1.

- Tiếp tục pha loãng mẫu bằng dung dịch (4.1.) theo cơ số 10



6.2. Nuôi cấy phân lập

- Mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa thạch MYP (4.2), mỗi đĩa 0,1ml, láng đều dung dịch mẫu trên mặt thạch. Đặt các đĩa thạch đã cấy mẫu ở 35-370C trong 24h.

- Kiểm tra các đĩa thạch. Các khuẩn lạc B.cereus giả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng nhạt được bao quanh bởi một vùng kết tủa do hoạt động của men lecithinase. Một số chủng B.cereus chỉ sinh ít hoặc không sinh lecithinase sẽ không có vùng kết tủa bao quanh. Các khuẩn lạc này cũng cần được thử khẳng định. Đếm các khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp.

6.3. Khẳng định vi khuẩn

6.3.1. Đánh giá vi khuẩn học



* Nuôi cấy trên thạch dinh dưỡng

Lấy vài khuẩn lạc nghi ngờ là B.cereus ở (6.2.) cấy chuyển vào các ống thạch dinh dưỡng nghiêng (4.6), ủ ấm ở 35-370C trong 24h.


* Nhuộm gram

Lấy khuẩn lạc mọc trên thạch nghiêng (6.3.1) nhuộm gram và kiểm tra hình thái vi khuẩn. Quá trình nhuộm tiến hành trong vòng 3-4 phút, rồi đọc kết quả. B.cereus bắt màu tím, nên là vi khuẩn gram dương, trong vi trường chúng xếp dạng chuỗi ngắn hoặc dài.



* Nhuộm nha bào

Nha bào có hình oval, nhân ở phần đuôi nhưng không làm biến dạng thân vi khuẩn.

6.3.2. Khẳng định bằng các phản ứng sinh hoá

* Pha loãng khuẩn lạc

Lấy khuẩn lạc từ các ống thạch nghiêng (6.3.1) chuyển vào các ống nghiệm có chứa 0,5ml dung dịch pha loãng pepton (4.1), trộn đều vi khuẩn bằng máy trộn vortex. Tiếp tục cấy chuyển vào các môi trường sau để làm phản ứng sinh hoá.



* Phản ứng VP

Lấy đầy 1 vòng que cấy canh khuẩn (10l), cấy chuyển vào môi trường VP (4.3.1) và để ở 350C trong 48 2h. Sau đó lấy 1ml canh khuẩn cho vào ống nghiệm kích thước 16x125 mm và thêm vào 0,6 ml dung dịch alpha-naphthol và 0,2 ml potasium hydroxide 40% (4.3.2). Lắc đều và thêm vào một vài tinh thể creatine (4.3.3). Để tại nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 1 giờ. Phản ứng dương tính khi có mầu hồng hoặc màu tím xuất hiện.



* Thử phản ứng catalase

Lấy một khuẩn lạc điển hình và hoà vào một giọt dung dịch hydro peroxit 3% trên phiến kính. Đọc kết quả trong vòng 1 phút, khi thấy có tạo bọt khí chứng tỏ là phản ứng dương tính.



* Thử phản ứng oxidase

Nhỏ thuốc thử oxidase, đọc kết quả trong vòng 1 phút, nếu phản ứng dương tính khuẩn lạc biến đổi sang mầu hồng và chuyển dần sang mầu tím. Khuẩn lạc không đổi màu là phản ứng âm tính. B.cereus có phản ứng oxidase âm tính.



* Kiểm tra đặc tính di động

Lấy đầy 1 vòng que cấy canh khuẩn (10l) cấy trích sâu xuống giữa môi trường di động (4.4), đặt ống nghiệm ở 300C trong 18-24h. Các vi khuẩn di động sẽ mọc lộn xộn xung quanh đường cấy. Hầu hết các chủng B.cereusB.thuringiensis là di động, chỉ có một vài chủng B.cereusB.anthracis là không di động.



6.4. Các tiêu chuẩn khẳng định B.cereus

Nhuộm gram

Gram dương, hình gậy

Nhuộm nha bào

hình oval, nhân ở phần đuôi, không làm biến dạng vi khuẩn

Phản ứng catalase

dương tính

Phản ứng VP

dương tính

Phản ứng oxidase

âm tính

Đặc tính di động

phần lớn các chủng B. cereus di động

7. Biểu thị kết quả

7.1 Trường hợp chung

7.1.1 Tính số lượng a của B.cereus có phản ứng dương tính với các test sinh hoá (6.3.2.) đã nhận dạng trên mỗi đĩa đã chọn

Trên mỗi đĩa, tính số lượng a các B.cereus có phản ứng dương tính với test sinh hoá (6.3.2.) đã nhận dạng, theo công thức:

trong đó


c là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua test sinh hoá (6.3.2.);

nc là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua test sinh hoá (6.3.2.);

bc là số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với các test

sinh hoá;



bnc là số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với các test sinh hoá;

cc là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa (6.3.2);

cnc là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa (6.3.2);

Lấy kết quả tròn số [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

7.1.2 Tính số lượng N B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2.) đã được nhận dạng có mặt trong phần mẫu thử

Đối với các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điển hình ở hai độ pha loãng liên tiếp, thì tính số lượng B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2.) đối với mỗi đĩa theo qui định trong (7.1.1) và tính số N B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2) được nhận biết có mặt trong mẫu thử, là trung bình thu được từ hai độ loãng liên tiếp, bằng công thức sau:



trong đó


a là tổng số khuẩn lạc B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá

(6.3.2.) đã nhận biết trên tất cả các đĩa đã chọn.



V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất;

n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai;

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng).

Làm tròn các kết quả đã tính đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Báo cáo kết quả theo số B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2.) trong 1 gam được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10­x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10.

7.2 Ước tính các số lượng nhỏ

7.2.1 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm ở dạng khác), mỗi đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc đã được nhận biết thì báo cáo các kết quả như sau:

a) Đối với các sản phẩm dạng lỏng, số B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một mililit được ước tính như sau:

trong đó


a là tổng số khuẩn lạc B.cereus nhận biết được (7.1.1) trên hai đĩa đã chọn;

V là thể tích cấy lên mỗi đĩa.

b) Đối với các sản phẩm ở dạng khác, số B.cereus có phản ứng dương tính trong một gam được ước tính như sau:



trong đó


a là tổng số khuẩn lạc B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) nhận biết được trên hai đĩa đã chọn;

d là độ pha loãng của huyền phù ban đầu;

V là thể tích cấy lên mỗi đĩa.

7.2.2 Nếu hai đĩa tương ứng khi cấy 0,1 ml (trường hợp chung là 0,1 ml dịch cấy) mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không chứa bất kỳ khuẩn lạc B.cereus nào có phản ứng dương tính (6.3.2.) thì báo cáo kết quả như sau ;

- Ít hơn 10 B.cereus có phản ứng d­ương tính (6.3.2.) trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng);

 Ít hơn 10/d B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là độ pha loãng của huyền phù ban đầu.

7.2.3. Nếu cấy 1 ml mẫu, thì báo cáo kết quả như­ sau:

- Ít hơn 1 B.cereus có phản ứng d­ương tính (6.3.2.) trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng);

- Ít hơn 1/d B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một gam (sản phẩm dạng khác).

8. Tài liệu tham khảo

8.1. Microbiologycal method for meat industry 1991 New Zealand.

8.2. TCVN 6404: 1998 (ISO 7218: 1997) Vi sinh vật học – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật

8.3. TCVN 4833: 2002 Lấy mẫu thịt


KT. BỘ TRƯỞNG

THỨ TRƯỞNG
Bùi Bá Bổng

Phụ lục



4. Môi trường nuôi cây và thuốc thử

4.1. Nước pepton

Thành phần:



Peptone

NaCl


Nước cất

1,0g

8,5g


1000ml

Cách pha chế

Hoà tan các thành phần vào nước cất, điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng pH là 7,2 + 0,2. Đóng 225ml môi trường vào các bình tam giác. Hấp ướt ở 121oC trong 15 phút. Môi trường được bảo quản ở 4-100 C, sử dụng được trong 1 tháng.

4.2. Thạch mannitol- Egg Yolk- Polymyxin (MYP)

4.2.1. Môi trường cơ sở

Thành phần:


Cao thịt bò

1,0 g

Pepton từ casein

10,0 g

D-mannitol

10,0 g

NaCl

10,0 g

Phenol đỏ

0,025 g

Thạch

12 g đến 18 g a

Nước cất

900 ml

a Tuỳ thuộc vào khả năng đông của thạch.

Cách pha chế

Cho các thành phần chất khô vào nước, đun nóng và khuấy đều để hoà tan các chất. Chỉnh pH để sau khi tiệt trùng môi trường có pH là 7,20,2, rót từ 225ml đến 500 ml vào các bình tam giác. Hấp ướt ở 1210C trong 15 phút. Bảo quản ở 4-100C môi trường có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng.

4.2.2. Thành phần bổ sung 1 (dung dịch polymixin B 0,1%)

Cách pha chế:

Hoà tan 500,000 đơn vị polymixin B sulfate nguyên chất vào 50ml nước cất. Bảo quản trong lọ thuỷ tinh dung tích 85ml ở 40C.

4.2.3. Thành phần bổ sung 2 (Dung dịch lòng đỏ trứng)

Cách pha chế:

Rửa 2 quả trứng tươi bằng bàn chải cứng và làm khô. Ngâm trứng trong dung dịch cloramin 0,1% trong 1 giờ. Đổ dung dịch cloramin đi và thay bằng dung dịch Ethanol 70% ngâm trứng 30 phút. Đập trứng một cách vô trùng, gạn lấy lòng đỏ. Thêm 1 lượng nước muối 0,85 % vô trùng vào lòng đỏ trứng theo tỷ lệ 1:1, trộn đều. Bảo quản nước trứng ở 40 C có thể sử dụng trong 1 tuần.


4.2.4.Môi trường hoàn chỉnh

Thêm 2,5ml polymixin B và 12,5ml dung dịch nước trứng vào 225ml dung dịch cơ sở (4.2.1) đã đun tan chảy và làm nguội đến 500C. Trộn đều rót 18ml môi trường vào đĩa petri kích cỡ 15x100mm. Để môi trường ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng 24 giờ.


4.3. Môi trường và thuốc thử Voges-Proskauer (VP)

4.3.1. Môi trường VP

Thành phần:


Peptone proteose

Glucose


NaCl

Nước cất



7,0g

5,0g


5,0g

1000ml


Cách pha chế:

Đun nóng để hoà tan các thành phần trong 1000ml nước cất, điều chỉnh để cuối cùng môi trường có pH là 6,5  0,2. Đóng 5ml môi trường vào ống nghiệm, hấp ướt 10 phút ở 1210 C. Môi trường được bảo quản ở 4 - 100C dùng được trong 1 tháng.

4.3.2. Thuốc thử VP

Thành phần:



Dung dịch 1:

a-Naphtol

Cồn tuyệt đối

Dung dịch 2:

Potassium hydroxide

Nước cất vừa đủ


5,0g


100ml
40,0g

100ml


4.3.3. Tinh thể creatine

4.4. Môi trường kiểm tra đặc tính di động

Thành phần:



Trypticase

Men bia


Glucose

Na2HPO4

Thạch

Nướt cất


10,0g

2,5 g


5,0g

2,5g


3,0g

1000ml


Cách pha chế:

Cho các thành phần vào nước đun sôi để hoà tan tất cả các chất, điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng pH là 7,4 + 0,2. Đóng môi trường vào các bình tam giác 100-170ml, hấp ướt ở 121oC trong 15 phút. Để nguội đến 50oC, chia 2ml môi trường vào các ống nghiệm có kích cỡ 13 x100 mm. Bảo quản môi trường ở nhiệt độ phòng 2 ngày trước khi sử dụng.



4.5. Thuốc nhuộm gram

4.5.1. Hucker’s Crystal violet

Thành phần:


Dung dịch A

Crystal violet

(90% dye content )

Ethanol 95%

Dung dịch B

Ammonium oxalate

Nước cất


2,0g


20,0ml
0,8g

80ml




Cách pha chế:

Trộn đều dung dịch A với dung dịch B, lọc bằng giấy lọc, bảo quản trong 24h

4.5 2. Gram’s Iodine

Thành phần:



Iodine

Postasdium iodide (KI)

Nước cất


1,0g

2,0g


300ml

Cách pha chế:

Đổ KI vào trong cối thêm iodine và nghiền bằng chầy trong 5-10 phút. Sau đó vừa nghiền vừa thêm nước. Lần thứ nhất thêm 1ml, lần thứ 2 thêm 5ml, lần thứ 3 thêm 10ml. Rót dung dịch được nghiền vào chai, rửa chầy cối bằng lượng nước còn lại và đổ vào chai.

4.5.3. Hucker’s counterstain

Thành phần:



Safranin

Ethanol 95%



2,5g

100ml


Cách pha chế:

Hoà tan 2,5g safranin vào 100ml ethanol 95%. Sau đó thêm 10ml dung dịch trên vào 90ml nước cất.



4.6. Thạch dinh dưỡng

Thành phần:



Cao thịt bò

3,0 g

Pepton

5,0 g

Thạch

15,0 g

Nước cất

1000 ml

Cách pha chế

Cho các thành phần chất khô vào nước, đun nóng và khuấy đều để hoà tan các chất. Chỉnh pH để sau khi tiệt trùng môi trường có pH là 6,8  0,2. Đóng 100ml môi trường vào các bình tam giác và 15 ml vào ống nghiệm. Hấp ướt ở 1210C trong 15 phút. Môi trường được bảo quản ở 4-100C có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng.

4.7. Thuốc thử của phản ứng catalase*

Dung dịch H2O2 3%



4.8. Thuốc thử của phản ứng oxidase*

Thành phần:



N,N,N,N,-tetramethyl- phenylenediamine. 2HCl

1,0g

Nước cất

100ml

Cách pha chế:

Hoà tan 1g N,N,N,N,-tetramethyl-phenylenediamine. 2HCl bằng 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị xong bảo quản lạnh (4-100C) trong chai thuỷ tinh mầu, sử dụng được trong vòng 7 ngày.



* Thuốc thử được pha mới trước khi tiến hành phản ứng



tải về 88.95 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2022
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương