THỊt và CÁc sản phẩm của thịt-xáC ĐỊnh tổng số bacillus cereus

10 TCN 731-2006

Hà Nội - 2006

(Meat and meat products - Enumeration of Bacillus cereus)

ngày tháng 6 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)

Qui trình này để xác định tổng số Bacillus cereus trong thịt và sản phẩm của thịt.

3.1. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh

3.1.1. Tủ lạnh

3.1.2 Tủ sấy

3.1.3. Tủ ấm

3.1.4. Máy đồng nhất mẫu (Stomacher)

3.1.5. Máy trộn tốc độ cao (Vortex)

3.1.6. Nồi hấp cách thuỷ

3.1.7. Nồi hấp áp lực

3.1.8. Đèn Bunse loại nhỏ và lớn

3.1.9. Kính hiển vi

3.1.10. Bình nuôi cấy yếm khí

3.1.11. Que cấy vòng (đường kính 3-4mm)

3.1.12. Đèn cồn

3.1.13. Dụng cụ thuỷ tinh

• 
  Bình thuỷ tinh 1000ml, 500ml và 200ml
  
• 
  Ống đong
  
• 
  Pipet các loại 25ml, 10ml, 5ml và 1ml, được chia vạch 0,5ml và 0,1ml
  
• 
  Ống nghiệm 13x100mm và 16x125mm
  
• 
  Đĩa petri tiệt trùng
  
• 
  Phiến kính soi tiêu bản
  

Chủng chuẩn Bacillus cereus

Theo TCVN 4833 - 2002

Tiến hành nuôi cấy chủng chuẩn Bacillus cereus tuần tự theo qui trình nuôi cấy mẫu để kiểm tra chất lượng môi trường và phương pháp.

- Cân 25g mẫu cho vào túi polymer chuyên dùng kèm máy stomacher, thêm 225ml dung dịch pha loãng pepton (4.1.)

- Sử dụng máy đồng nhất mẫu (stomacher) làm đồng nhất mẫu trong khoảng thời gian 2 phút. Mẫu trong túi đồng nhất có độ pha loãng là 10^-1.

- Tiếp tục pha loãng mẫu bằng dung dịch (4.1.) theo cơ số 10

- Mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa thạch MYP (4.2), mỗi đĩa 0,1ml, láng đều dung dịch mẫu trên mặt thạch. Đặt các đĩa thạch đã cấy mẫu ở 35-37⁰C trong 24h.

- Kiểm tra các đĩa thạch. Các khuẩn lạc B.cereus giả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng nhạt được bao quanh bởi một vùng kết tủa do hoạt động của men lecithinase. Một số chủng B.cereus chỉ sinh ít hoặc không sinh lecithinase sẽ không có vùng kết tủa bao quanh. Các khuẩn lạc này cũng cần được thử khẳng định. Đếm các khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp.

6.3. Khẳng định vi khuẩn

6.3.1. Đánh giá vi khuẩn học

Lấy vài khuẩn lạc nghi ngờ là B.cereus ở (6.2.) cấy chuyển vào các ống thạch dinh dưỡng nghiêng (4.6), ủ ấm ở 35-37⁰C trong 24h.

Lấy khuẩn lạc mọc trên thạch nghiêng (6.3.1) nhuộm gram và kiểm tra hình thái vi khuẩn. Quá trình nhuộm tiến hành trong vòng 3-4 phút, rồi đọc kết quả. B.cereus bắt màu tím, nên là vi khuẩn gram dương, trong vi trường chúng xếp dạng chuỗi ngắn hoặc dài.

Nha bào có hình oval, nhân ở phần đuôi nhưng không làm biến dạng thân vi khuẩn.

6.3.2. Khẳng định bằng các phản ứng sinh hoá

* Pha loãng khuẩn lạc

Lấy khuẩn lạc từ các ống thạch nghiêng (6.3.1) chuyển vào các ống nghiệm có chứa 0,5ml dung dịch pha loãng pepton (4.1), trộn đều vi khuẩn bằng máy trộn vortex. Tiếp tục cấy chuyển vào các môi trường sau để làm phản ứng sinh hoá.

Lấy đầy 1 vòng que cấy canh khuẩn (10l), cấy chuyển vào môi trường VP (4.3.1) và để ở 35⁰C trong 48 2h. Sau đó lấy 1ml canh khuẩn cho vào ống nghiệm kích thước 16x125 mm và thêm vào 0,6 ml dung dịch alpha-naphthol và 0,2 ml potasium hydroxide 40% (4.3.2). Lắc đều và thêm vào một vài tinh thể creatine (4.3.3). Để tại nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 1 giờ. Phản ứng dương tính khi có mầu hồng hoặc màu tím xuất hiện.

Lấy một khuẩn lạc điển hình và hoà vào một giọt dung dịch hydro peroxit 3% trên phiến kính. Đọc kết quả trong vòng 1 phút, khi thấy có tạo bọt khí chứng tỏ là phản ứng dương tính.

Nhỏ thuốc thử oxidase, đọc kết quả trong vòng 1 phút, nếu phản ứng dương tính khuẩn lạc biến đổi sang mầu hồng và chuyển dần sang mầu tím. Khuẩn lạc không đổi màu là phản ứng âm tính. B.cereus có phản ứng oxidase âm tính.

Lấy đầy 1 vòng que cấy canh khuẩn (10l) cấy trích sâu xuống giữa môi trường di động (4.4), đặt ống nghiệm ở 30⁰C trong 18-24h. Các vi khuẩn di động sẽ mọc lộn xộn xung quanh đường cấy. Hầu hết các chủng B.cereus và B.thuringiensis là di động, chỉ có một vài chủng B.cereus và B.anthracis là không di động.

7.1.1 Tính số lượng a của B.cereus có phản ứng dương tính với các test sinh hoá (6.3.2.) đã nhận dạng trên mỗi đĩa đã chọn

Trên mỗi đĩa, tính số lượng a các B.cereus có phản ứng dương tính với test sinh hoá (6.3.2.) đã nhận dạng, theo công thức:

trong đó

sinh hoá;

Lấy kết quả tròn số [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

7.1.2 Tính số lượng N B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2.) đã được nhận dạng có mặt trong phần mẫu thử

Đối với các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điển hình ở hai độ pha loãng liên tiếp, thì tính số lượng B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2.) đối với mỗi đĩa theo qui định trong (7.1.1) và tính số N B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2) được nhận biết có mặt trong mẫu thử, là trung bình thu được từ hai độ loãng liên tiếp, bằng công thức sau:

trong đó

(6.3.2.) đã nhận biết trên tất cả các đĩa đã chọn.

Làm tròn các kết quả đã tính đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Báo cáo kết quả theo số B.cereus có phản ứng dương tính qua test sinh hoá (6.3.2.) trong 1 gam được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10_­^x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10.

7.2 Ước tính các số lượng nhỏ

7.2.1 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm ở dạng khác), mỗi đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc đã được nhận biết thì báo cáo các kết quả như sau:

a) Đối với các sản phẩm dạng lỏng, số B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một mililit được ước tính như sau:

trong đó

b) Đối với các sản phẩm ở dạng khác, số B.cereus có phản ứng dương tính trong một gam được ước tính như sau:

trong đó

7.2.2 Nếu hai đĩa tương ứng khi cấy 0,1 ml (trường hợp chung là 0,1 ml dịch cấy) mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không chứa bất kỳ khuẩn lạc B.cereus nào có phản ứng dương tính (6.3.2.) thì báo cáo kết quả như sau ;

- Ít hơn 10 B.cereus có phản ứng d­ương tính (6.3.2.) trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng);

 Ít hơn 10/d B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là độ pha loãng của huyền phù ban đầu.

7.2.3. Nếu cấy 1 ml mẫu, thì báo cáo kết quả như­ sau:

- Ít hơn 1 B.cereus có phản ứng d­ương tính (6.3.2.) trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng);

- Ít hơn 1/d B.cereus có phản ứng dương tính (6.3.2.) trong một gam (sản phẩm dạng khác).

8. Tài liệu tham khảo

8.1. Microbiologycal method for meat industry 1991 New Zealand.

8.2. TCVN 6404: 1998 (ISO 7218: 1997) Vi sinh vật học – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật

8.3. TCVN 4833: 2002 Lấy mẫu thịt


KT. BỘ TRƯỞNG

THỨ TRƯỞNG
Bùi Bá Bổng

Phụ lục

Thành phần:

Peptone NaCl Nước cất

1,0g 8,5g 1000ml

Cách pha chế

Hoà tan các thành phần vào nước cất, điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng pH là 7,2 + 0,2. Đóng 225ml môi trường vào các bình tam giác. Hấp ướt ở 121^oC trong 15 phút. Môi trường được bảo quản ở 4-10⁰ C, sử dụng được trong 1 tháng.

4.2. Thạch mannitol- Egg Yolk- Polymyxin (MYP)

4.2.1. Môi trường cơ sở

Thành phần:

Cao thịt bò	1,0 g
Pepton từ casein	10,0 g
D-mannitol	10,0 g
NaCl	10,0 g
Phenol đỏ	0,025 g
Thạch	12 g đến 18 g a
Nước cất	900 ml
a Tuỳ thuộc vào khả năng đông của thạch.

Cho các thành phần chất khô vào nước, đun nóng và khuấy đều để hoà tan các chất. Chỉnh pH để sau khi tiệt trùng môi trường có pH là 7,20,2, rót từ 225ml đến 500 ml vào các bình tam giác. Hấp ướt ở 121⁰C trong 15 phút. Bảo quản ở 4-10⁰C môi trường có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng.

4.2.2. Thành phần bổ sung 1 (dung dịch polymixin B 0,1%)

Cách pha chế:

Hoà tan 500,000 đơn vị polymixin B sulfate nguyên chất vào 50ml nước cất. Bảo quản trong lọ thuỷ tinh dung tích 85ml ở 4⁰C.

4.2.3. Thành phần bổ sung 2 (Dung dịch lòng đỏ trứng)

Cách pha chế:

Rửa 2 quả trứng tươi bằng bàn chải cứng và làm khô. Ngâm trứng trong dung dịch cloramin 0,1% trong 1 giờ. Đổ dung dịch cloramin đi và thay bằng dung dịch Ethanol 70% ngâm trứng 30 phút. Đập trứng một cách vô trùng, gạn lấy lòng đỏ. Thêm 1 lượng nước muối 0,85 % vô trùng vào lòng đỏ trứng theo tỷ lệ 1:1, trộn đều. Bảo quản nước trứng ở 4⁰ C có thể sử dụng trong 1 tuần.

4.2.4.Môi trường hoàn chỉnh

Thêm 2,5ml polymixin B và 12,5ml dung dịch nước trứng vào 225ml dung dịch cơ sở (4.2.1) đã đun tan chảy và làm nguội đến 50⁰C. Trộn đều rót 18ml môi trường vào đĩa petri kích cỡ 15x100mm. Để môi trường ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng 24 giờ.

4.3. Môi trường và thuốc thử Voges-Proskauer (VP)

4.3.1. Môi trường VP

Thành phần:

Peptone proteose Glucose NaCl Nước cất

7,0g 5,0g 5,0g 1000ml

Cách pha chế:

Đun nóng để hoà tan các thành phần trong 1000ml nước cất, điều chỉnh để cuối cùng môi trường có pH là 6,5  0,2. Đóng 5ml môi trường vào ống nghiệm, hấp ướt 10 phút ở 121⁰ C. Môi trường được bảo quản ở 4 - 10⁰C dùng được trong 1 tháng.

4.3.2. Thuốc thử VP

Thành phần:

Dung dịch 1: a-Naphtol Cồn tuyệt đối Dung dịch 2: Potassium hydroxide Nước cất vừa đủ

5,0g 100ml 40,0g 100ml

4.3.3. Tinh thể creatine

4.4. Môi trường kiểm tra đặc tính di động

Thành phần:

Trypticase Men bia Glucose Na2HPO4 Thạch Nướt cất

10,0g 2,5 g 5,0g 2,5g 3,0g 1000ml

Cách pha chế:

Cho các thành phần vào nước đun sôi để hoà tan tất cả các chất, điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng pH là 7,4 + 0,2. Đóng môi trường vào các bình tam giác 100-170ml, hấp ướt ở 121^oC trong 15 phút. Để nguội đến 50^oC, chia 2ml môi trường vào các ống nghiệm có kích cỡ 13 x100 mm. Bảo quản môi trường ở nhiệt độ phòng 2 ngày trước khi sử dụng.

4.5. Thuốc nhuộm gram

4.5.1. Hucker’s Crystal violet

Thành phần:

Dung dịch A Crystal violet (90% dye content ) Ethanol 95% Dung dịch B Ammonium oxalate Nước cất

2,0g 20,0ml 0,8g 80ml

Cách pha chế:

Trộn đều dung dịch A với dung dịch B, lọc bằng giấy lọc, bảo quản trong 24h

4.5 2. Gram’s Iodine

Thành phần:

Iodine Postasdium iodide (KI) Nước cất

1,0g 2,0g 300ml

Cách pha chế:

Đổ KI vào trong cối thêm iodine và nghiền bằng chầy trong 5-10 phút. Sau đó vừa nghiền vừa thêm nước. Lần thứ nhất thêm 1ml, lần thứ 2 thêm 5ml, lần thứ 3 thêm 10ml. Rót dung dịch được nghiền vào chai, rửa chầy cối bằng lượng nước còn lại và đổ vào chai.

4.5.3. Hucker’s counterstain

Thành phần:

Safranin Ethanol 95%

2,5g 100ml

Cách pha chế:

Hoà tan 2,5g safranin vào 100ml ethanol 95%. Sau đó thêm 10ml dung dịch trên vào 90ml nước cất.

4.6. Thạch dinh dưỡng

Thành phần:

Cao thịt bò	3,0 g
Pepton	5,0 g
Thạch	15,0 g
Nước cất	1000 ml

Cách pha chế

Cho các thành phần chất khô vào nước, đun nóng và khuấy đều để hoà tan các chất. Chỉnh pH để sau khi tiệt trùng môi trường có pH là 6,8  0,2. Đóng 100ml môi trường vào các bình tam giác và 15 ml vào ống nghiệm. Hấp ướt ở 121⁰C trong 15 phút. Môi trường được bảo quản ở 4-10⁰C có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng.

4.7. Thuốc thử của phản ứng catalase*

Dung dịch H₂O₂ 3%

4.8. Thuốc thử của phản ứng oxidase*

Thành phần:

N,N,N,N,-tetramethyl- phenylenediamine. 2HCl	1,0g
Nước cất	100ml

Cách pha chế:

Hoà tan 1g N,N,N^,N^,-tetramethyl-phenylenediamine. 2HCl bằng 100ml nước cất. Dung dịch chuẩn bị xong bảo quản lạnh (4-10⁰C) trong chai thuỷ tinh mầu, sử dụng được trong vòng 7 ngày.

* Thuốc thử được pha mới trước khi tiến hành phản ứng

Каталог: Documents -> Uploads
Uploads -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 8108 : 2009 iso 11285 : 2004
Uploads -> Qcvn 01 -124: 2013/bnnptnt
Uploads -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 5624-1 : 2009
Uploads -> Quy ph¹m kh¶o nghiÖm hiÖu lùc thuèc b¶o vÖ thùc vËt
Uploads -> Tiªu chuÈn ngµnh
Uploads -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 6134 : 2009
Uploads -> TIÊu chuẩn việt nam tcvn 7305-2 : 2008 iso 4427-2 : 2007
Uploads -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 7937-2: 2013 iso 15630-2: 2010
Uploads -> TIÊu chuẩn quốc gia tcvn 7937-1: 2013 iso 15630-1: 2010
Uploads -> Tiªu chuÈn c¬ ®iÖn n ng nghiÖp tcvn 6817: 2001

tải về 88.95 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: