Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao



tải về 0.66 Mb.
trang6/9
Chuyển đổi dữ liệu26.08.2017
Kích0.66 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

2.3.2. Tách chiết DNA


2.3.2.1. Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn lao

Vi khuẩn được thu hoạch trong nước muối sinh lý, nồng độ vi khuẩn đạt 109 vk/ml.

Bước 1: Votex kĩ dịch nuôi vi khuẩn lao, lấy 200 µl vào tube eppendorf, bất hoạt ở 80oC trong 20 phút rồi để nguội ở nhiệt độ phòng [33, 35, 44].

Bước 2: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút, thu cặn lắng chứa khuẩn lạc, bỏ nước nổi.

Bước 3: Thêm 500µl lysis buffer và 12µl lysozyme 25mg/ml (nồng độ cuối cùng đạt 500µg/ml), vortex kĩ rồi ủ trong nước đá 30 phút.

Bước 4: Thêm 3 µl proteinase K (nồng độ cuối 100µg/ml), lắc kỹ bằng pipetting.

Bước 5: Ủ 56oC trong bể ổn nhiệt có lắc 900rpm trong 3h (hoặc qua đêm).

Bước 6: Thêm 550µl Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 1/1 với lysis bufer), vortex kỹ.

Bước 7: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút.

Bước 8: Chuẩn bị trước 1 tube eppendorf có chứa 1300 µl Ethanol 100% + 50µl NaAC 3M, (trường hợp cồn 95% cần 2 tube loại 2ml, mỗi tube chứa 775µ cồn 95% +25µl NaAC 3M) trộn đều, đặt trong khay nước đá (nồng độ cuối cùng của cồn ít nhất 70%).

Bước 9: Hút lấy phần dịch nổi ở phía trên ở cuối bước 7 (tránh hút lớp ngăn cách giữa 2 pha dịch) cho vào tube chứa sẵn cồn và NaAC đã chuẩn bị ở bước 8 (trường hợp cồn 95% cần chia đều dịch nổi vào 2 tube đó), lắc đảo ngược vài lần.

Bước 10: Ủ - 20oC trong 3 giờ hoặc qua đêm.

Bước 11: Ly tâm 13000g/phút trong 30 phút.

Bước 12: Hút nước nổi, giữ lại phần cặn (không hút kiệt để tránh mất DNA).

Bước 13: Thêm 1000µl cồn 70%, lắc ngược vài lần.

Bước 14: Ly tâm 13000g/phút trong 20 phút, bỏ nước nổi lấy cặn (để lại khoảng 20µl tránh mất DNA).

Bước 15: Ly tâm 13000g/phút trong 15 phút, bỏ nước nổi cẩn thận bằng pipet 20µl, giữ phần cặn có DNA.

Bước 16: Làm khô hoàn toàn, thêm vào 200µl nước khử ion, lắc trọn bằng tay, chia ra 02 tube (nếu đã chia 02 tube ở bước 8 thì cho vào mỗi tube 100µl nước khử ion) ghi mã số chủng kèm số (1) và số (2), đo nồng độ OD. Ủ -4o C qua đêm, sau đó bảo quản tube số (2) ở -80oC, tube số (1) dùng ngay hoặc để ở -20oC.



2.3.2.2. Tách chiết DNA từ bệnh phẩm

Đối với mẫu bệnh phẩm lâm sàng cần được xử lý trước khi tách chiết. Tuy nhiên việc tách chiết DNA trực tiếp từ bệnh phẩm thường gặp khó khăn trong việc loại bỏ các tác nhân ức chế đến phản ứng PCR, nồng độ và độ tinh sạch của DNA thấp. Các tác nhân có thể ức chế sự hoạt hóa của enzyme Taq DNA polymerase làm ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Notte và cộng sự đã sử dụng chứng nội tại trong phản ứng PCR và thấy rằng Taq polymerase bị ức chế ở 1/3 số mẫu đờm. Clairridge và cộng sự khi sử dụng PCR khuếch đại gen đích IS6110 để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm lâm sàng đạt độ nhạy là 86,1% và có tới 7,3% số mẫu có chứa các tác nhân ức chế Taq polymerase [24]. Forbers và cộng sự khi không sàng lọc tác nhân ức chế của phản ứng thu được độ đặc hiệu 87,2% [32]. Do vậy vấn đề loại bỏ các tác nhân ức chế phản ứng PCR từ khâu tách chiết rất quan trọng nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán.

Bước 1: Bệnh phẩm cho vào ống facol sạch, đánh số kí hiệu, ly tâm 6000v/p trong 30 phút (nếu bệnh phẩm là đàm cho 5ml tan đàm lắc trộn và để yên khoảng 20 phút cho tan hết đàm rồi mới ly tâm) [34, 42, 47].

Bước 2: Đổ bỏ nước nổi, giữ lại cặn. Thêm 5ml PBS 1X trộn đều, ly tâm tiếp 6000v/p trong 30 phút.

Bước 3: Đổ bỏ nước nổi, giữ cặn, bổ sung 1000 µl lysis buffer + 40 µl lyzozyme trộn đều, để ở tủ tạnh thường 30 phút.

Bước 4: Thêm 25 µl proteinase K lắc đều, ủ ở tủ ấm 56oC có lắc trong ít nhất 2h hoặc qua đêm.

Bước 5: Chia làm 2 tube eppendorf 1,5ml, thêm vào mỗi tube 550 µl Phenol/ Isoamyl/ Alcohol, vortex kĩ.

Bước 6: Ly tâm 13000v/p trong 10 phút.

Bước 7: Chuẩn bị sẵn 2 tube mới có đánh số tương ứng, chứa 1000 µl Ethanol 100% + 100 µl CH3COONa 3M, để trong khay đá.

Bước 8: Cẩn thận hút dịch nổi từ ống eppendorf vừa ly tâm sang ống mới vừa chuẩn bị ở trên, trộn đều. Ủ ở -20oC trong ít nhất 3h hoặc qua đêm.

Bước 9: Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại phần cặn.

Bước 10: Thêm 1000 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000v/p trong 10 phút.

Bước 11: Hút bỏ dịch nổi cẩn thận, giữ lại phần cặn.

Bước 12: Làm khô cặn trong Vacuumdry 2-3 phút.

Bước 13: Hoà cặn DNA trong 100µl nước khử ion/tube.

Bước 14: Bảo quản ở 4oC qua đêm, sau đó cất vào tủ -80oC nếu chưa dùng ngay.


2.3.3. Kĩ thuật PCR và multiplex PCR


Nguyên lý: Phản ứng PCR là một chuỗi chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước.

Bước 1: Giai đoạn biến tính (Denaturation)

Phân tử DNA khuôn được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử (95oC) trong vòng 30 giây đến 90 giây.


Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép mồi bắt cặp với DNA khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 50 đến 70oC tùy thuộc Tm của mồi sử dụng và thời gian kéo dài từ 30 giây đến 90 giây. Đối với phản ứng multiplex PCR cần sử dụng phương pháp gradient nhiệt để tìm nhiệt độ tối ưu cho từng loại mồi.



Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (Extension)

Nhiệt độ tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại và đặc tính của DNA polymerase .

Kĩ thuật multiplex PCR cũng dựa trên nguyên lý tương tự nhưng cho phép khuếch đại 2 hay nhiều gen đích cùng một lúc trong cùng một ống nghiệm bằng cách sử dụng đồng thời các cặp mồi khác nhau. Phương pháp này tiết kiệm thời gian và hóa chất trong chẩn đoán lao nhưng qui trình tối ưu rất khó khăn. Các gen đích trong cùng một ống phản ứng không khác nhau nhiều về kích thước, nhiệt độ gắn mồi không quá xa nhau. Ngoài ra các gen đích được khuếch đại cùng một lúc phải có kích thước đủ xa nhau để có thể phân biệt trên bản gel sau khi chụp.

Thành phần chính của phản ứng:

- Nước khử ion:

- Taq Buffer

- Hỗn hợp mồi

- d NTPs

- Taq polymerase

- Chất phụ gia

- DNA template

Các thành phần của phản ứng ở các mẫu đều giống nhau chúng chỉ khác khác nhau về DNA template. Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di trên gel Agarose 1,2% để phân tích kích thước các gen đích cần nghiên cứu.


: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương