Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao



tải về 0.66 Mb.
trang7/9
Chuyển đổi dữ liệu26.08.2017
Kích0.66 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

2.3.4. Kỹ thuật điện di


Điện di DNA là một phương pháp rất quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được DNA bằng mắt thường. Chúng tôi sử dụng gel Agarose để điện di DNA.

Sản phẩm DNA sau khi khuyếch đại bằng PCR được điện di trên gel Agarose đặt trong một bể dung dịch đệm là TBE 0,5X. DNA mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc DNA, nồng độ agarose trong gel, điện thế, nồng độ thành phần chất điện di. Các đoạn DNA sẽ tạo thành các băng có kích thước khác nhau. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel agarose 1,2% với mục đích xác định kích thước các băng khi được điện di cùng thang DNA chuẩn.



Chuẩn bị gel agarose :

+ Pha agarose theo tỉ lệ 1,2% với dung dịch TBE 0,5X trong bình thủy tinh chịu nhiệt.

+ Đun thạch tan hoàn toàn.

+ Để nguội đến 70oC, bổ sung Red safe (chất có khả năng gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA) với tỷ lệ 2 µl/100 ml agarose đổ gel vào khay đã cài sẵn răng lược.

+ Sau khi gel đã đông rút răng lược ra, đặt gel nằm ngang trong bể điện di có dung dịch đệm TBE 0,5X.

+ Điện di theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110V, cường độ từ 60 – 80 mA trong khoảng 45 phút.

+ Quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel Dolphin – DOC [6, 14, 16].

2.3.5. Tạo kit multiplex PCR ứng dụng trong chẩn đoán lao

2.3.5.1. Nguyên lý tạo kit multiplex PCR

Việc sử dụng multiplex PCR sẽ tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA và phân tích định lượng. Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất có giá trị trong chẩn đoán xác định virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Đặc biệt, phản ứng multiplex PCR rất hữu ích cho việc phát hiện trực tiếp M. tuberculosis từ các mẫu lâm sàng và phân biệt các mẫu âm tính giả và âm tính thật [1, 2, 4, 8, 20, 24].

Dựa vào kết quả nghiên cứu của các tác giả về việc khuyết gen IS6110 ở một số chủng lao có mặt ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện tạo kit multiplex PCR đồng thời 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA.

Qua quá trình tham khảo từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới [48], chúng tôi tiến hành thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR. Các cặp mồi được thiết kế phải đảm bảo độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại cao, được kiểm tra về khả năng bắt cặp tạo dimer lẫn nhau, đồng thời các cặp mồi phải có nhiệt độ bắt cặp khá tương đồng nhau, kích thước của các sản phẩm có thể dễ dàng phân biệt trên bản điện di. Do vậy trong thiết kế mồi cần chú ý đến sự tương đồng của mồi với các trình tự gen đích về độ dài, tỷ lệ G–C và nồng độ mồi. Theo trình tự của các đoạn gen đích công bố trên genbank của M. tuberculosis H37RV, chúng tôi sử dụng các phần mềm thiết kế mồi như Primer3, DNAclub, Oligo để lựa chọn những vùng có độ bảo thủ cao nhất thích hợp cho nghiên cứu và loại bỏ các cặp mồi không tối ưu.

Cặp mồi IS6110 được thiết kế từ gen IS6110 có trình tự bảo thủ rất cao đã công bố trên genbank. Cặp mồi này nhân đoạn gen đích IS6110 có kích thước 416 bp. Cặp mồi 23S rDNA được thiết kế để nhân đoạn gen đích 23S rDNA có kích thước 206 bp, theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) cho thấy gen đích này có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh [50]. Cặp mồi IS1081-F/IS1081-R được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của chủng chuẩn quốc tế nhằm khắc phục hiện tượng thiếu gen đích IS6110 ở một số chủng lao ở Ấn Độ, Đông Nam châu Á và Việt Nam. Cặp mồi này khuếch đại gen đích có kích thước 300 bp.

Các cặp mồi được thiết kế đều có chiều dài 20 bp và tỷ lệ G-C khá tương đồng nên nhiệt độ bắt cặp của chúng với DNA đích không khác xa nhau, do vậy việc khuếch đại cùng lúc nhiều đoạn gen đích trong cùng một điều kiện về chu kỳ nhiệt và các thành phần của phản ứng multiplex PCR sẽ xảy ra dễ dàng hơn. Các cặp mồi nhân các đoạn gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA lần lượt có kích thước: 416 bp, 300 bp và 206 bp, kích thước của các đoạn gen này đủ để có thể phân biệt rõ ràng trên bản điện di gel agarose.

Để xác định điều kiện tốt nhất cho phản ứng multiplex PCR, chúng tôi lần lượt thử các thành phần phản ứng multiplex PCR với các nồng độ khác nhau. Bao gồm dung dịch đệm (buffer PCR), nồng độ MgCl2, nồng độ mồi và nồng độ DNA khuôn. Đối với chu trình nhiệt cũng lần lượt thử với các nồng độ biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước đoạn gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng PCR.

Sau mỗi lần thực hiện phản ứng với mỗi nồng độ, thành phần tham gia phản ứng và với mỗi chu trình nhiệt khác nhau, kết quả sản phẩm PCR được lựa chọn là những băng đậm nét nhất, đặc hiệu đúng kích thước mong muốn và không có sản phẩm phụ. Các thông số về nồng độ của các thành phần tham gia phản ứng sẽ được lựa chọn cho các lần tiến hành phản ứng tiếp theo tương ứng với băng sản phẩm PCR rõ nét và đặc hiệu. Quá trình tối ưu được tiến hành trên panel mẫu chuẩn dương tính là DNA tách từ các chủng Mycobacterium tuberculosis.



2.3.5.2. Tạo master mix

Sau khi đã xác định được thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng mPCR chúng tôi tiến hành tạo master mix theo như thành phần đã được lựa chọn để kiểm tra đánh giá hiệu quả của kit m PCR trên các panel mẫu và trên các bệnh phẩm lâm sàng.



      1. Kiểm tra và áp dụng kit multiplex PCR

        1. Kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của multiplex PCR trên panel mẫu

  • Kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR

Panel kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR được tạo ra bởi DNA của các chủng M. tuberculosis complex để đánh giá khả năng phát hiện M. tuberculosis của kit multiplex.

Độ nhạy của kit multiplex PCR được đánh giá dựa vào công thức sau:

Se = a / (a + b) x 100%

Trong đó: a: Dương tính thật b: Âm tính giả


Panel kiểm tra độ đặc hiệu được tạo ra bởi DNA tách chiết từ các chủng Mycobacterium other than tuberculosis để đánh giá khả năng phát hiện các mẫu không phải M. tuberculosis.

Độ đặc hiệu của kit multiplex PCR được đánh giá dựa vào công thức sau:

Sp = d / (d + c) x 100%

Trong đó: c: Dương tính giả d: Âm tính


  • Kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng mPCR trên panel chuẩn từ chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis:

DNA tách chiết từ các chủng M. tuberculosis complex được pha loãng theo tỷ lệ nhất định, dải DNA sau khi pha loãng được chạy multiplex PCR để xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng.

2.3.6.2. Kiểm tra hiệu quả chẩn đoán của kit multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng

Chúng tôi thu thập 100 mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ các bệnh nhân lao và nghi lao ở Bệnh viện 103. Các bệnh phẩm này đã được tiến hành soi và nuôi cấy, sau đó được xử lý và tách chiết thu DNA tổng số. Tiến hành phản ứng multiplex PCR với DNA bệnh phẩm để kiểm tra khả năng áp dụng trên bệnh phẩm lâm sàng.



2.3.6.3. Kiểm tra tính ổn định của kit multiplex PCR

Kit multiplex PCR sau khi tối ưu hóa nhiệt độ, thời gian và nồng độ các thành phần được mix sẵn thành các master mix cho phản ứng multiplex PCR chẩn đoán lao. Chuẩn bị 120 master mix, bảo quản ở điều kiện -20oC (các hóa chất có trong thành phần bộ kit cũng được bảo quản ở nhiệt độ này). Sau đó theo định kì hàng tháng tiến hành 10 phản ứng mPCR bằng master mix. Các kết quả này được lưu lại và so sánh từ tháng thứ nhất đến tháng hiệu suất chẩn đoán giảm để tính thời gian ổn định của bộ kit.



    1. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các số liệu được thu thập, phân tích và xử lý theo các phương pháp thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel, Epi-Info 6.0.
Chương 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TẠO KIT MULTIPLEX PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN LAO

3.1.1. Tách chiết DNA

Có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA khác nhau, trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã thử nghiệm các phương pháp khác nhau để thu được DNA có độ tinh sạch cao, loại bỏ tối đa các tác nhân ức chế phản ứng multiplex PCR. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch lysis buffer để dung giải tế bào cùng với lysozyme và proteinase K, tách chiết bằng phenol – chloroform – isoamyl, tủa DNA bằng cồn đã đem lại hiệu quả tinh sạch tương đối cao.

Khuẩn lạc vi khuẩn lao sau nuôi cấy được thu hoạch vào trong các tube chứa nước muối sinh lí, nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 109 vk/ml, sau đó được bất hoạt ở 80oC trong 20 phút. Ly tâm thu cặn tế bào vi khuẩn để chuẩn bị cho quá trình tách chiết. Tế bào thu được sau đó được ly giải bằng dung dịch đệm lysis buffer với thành phần gồm Tris-HCl 1M (pH 8.5), EDTA 0,5M, SDS 10%, NaCl 5M và lysozyme 25mg/ml, đem votex kĩ rồi ủ trong nước đá 30 phút. Quá trình này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng các bào quan và vật chất di truyền. Bổ sung Proteinase K 10mg/ml vào dung dịch và ủ lắc ở 56oC trong 2 đến 3 giờ. Proteinase K giúp phân hủy protein. Sau khi ủ lắc dung dịch ly giải được chiết bằng hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl – Alcohol (25:24:1) với tỷ lệ 1:1 so với dung dịch ly giải. Votex kĩ sau đó ly tâm thu lấy dịch nổi có chứa DNA. Dịch nổi chứa DNA này sau đó được tủa trong hỗn hợp cồn 100% và CH3COONa 3M, ly tâm thu cặn. DNA tiếp tục được rửa lại bằng cồn 70%, ly tâm thu cặn, làm khô, hòa cặn có chứa DNA trong 100µl khử vô trùng. Kết quả chúng tôi thu được DNA tổng số của vi khuẩn lao.

Các mẫu DNA sau khi tách chiết được kiểm tra độ tinh sạch bằng thiết bị máy đo quang phổ. Đo độ hấp thu quang phổ của DNA ở bước sóng 260nm và của protein ở bước sóng 280nm. Nồng độ của DNA được tính bằng độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 260nm, độ tinh sạch được đánh giá bằng tỷ số hấp thu OD260nm/OD280nm. DNA thu được có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8 - 2,0 được coi là khá tinh sạch, không lẫn protein và các tạp chất khác [6, 28, 42]. DNA tổng số này đảm bảo để sử dụng làm panel mẫu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.



Bảng 3.1. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao từ Bệnh viện TW Huế


Stt

Tên mẫu

Nồng độ Ng/µl

OD (260/280)

1

TB05-101

27,8

1,92

2

TB05-102

20,5

1,78

3

TB05-103

16,5

1,85

4

TB05-104

17,8

1,85

5

TB05-105

30,3

1,65

6

TB05-106

91,8

1,82

7

TB05-107

86,1

1,69

8

TB05-108

49,2

1,69

9

TB05-109

39,5

1,71

10

TB05-110

33,3

1,75


Bảng 3.2. Kết quả tách chiết DNA một số bệnh phẩm từ Bệnh viện 108

Stt

Tên mẫu

Nồng độ Ng/µl

OD (260/280)

1

TB08-171

89,1

1,67

2

TB08-172

159,5

1,69

3

TB08-173

5,2

2,72

4

TB08-174

81,5

1,70

5

TB08-175

34,7

1,60

6

TB08-176

13,5

2,39

7

TB08-177

6,5

1,76

8

TB08-178

63,5

1,57

9

TB08-179

20,5

1,54

10

TB08-180

4,8

1,88


3.1.2. Tạo panel

3.1.2.1. Tạo panel kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của kit mPCR

Panel kiểm tra độ nhạy của kit mPCR gồm 50 mẫu DNA của chủng Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Các mẫu này đã được kiểm tra có đủ 3 gen đích là IS6110, IS1081 và 23S rDNA.



Panel kiểm tra độ đặc hiệu của kit mPCR gồm 50 mẫu DNA được tạo từ các mẫu DNA của Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT). Các mẫu này không có các trình tự đặc trưng của 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA. 50 mẫu panel độ nhạy và 50 mẫu panel độ đặc hiệu được mã hóa để đảm bảo tính khách quan cho các kiểm tra đánh giá về độ nhạy và độ đặc hiệu.

Bảng 3.3. Panel kiểm tra độ nhạy của kit multiplex PCR

Stt

Mã chủng

Mã số bộ panel

Stt

Mã chủng

Mã số bộ panel

1

TB02-01

DNA-TB01

26

TB02-30

DNA-TB26

2

TB02-02

DNA-TB02

27

TB02-31

DNA-TB27

3

TB02-03

DNA-TB03

28

TB02-32

DNA-TB28

4

TB02-04

DNA-TB04

29

TB02-33

DNA-TB29

5

TB02-05

DNA-TB05

30

TB02-34

DNA-TB30

6

TB02-06

DNA-TB06

31

TB05-01

DNA-TB31

7

TB02-07

DNA-TB07

32

TB05-02

DNA-TB32

8

TB02-08

DNA-TB08

33

TB05-03

DNA-TB33

9

TB02-09

DNA-TB09

34

TB05-04

DNA-TB34

10

TB02-10

DNA-TB10

35

TB05-05

DNA-TB35

11

TB02-15

DNA-TB11

36

TB05-06

DNA-TB36

12

TB02-16

DNA-TB12

37

TB05-07

DNA-TB37

13

TB02-17

DNA-TB13

38

TB05-08

DNA-TB38

14

TB02-18

DNA-TB14

39

TB05-09

DNA-TB39

15

TB02-19

DNA-TB15

40

TB05-10

DNA-TB40

16

TB02-20

DNA-TB16

41

TB06-83

DNA-TB41

17

TB02-21

DNA-TB17

42

TB06-88

DNA-TB42

18

TB02-22

DNA-TB18

43

TB06-89

DNA-TB43

19

TB02-23

DNA-TB19

44

TB06-90

DNA-TB44

20

TB02-24

DNA-TB20

45

TB06-91

DNA-TB45

21

TB02-25

DNA-TB21

46

TB06-92

DNA-TB46

22

TB02-26

DNA-TB22

47

TB06-93

DNA-TB47

23

TB02-27

DNA-TB23

48

TB06-94

DNA-TB48

24

TB02-28

DNA-TB24

49

TB06-95

DNA-TB49

25

TB02-29

DNA-TB25

50

TB06-96

DNA-TB50

Bảng 3.4. Panel kiểm tra độ đặc hiệu của kit multiplex PCR

Stt

Mã chủng

Mã số bộ panel

Stt

Mã chủng

Mã số bộ panel

1

TB02-201

DNA-TB51

26

TB02-229

DNA-TB76

2

TB02-203

DNA-TB52

27

TB02-230

DNA-TB77

3

TB02-204

DNA-TB53

28

TB02-201

DNA-TB78

4

TB02-205

DNA-TB54

29

TB02-203

DNA-TB79

5

TB02-206

DNA-TB55

30

TB02-204

DNA-TB80

6

TB02-207

DNA-TB56

31

TB05-205

DNA-TB81

7

TB02-208

DNA-TB57

32

TB05-206

DNA-TB82

8

TB02-209

DNA-TB58

33

TB05-207

DNA-TB83

9

TB02-210

DNA-TB59

34

TB05-208

DNA-TB84

10

TB02-212

DNA-TB60

35

TB05-209

DNA-TB85

11

TB02-213

DNA-TB61

36

TB05-210

DNA-TB86

12

TB02-214

DNA-TB62

37

TB05-212

DNA-TB87

13

TB02-216

DNA-TB63

38

TB05-213

DNA-TB88

14

TB02-217

DNA-TB64

39

TB05-214

DNA-TB89

15

TB02-218

DNA-TB65

40

TB05-215

DNA-TB90

16

TB02-219

DNA-TB66

41

TB06-216

DNA-TB91

17

TB02-220

DNA-TB67

42

TB06-217

DNA-TB92

18

TB02-221

DNA-TB68

43

TB06-218

DNA-TB93

19

TB02-222

DNA-TB69

44

TB06-219

DNA-TB94

20

TB02-223

DNA-TB70

45

TB06-220

DNA-TB95

21

TB02-224

DNA-TB71

46

TB06-221

DNA-TB96

22

TB02-225

DNA-TB72

47

TB06-222

DNA-TB97

23

TB02-226

DNA-TB73

48

TB06-223

DNA-TB98

24

TB02-227

DNA-TB74

49

TB06-224

DNA-TB99

25

TB02-228

DNA-TB75

50

TB06-225

DNA-TB100

: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương