Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao


Tạo panel kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR



tải về 0.66 Mb.
trang8/9
Chuyển đổi dữ liệu26.08.2017
Kích0.66 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

3.1.2.2. Tạo panel kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR

Panel kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng rất quan trọng. Nó đánh giá khả năng phát hiện DNA lao của phản ứng mPCR, từ đó sẽ biết được phản ứng mPCR có thể phát hiện khi mẫu bệnh phẩm có tối thiểu bao nhiêu vi khuẩn lao. Panel được pha từ 27 mẫu DNA tách từ các chủng Mycobacterium tuberculosis complex từ ba miền Bắc, Trung, Nam.



Chúng tôi tiến hành trộn lẫn DNA của 27 chủng này lại, kí hiệu là NA1. Từ NA1 pha NB1 theo tỷ lệ = 90% NA1+10% H20, từ NB1 pha NC1 theo tỷ lệ = 90% NB1 + 10% H20. Sau đó các mẫu NA1, NB1, NC1 được kiểm tra lại nồng độ, độ tinh sạch và tiến hành pha loãng và kí hiệu theo bộ panel từ N1 đến N51. Tỷ lệ pha loãng từ 2-1 đến 2-17 theo bảng 3.5. Panel này có dải nồng độ từ N1 (21,7 ng/µl) đến N51 (0,000273 ng/µl).


Stt


Mã số gốc




Mã số bộ panel

Nồng độ ng/ul

Mã số gốc

Mã số bộ panel

Nồng độ ng/ul

Mã số gốc

Mã số bộ panel

Nồng độ ng/ul

1

NA1




N1

21.7

NB1

N2

19.8

NC1

N3

17.9

2

NA2




N4

10.8331

NB2

N5

9.9

NC2

N6

8.95

3

NA3




N7

5.41655

NB3

N8

4.95

NC3

N9

4.475

4

NA4




N10

2.708275

NB4

N11

2.475

NC4

N12

2.2375

5

NA5




N13

1.354138

NB5

N14

1.2375

NC5

N15

1.11875

6

NA6




N16

0.677069

NB6

N17

0.61875

NC6

N18

0.559375

7

NA7




N19

0.338534

NB7

N20

0.309375

NC7

N21

0.279688

8

NA8




N22

0.169267

NB8

N23

0.154688

NC8

N24

0.139844

9

NA9




N25

0.084634

NB9

N26

0.077344

NC9

N27

0.069922

10

NA10




N28

0.042317

NB10

N29

0.038672

NC10

N30

0.034961

11

NA11




N31

0.021158

NB11

N32

0.019336

NC11

N33

0.01748

12

NA12




N34

0.010579

NB12

N35

0.009668

NC12

N36

0.00874

13

NA13




N37

0.00529

NB13

N38

0.004834

NC13

N39

0.00437

14

NA14




N40

0.002645

NB14

N41

0.002417

NC14

N42

0.002185

15

NA15




N43

0.001322

NB15

N44

0.001208

NC15

N45

0.001093

16

NA16




N46

0.000661

NB16

N47

0.000604

NC16

N48

0.000546

17

NA17




N49

0.000331

NB17

N50

0.000302

NC17

N51

0.000273
Bảng 3.5 Panel kiểm tra ngưỡng phát hiện của kit multiplex PCR

      1. Kết quả tối ưu qui trình multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA

3.1.3.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Việc tối ưu qui trình multiplex PCR gặp nhiều khó khăn do sự có mặt của nhiều căp mồi trong một phản ứng làm tăng xác suất thu được những sản phẩm khuếch đại không mong muốn, các dimer mồi, các sản phẩm không đặc hiệu này có thể được khuếch đại một cách hiệu quả hơn so với gen đích do đó làm tiêu hao các thành phần phản ứng, làm ảnh hưởng đến giai đoạn gắn mồi và kéo dài, làm giảm độ nhậy và độ đặc hiệu của phản ứng. Do đó tối ưu hóa multiplex PCR thường nhằm vào việc làm giảm thiểu những tương tác lẫn nhau giữa các cặp mồi, giảm bớt những bắt cặp không hoàn toàn dẫn tới những sản phẩm không đặc hiệu. Nhiệt độ gắn mồi là thông số rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả của phản ứng multiplex PCR. Chúng tôi sử dụng panel mẫu là DNA của vi khuẩn lao để tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR với ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA. Các cặp mồi được thiết kế đều có chiều dài 20 bp và tỷ lệ G-C khá tương đồng, do đó nhiệt độ gắn mồi của chúng không khác biệt nhiều. Để tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR sử dụng cả 3 cặp mồi khuếch đại 3 gen đích, chúng tôi dựa trên kết quả tính toán lý thuyết về nhiệt độ gắn mồi của từng cặp khi thiết kế theo công thức Tm = 2oC x (A+T) + 4oC x (G+C). Tuy nhiên nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi từ 3oC đến 5oC. Chúng tôi sử dụng chương trình gradient nhiệt của máy PCR iCycler và chọn khoảng nhiệt độ gắn mồi từ 52 - 58oC, máy đưa ra dải phổ nhiệt lần lượt là: 52oC - 53,1oC - 54,4oC - 56oC - 58oC. Chuẩn bị 5 phản ứng multiplex PCR giống hệt nhau về thành phần, chạy đồng thời trong cùng một điều kiện, chỉ khác nhau về nhiệt độ gắn mồi. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR được tóm tắt trên bảng sau:



Bảng 3.6. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng multiplex PCR


Nhiệt độ

Gen đích




52oC

53,1oC

54,4oC

56oC

58oC

IS6110, IS1081 và 23S rDNA

++

++

++

+++

+

(+): kết quả điện di băng có kích thước mảnh và mờ

(++): kết quả điện di băng có kích thước lớn nhưng mờ hoặc rõ nhưng nhỏ

(+++): kết quả điện di băng có kích thước lớn và rõ nét


M 1 2 3 4 5



M: marker 1 kb

1: 52o C

2: 53,1o C

3: 54,4o C

4: 56o C

5: 58o C

500
250

bp


Hình 3.1. Ảnh điện di gradient nhiệt độ cho phản ứng multiplex PCR

Dựa vào kết quả điện di chúng tôi nhận thấy ở các điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 52oC đến 54,4oC ngoài sự xuất hiện các băng DNA đặc hiệu còn có thêm các băng không đặc hiệu nhỏ và mờ, Ở nhiệt độ gắn mồi 58oC sản phẩm chỉ xuất hiện 1 băng đặc hiệu cho đoạn gen đích IS1081. Ở điều kiện nhiệt độ 56oC, sản phẩm cho các băng có độ đặc hiệu cao và rõ nét do đó chúng tôi chọn điều kiện nhiệt độ này cho các lần chạy sau.



3.1.3.2. Kết quả tối ưu thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi

Sau khi chọn được nhiệt độ gắn mồi thích hợp là 56oC, chúng tôi tiến hành chạy multiplex PCR với thời gian gắn mồi lần lượt là 30s – 45s– 60s– 90s trên một panel mẫu tương tự với 4 phản ứng multiplex PCR giống hệt nhau, chỉ khác về thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi.



B
Thời gian
ảng 3.7. Kết quả tối ưu thời gian gắn mồi trong phản ứng multiplex PCR



Gen đích



30s

45s

60s

90s

IS6110, IS1081 và 23S rDNA

++

+++

++

+


1 2 3 4

M: marker 1 kb

1: 30 giây

2: 45 giây

3: 60 giây

4: 90 giây

500

250

bp


Hình 3.2. Ảnh điện di gradient thời gian của phản ứng multiplex PCR

Kết quả cho thấy xuất hiện các băng đặc hiệu ở cả 4 mức thời gian nhưng rõ nhất ở 30 giây và 45 giây. Ở mức thời gian 45 giây không xuất hiện band phụ. Do vậy, chúng tôi chọn thời gian gắn mồi là 45 giây cho các lần chạy sau.



3.1.3.3. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 và nồng độ dNTP

Trong phản ứng multiplex PCR cần phải điều chỉnh nồng độ của các thành phần phản ứng đặc biệt là Mg2+ và dNTP. Để tối ưu nồng độ dNTP chúng tôi giữ nồng độ MgCl2 cố định là 3 mM và chọn dải nồng độ dNTP từ 0,05 – 0,1 – 0,25 – 0,4 – 0,8 và 1 mM. Kết quả điện di cho thấy ở nồng độ dNTPs là 0,25 mM cho băng rõ nét nhất.

Để kiểm tối ưu nồng độ của MgCl2 trong phản ứng multiplex PCR, chúng tôi sử dụng nồng độ dNTPs là 0,25 mM và chọn dải nồng độ MgCl2 từ 1,5 – 2 – 2,5 – 3 – 3,5 mM. Kết quả điện di cho thấy ở nồng độ MgCl2 ở 2,5 mM thu được sản phẩm PCR đặc hiệu và rõ nét.

Bảng 3.8. Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 trong phản ứng multiplex PCR



Gen đích

Nồng độ



1,5 mM

2 mM

2,5 mM

3 mM

3,5 mM

IS6110, IS1081 và 23S rDNA

+

++

+++

++

++


M 1 2 3 4 5

M: marker 1 kb

1: 1,5 mM

2: 2 mM

3: 2,5 mM

4: 3 mM

5: 3,5 mM


500

250

bp


Hình 3.3. Ảnh điện di gradient nồng độ MgCl2 phản ứng multiplex PCR

Trong phản ứng PCR, nồng độ dNTPs và MgCl2 có mối tương quan chặt chẽ với nhau. Khi nồng độ MgCl2 ít, các ion Mg2+ sẽ liên kết ưu tiên vào dNTP và DNA, taq DNA polymerase sẽ không có hoặc có ít Mg2+ để xúc tác cho quá trình hoạt hóa. Khi tăng nồng độ MgCl2, các ion Mg2+ sẽ xúc tác cho Taq polymerase. Điều này giải thích tại sao khi tăng nồng độ dNTPs có thể gây ức chế phản ứng PCR một cách nhanh chóng, trong khi tăng nồng độ Mg2+ thường đạt kết quả tốt.

Như vậy chúng tôi chọn nồng độ dNTP ở mức 0,25mM và nồng độ MgCl2 ở mức 2,5 mM cho các lần chạy tiếp theo.

3.1.3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng multiplex PCR

Chúng tôi tiến hành chạy gradient nồng độ của từng cặp mồi. Đối với IS1081 chúng tôi chạy với dải nồng độ lần lượt là 0,2 μM – 0,4 μM – 0,6 μM – 0,8 μM – 1 μM – 1,2 μM, trong khi đó nồng độ IS6110 và 23S rDNA được giữ cố định ở 0,4 μM. Chuẩn bị 6 phản ứng multiplex PCR giống hệt nhau chỉ khác nhau về nồng độ mồi IS1081.


M 1 2 3 4 5 6

500

250

bp

M 1 2 3 4 5 6

M: marker 1 kb

1: 0,2 μM

2: 0,4 μM

3: 0,6 μM

4: 0,8 μM

5: 1 μM

6: 1,2 μM

500

250


Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả multiplex PCR với gradient nồng độ mồi IS1081

Dựa vào kết quả điện di chúng tôi thấy rằng ở tất cả các dải nồng độ của IS1081 đều xuất hiện cả 3 băng đặc hiệu cho 3 gen đích, tuy nhiên ở nồng độ 0,6μM các băng thu được rõ nét nhất. Do vậy chúng tôi chọn nồng độ 0,6μM đối với cặp mồi IS1081 cho những lần chạy sau.

Thực hiện tương tự đối với mồi IS6110 chúng tôi cũng thu được các băng đặc hiệu của 3 gen đích ở tất cả các nồng độ, tuy nhiên ở các mức nồng độ từ 0,6 - 1μM xuất hiện nhiều band không đặc hiệu. Để đảm bảo cho sự khuếch đại của cả 3 gen đích với chất lượng tốt nhất chúng tôi chọn nồng độ mồi IS6110 là 0,4 μM cho những lần chạy tiếp theo.


M: marker 1 kb

1: 0,1 μM

2: 0,2 μM

3: 0,4 μM

4: 0,6 μM

5: 0,8 μM

6: 1 μM


Hình 3.5. Ảnh điện di kết quả multiplex PCR với gradient nồng độ mồi IS6110

Tương tự với cặp mồi 23S rDNA chúng tôi thu được kết quả như sau:




M: marker 1 kb

1: 0,1 μM

2: 0,2 μM

3: 0,4 μM

4: 0,6 μM

5: 0,8 μM

6: 1 μM


Hình 3.6. Ảnh điện di kết quả multiplex PCR với gradient nồng độ mồi 23S rDNA

Đối với 23S rDNA ở vị trí nồng độ mồi là 0,4 μM rõ nét và đặc hiệu hơn so với các nồng độ khác, ở nồng độ mồi 23S rDNA càng cao thì số lượng các băng sản phẩm không đặc hiệu càng nhiều. Do vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ cho 23S rDNA là 0,4 μM.

Hiệu quả khuếch đại đặc hiệu phụ thuộc vào tỷ lệ các mồi gắn với gen đích. Tuy nhiên nếu mồi thiết kế không tốt, nhiệt độ gắn mồi và các thành phần đệm dưới mức tối ưu sẽ làm giảm tỷ lệ gắn mồi. Tỷ lệ kéo dài các mồi đặc hiệu phụ thuộc vào hoạt tính enzyme, các thành phần cần thiết như dNTPs và bản chất DNA đích, do đó để tăng hiệu quả của phản ứng PCR đều nhằm vào các yếu tố gắn mồi đặc hiệu và tốc độ kéo dài.

3.1.3.5. Các yếu tố PCR khác

Bên cạnh việc tối ưu hóa các thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng multiplex PCR, nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng một số phụ gia PCR khác nhằm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng như Dimethyl sulfoxide, Glycerol, Bovine serum albumin hoặc Betaine đã được công bố là có lợi trong multiplex PCR. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chất phụ gia Betain để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR. Thành phần này hoạt động làm ngăn cản sự hình thành các cấu trúc bậc hai bên trong phân tử DNA khuôn trong quá trình kéo dài chuỗi do đó quá trình kéo dài DNA không bị gián đoạn. Betain cũng có thể hoạt động như những chất làm mất ổn định, giảm nhiệt độ nóng chảy của trình tự giàu G - C do đó các sản phẩm PCR thu được sẽ tốt hơn.



3.1.3.6. Qui trình multiplex PCR chẩn đoán lao sử dụng 3 cặp mồi khuếch đại 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA

Qui trình phản ứng multiplex PCR cho cả 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA được chúng tôi nghiên cứu và đề xuất ứng dụng như sau:



Bảng 3.9. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng multiplex PCR

Bước

Phản ứng

Nhiệt độ(oC)

Thời gian

Chu kì

1

Biến tính chung

95

5 phút

1

2

Biến tính

94

1 phút

35

3

Gắn mồi

56

45 giây

4

Kéo dài chuỗi

72

1 phút 10 giây

5

Hoàn tất kéo dài

72

10 phút

1

6

Kết thúc phản ứng

4








Bảng 3.10. Thành phần cho một phản ứng multiplex PCR

STT

Thành phần

Nồng độ

Thể tích (µl)

1

Taq buffer

1X

3,25

2

dNTPs (2,5 mM)

2,5 mM

2,5

3

MgCl2 25 mM

2,5 mM

2

4

Primer 23S-F(10 pmoles/µl)

0,4 µM

1

Primer 23S-R (10 pmoles/µl)

0,4 µM

1

5

Primer IS6110-F (10 pmoles/µl)

0,4 µM

1

Primer IS6110-R (10 pmoles/µl)

0,4 µM

1

6


Primer IS1081-F (10 pmoles/µl)

0,6 µM

1,5

Primer IS1081-R (10 pmoles/µl)

0,6 µM

1,5

7

Template (50 ng/µl)

150 ng

3

8

Dream Taq DNA Polymerasse (5u/µl)

1,25 unit

0,25

9

H2O




2

10

Chất phụ gia




5

Tổng

25


M: marker 1kb

1-6: Sản phẩm multiplex PCR các mẫu DNA vi khuẩn lao.


Hình 3.7. Ảnh điện di 3 gen đích với quy trình multiplex PCR đã được tối ưu

3.1.4. Tạo master mix

Sau khi tối ưu qui trình của phản ứng multiplex PCR chúng tôi tiến hành tạo master mix theo thành phần đã được chuẩn hóa. Bước đầu chúng tôi tạo 20 master mix và kiểm tra trên DNA của chủng vi khuẩn lao. Kết quả cả 20 master mix đều cho các band đặc hiệu với 3 gen đích IS6110, IS1081, 23S rDNA. Với kết quả như vậy chúng tôi tiến hành tạo 200 master mix bảo quản ở -20oC để thực hiện việc kiểm tra đánh giá hiệu quả của kit và của phản ứng multiplex PCR.



    1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KIT MULTIPLEX PCR

      1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của kit mPCR trên panel mẫu

        1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu

Sau khi tối ưu qui trình phản ứng multiplex PCR với ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA chúng tôi tiến hành tạo master mix để kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của kit multiplex PCR trên panel mẫu gồm 50 mẫu DNA của các chủng Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC – vi khuẩn lao) và 50 mẫu DNA của các chủng Mycobacteria other than tuberculosis (MOTT – không phải vi khuẩn lao) đã được chuẩn bị sẵn. Các mẫu DNA trong panel nhạy và panel đặc hiệu đươc mã hóa từ DNA-TB01 đến DNA-TB100. Kết quả phát hiện các band đặc trưng cho các gen đích như sau:


bp


416

300

206

M: marker 100 bp

1-10: Sản phẩm multiplex PCR các mẫu DNA vi khuẩn laoMTBC.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M


Hình 3.8. Kết quả kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR trên panel độ nhạy (chủng MTBC)


bp




416

300

206
Khi kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR trên panel nhạy cho thấy tất cả các mẫu đều cho ba band đặc trưng cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDN.


M: marker 100 bp

1-10: DNA chủng MOTT

11: DNA chủng MTBC

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M


Hình 3.9. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của kit multiplex PCR trên panel độ đặc hiệu (chủng MOTT)

Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của kit multiplex PCR trên panel đặc hiệu cho thấy các mẫu đều không có phản ứng chéo (không có band đặc trưng nào cho ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA). Mẫu đối chứng số 11 sử dụng DNA của MTBC vẫn cho 3 band của IS6110, IS1081 và 23S rDNA.



Bảng 3.11. Kết quả phát hiện ở các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA

Panel mẫu

Kết quả

phát hiện gen đích

50 mẫu DNA của panel nhạy

50 mẫu DNA của panel đặc hiệu

Tổng kết quả phát hiện gen đích

IS6110

+

50

0

50

-

0

50

0

IS1081

+

50

0

50

-

0

50

0

23S rDNA

+

50

0

50

-

0

50

0

Kết quả thống kê ở bảng 3.11 cho thấy tất cả 50 mẫu DNA của panel nhạy đều xuất hiện 3 band đặc hiệu cho các gen đích là IS6110, IS1081 và 23S rDNA. Độ nhạy của kit mPCR đối với từng gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA được tính theo công thức sau:

Se (IS6110) = 50/ (50 + 0) x 100% = 100%

Se (IS1081) = 50/ (50 + 0) x 100% = 100%

Se (23S rDNA) = 50/ (50 + 0) x 100% = 100%

Kết quả ở 50 mẫu DNA của panel độ đặc hiệu không có dương tính giả (không xuất hiện band tương ứng với các gen đích của panel độ nhạy). Như vậy độ đặc hiệu của kit multiplex PCR đối với từng gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA được tính theo công thức sau:

Sp (IS6110) = 50/ (50 + 0) x 100% = 100%

Sp (IS1081) = 50/ (50 + 0) x 100% = 100%

Sp (23S rDNA) = 50/ (50 + 0) x 100% = 100%

Kết quả đánh giá trên panel cho thấy ba mồi IS6110, IS1081 và 23S rDNA được thiết kế sử dụng trong kit mPCR này đều đạt độ nhạy và độ đặc hiệu là 100%. Tổng hợp kết quả kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của kit multiplex PCR trên panel được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của kit multiplex PCR trên panel mẫu

Panel mẫu

Kết quả

Multiplex PCR


50 mẫu DNA nhạy

50 mẫu DNA đặc hiệu

Tổng số

+

50

0

50

-

0

50

50

Tổng số

50

50

100

Độ nhạy của kit multiplex PCR được tính theo công thức sau:

Độ nhạy (Se) = 50/(50 + 0) 100% =100%

Độ đặc hiệu (Sp) = 50/(50 + 0) 100% = 100%

Như vậy độ nhạy và độ đặc hiệu của kit multiplex PCR đạt 100% khi kiểm tra trên panel gồm 50 mẫu DNA của chủng vi khuẩn lao Mycobacteria tuberculosis complex và 50 mẫu DNA của chủng MOTT. Kết quả kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của kit multiplex PCR với ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA này cũng phù hợp với kết quả của một số tác giả trên thế giới như A.S. Mustafa và cộng sự (1999) khi kiểm tra độ đặc hiệu của kit multiplex PCR trên panel với gen đích IS6110 và IS1081[54].



        1. Đánh giá ngưỡng phát hiện của kit multiplex PCR trên panel mẫu vi khuẩn lao

Để kiểm tra đánh giá ngưỡng phát hiện của kit multiplex PCR chúng tôi tiến hành kiểm tra trên panel mẫu được chuẩn bị sẵn. Panel gồm 51 tube DNA được pha loãng có nồng độ từ N1 (21,7 ng/µl) đến N51 (0,000273 ng/µl).


N1 10 20 30 40 46 47 48 49 50 51 M



M: marker 100 bp

N1-N51: Sản phẩm mPCR

bp


416

300

206



Hình 3.10: Kiểm tra ngưỡng phát hiện của kit multiplex PCR

Dựa vào kết quả điện di chúng tôi thấy ở các mẫu N1 đến N30 sản phẩm mPCR xuất hiện cả 3 band đặc hiệu cho 3 gen đích IS1081, IS6110, 23S rDNA. Từ mẫu N40 đến mẫu N50 các band có giảm dần độ sắc nét, band đặc trưng cho gen 23S rDNA mờ khó quan sát được. Đến mẫu N51 không xuất hiện các band đặc hiệu nữa. Như vậy với nồng độ DNA ở mẫu N50 đạt 0,000302 ng/µl, tương đương 30,2 fg/µl kit multiplex PCR vẫn còn khả năng nhận ra DNA của M. tuberculosis. Vì vậy nồng độ DNA 30,2 fg/µl có thể coi là ngưỡng phát hiện của kit multiplex PCR. Theo tác giả Mishra A. và cộng sự (2005) nồng độ DNA là 10fg tương ứng với 1 tế bào vi khuẩn lao [52]. Như vậy kết quả này tương đương với khoảng 3 vi khuẩn lao có trong mẫu xét nghiệm. Như vậy với mức DNA ≥ 0,000302 ng/µl hay với mẫu bệnh phẩm có ít nhất từ 3 vi khuẩn lao kit multiplex PCR có khả năng phát hiện.

Kết quả nghiên cứu này tương tự như kết quả của một số tác giả trên thế giới. Tác giả Sjobring và cộng sự cho thấy rằng DNA tách chiết bằng các quy trình tách chiết của tác giả từ số lượng ít hơn 10 tế bào Mycobacteria cũng có thể phát hiện được bằng kỹ thuật PCR [64]. Như vậy khả năng phát hiện của master mix tương đối cao, với khả năng phát hiện vi khuẩn khi trong mẫu bệnh phẩm có ít hơn 10 tế bào M. tuberculosis. Theo tác giả Lazraq và cộng sự khi nghiên cứu đánh giá hiệu quả chẩn đoán phát hiện M. tuberculosis complex so với các phương pháp soi trực tiếp và nuôi cấy trên 102 mẫu đờm và 41 mẫu bệnh phẩm ngoài phổi đã đạt được độ nhậy 93,1% [46]. Tác giả Andersen và cộng sự (1993) đã kết hợp hai trình tự chèn IS6110 và IS 986 để chẩn đoán phát hiện M. tuberculosis đã đạt được giới hạn phát hiện là 0,05 pg đến 0,5pg DNA tinh sạch của vi khuẩn lao tương ứng với 10 đến 100 vi khuẩn [19].

Ngoài kết quả kiểm tra ngưỡng phát hiện trên, chúng tôi đã tiến hành gửi panel đặc hiệu và panel ngưỡng phát hiện đã được mã hóa đến Viện Kiểm Định Quốc Gia Vắcxin và Sinh Phẩm y tế Bộ y tế Việt Nam. Để kiểm tra lần nữa kết quả ngưỡng phát hiện của bộ panel chúng tôi phiên tạo tiếp ba mẫu DNA là N49 (0,000331ng/µl) thành N52 (0,000165ng/µl) , N50 (0,000302ng/µl) thành N53 (0,000151ng/µl), N51 (0,000273ng/µl) thành N54 (0,000137ng/µl). Như vậy bộ panel ngưỡng phát hiện mới gồm có 54 mẫu. Panel này cũng được sử dụng để kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR. Kết quả của Viện Kiểm định sau khi kiểm tra và tiến hành mở mã thu được kết quả như sau:

Độ đặc hiệu: (50/50) x 100% = 100%

Độ nhạy: (52/54) x 100% = 96% với ngưỡng phát hiện là (0,000165ng/µl), tương đương 16,5 fg/µl.



Dưới đây là kết quả kiểm định của Viện kiểm định quốc gia đối với kit mPCR chẩn đoán lao do chúng tôi sản xuất.



      1. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của kit mPCR trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng

Sau khi kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của mPCR trên các panel mẫu từ chủng vi khuẩn lao MTBC và MOTT, chúng tôi tiến hành áp dụng trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi lao. Tổng số gồm 100 mẫu bệnh phẩm được thu thập tại Bệnh viện Quân y 103. Các mẫu bệnh phẩm này được tiến hành chẩn đoán độc lập bằng 3 phương pháp là soi AFB, nuôi cấy BK và multiplex PCR.

Bảng 3.13. Kết quả chẩn đoán của các phương pháp trên bệnh phẩm lâm sàng

Stt

Loại bệnh phẩm

Số lượng

AFB

Nuôi cấy BK

Multiplex PCR

Âm tính

Dương tính

Âm tính

Dương tính

Âm tính

Dương tính

1

Dịch màng phổi

14

12

2

8

6

8

6

2

Đờm

32

19

13

15

17

6

26

3

Dịch phế quản

51

42

9

43

8

39

12

4

Sinh thiết hạch

2

2

0

0

2

0

2

5

Sinh thiết phế quản

1

1

0

0

1

1

0

Tổng số

100

76

24

66

34

54

46

Bảng 3.14: So sánh kết quả giữa nuôi cấy, mPCR và soi AFB

Phương pháp

Kết quả

Nuôi cấy

mPCR

AFB

+

34

46

24

-

66

54

76

Tổng

100

100

100

So sánh kết quả phát hiện lao của 3 phương pháp cho thấy kết quả phát hiện của mPCR là cao nhất, đạt 46%. Phương pháp nuôi cấy có tỷ lệ phát hiện là 34%. Soi AFB chỉ phát hiện được 24% do phương pháp này chỉ phát hiện ra vi khuẩn lao khi số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/ml bệnh phẩm.

Bảng 3.15: So sánh độ phù hợp chẩn đoán giữa phương pháp multiplex PCR và phương pháp nuôi cấy

Kết quả

Nuôi cấy

Tổng số

+

-

m PCR

+

33

13

46

-

1

53

54

Tổng số

34

66

100

Chúng tôi tính được độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán của kit mPCR trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Việc sử dụng phần mềm Epi-Info 6.0 cho phép tính hệ số K nhằm đánh giá độ phù hợp chẩn đoán của phương pháp mPCR với nuôi cấy, qua đó đánh giá khả năng áp dụng mPCR trong chẩn đoán lâm sàng.

Se = 33/ (33 + 1) x 100% = 97,05%

Sp = 53/ (53 + 13) x 100% = 80,30%

Hệ số K = 0,71

Như vậy, nếu coi nuôi cấy là tiêu chuẩn vàng thì độ nhậy của kit MTB PCR đạt 97,05 %, độ đặc hiệu đạt 80,30% so với nuôi cấy. Trên thực tế nhiều trường hợp có triệu chứng lao rõ nhưng nuôi cấy vẫn âm tính có thể do lượng vi khuẩn có ít trong bệnh phẩm, một số bị ức chế trong quá trình xử lý bệnh phẩm, số khác do quá trình nuôi cấy bị nhiễm tạp khuẩn, tạp nấm nên không phát hiện được vi khuẩn lao khiến cho độ nhạy của nuôi cấy không phải là tuyệt đối, kết quả âm tính của nuôi cấy không loại trừ được khả năng nhiễm lao. Vì vậy cho đến nay chưa có phương pháp nào thật sự được coi là “chuẩn vàng” trong chẩn đoán lao. Trong khi đó PCR với nguyên lý khuyếch đại gen có khả năng khuyếch đại hàng triệu lần một đoạn gen đích có trong bệnh phẩm, không phụ thuộc vào việc vi khuẩn còn sống hay đã chết trong quá trình xử lý bệnh phẩm. Như vậy về mặt lý thuyết PCR có độ nhậy cao hơn so với nuôi cấy, nên sẽ có những trường hợp nuôi cấy âm tính nhưng PCR cho kết qủa dương tính. Vì vậy khi lấy nuôi cấy làm tiêu chuẩn vàng tức là mặc nhiên công nhận kết quả âm tính của nuôi cấy là âm tính thật khiến cho độ đặc hiệu của PCR giảm xuống. Đây là một khó khăn khi đánh giá một phương pháp chẩn đoán mới trên lâm sàng trong điều kiện chưa có phương pháp chuẩn. Vì vậy độ nhậy và đặc hiệu trong trường hợp này chưa phản ánh thực chất của kit mPCR mà cần phải đánh giá trên panel mẫu và có thể so sánh thêm với một kit chẩn đoán thương mại đã được cơ quan chuyên môn có thẩm quyền kiểm định (có chứng chỉ IVD dùng cho chẩn đoán) và sử dụng rộng rãi.



      1. Kiểm tra độ ổn định của kit multiplex PCR

Để hoàn thiện bộ kit multiplex PCR chẩn đoán vi khuẩn lao chúng tôi tiến hành kiểm tra độ ổn định của kit ở điều kiện bảo quản – 200C. Để lấy mẫu chuẩn so sánh và kiểm tra chất lượng kit mPCR, chúng tôi tiến hành phản ứng multiplex PCR lần đầu tiên ngay sau khi tạo master mix và DNA template vừa được tách chiết từ vi khuẩn lao. Kết quả cho thấy chất lượng master mix và DNA đảm bảo để sử dụng cho kiểm tra độ ổn định.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M



1-10: Sản phẩm mPCR của DNA chủng lao

M: Marker 100 bp

bp


416

300

206


Hình 3.11: Sản phẩm mPCR DNA chủng vi khuẩn lao ngay sau khi tạo master mix

Sau đó chúng tôi tạo 120 master mix và chia thành 12 nhóm, mỗi nhóm gồm 10 master mix, đánh số thứ tự 12 nhóm thành 12 tháng tương ứng, bảo quản ở -200C, mỗi tháng lấy ra 1 nhóm master mix để kiểm tra. DNA template được chúng tôi sử dụng là 10 mẫu DNA của chủng lao được chia nhỏ mỗi mẫu thành 12 tubes, đánh số thứ tự từ tháng 1 đến tháng 12, đem bảo quản ở - 200C để dùng trong quá trình kiểm tra độ ổn định để tránh hiện tượng rã đông nhiều lần. Các mẫu DNA đã được lựa chọn đảm bảo dương tính và chạy thử nghiệm đều cho 3 band đặc hiệu cho 3 gen đích IS1081, IS6110, 23S rDNA.. Chúng tôi thực hiện việc kiểm tra định kì hàng tháng.

Ở tháng 1, tháng 2 và tháng thứ 3 chúng tôi nhận thấy chất lượng của master mix hầu như không thay đổi so với lần kiểm tra đầu tiên.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M



1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính ổn định sau 3 tháng

M: Marker 100 bp


bp


416

300

206


Hình 3.12. Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau 3 tháng bảo quản ở -20oC


bp


416

300

206
tháng thứ 6 sản phẩm điện di của master mix vẫn cho 3 band đặc trưng cho 3 gen đích rõ nét.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M



1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính ổn định sau 6 tháng

M:Marker 100 bp


Hình 3.13. Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau 6 tháng bảo quản ở -20oC

Ở tháng thứ 7, sản phẩm của master mix sau khi điện di có giảm độ sắc nét hơn so với khi kiểm tra ở tháng thư 6. Tuy nhiên sự khác biệt này không quá rõ ràng. Từ mẫu số 1 đến mẫu số 10 vẫn nhìn rõ cả ba band đặc trưng cho ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA.

Chúng tôi kiểm tra chất lượng master mix ở tháng thứ 8 và thu được kết quả sau khi điện di như sau:


1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính ổn định sau 8 tháng

M: Marker 100 bp

bp
416

300

206

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M


Hình 3.14. Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau 8 tháng bảo quản ở -200C

Như vậy các mẫu đã giảm độ sắc nét đồng đều từ mẫu số 1 đến mẫu số 10. Tuy nhiên vẫn còn có khả năng quan sát các được các band đặc hiệu cho ba gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA.

K
1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính ổn định sau 9 tháng

M: Marker 100 bp
iểm tra tiếp master mix ở tháng thứ 9 thu được kết quả như hình sau:


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M



bp

416

300

206


Hình 3.16: Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau 9 tháng bảo quản ở -20oC

Dựa vào kết quả điện di chúng tôi nhận xét rằng master mix khi bảo quản ở - 20oC sau 9 tháng đã giảm hiệu quả chẩn đoán. Các band đặc trưng của IS6110, IS1081 vẫn quan sát thấy. Band của gen đích 23S rDNA mờ, khó quan sát.



KẾT LUẬN

  1. Tạo thành công bộ kit multiplex PCR chẩn đoán vi khuẩn lao với 3 gen đích IS1081, IS6110, 23S rDNA.

  2. Hiệu quả của kit multiplex PCR chẩn đoán vi khuẩn lao

  • Độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR trên panel chủng vi khuẩn lao:

- Độ nhạy của kit mPCR: 100%.

- Độ đặc hiệu của kit mPCR: 100%

- Ngưỡng phát hiện của phản ứng m PCR: Nồng độ DNA = 30,2fg /µl.


  • Hiệu quả chẩn đoán áp dụng trên bệnh phẩm lâm sàng:

- Độ nhạy của kit mPCR chẩn đoán trên bệnh phẩm lâm sàng: 97,05%

- Độ đặc hiệu của kit mPCR chẩn đoán trên bệnh phẩm lâm sàng: 80,30%



  • Độ ổn định của kit mPCR trong điều kiện bảo quản – 20oC duy trì được 8 tháng.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu hiệu quả chẩn đoán trên lâm sàng và độ ổn định của bộ kit với số mẫu lớn hơn.



: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương