1.3.6. Các nghiên cứu về chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam và tạo kit PCR về chẩn đoán
Ở Việt Nam hiện nay phương pháp để phát hiện lao chủ yếu vẫn là nhuộm Ziehl - Neelsen và nuôi cấy trên môi trường Lowenstein. Một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử vào trong chẩn đoán lao, các cơ sở này mới chỉ sử dụng các kít chẩn đoán của công ty Nam Khoa nhằm vào nhân đoạn IS 6110 là một trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao. Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR như tác giả Trần Thị Thanh Hoa và cộng sự (2005) đã sử dụng kết hợp phương pháp hoá sinh và PCR để xác định đa kháng thuốc của vi khuẩn lao [7]. Tác giả Phan Thị Thu Hương và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường bệnh viện lao [9]. Các tác giả Đặng Đức Anh (2001) và Nguyễn Văn Hưng (2001) nghiên cứu về đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao và khả năng đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao [1, 8]. Đã có nhiều tác giả trong nước tiến hành nghiên cứu về multiplex PCR như tác giả Phạm Hùng Vân (2006) và (2007), các nghiên cứu này tập trung vào các mầm bệnhkhác không phải vi khuẩn lao [17]. Năm 2007 tại Học Viện Quân Y các tác giả Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu, áp dụng các quy trình multiplex PCR khuyếch đại nhiều gen đích đặc trưng cho vi khuẩn lao vào chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao. Với nghiên cứu này các tác giả đã tiến hành hoàn thiện quy trình PCR cho hai gen đích mới là IS 1081 và 23S rDNA dùng để chẩn đoán lao, và tiến hành nghiên cứu tối ưu hoá quy trình multiplex PCR đồng thời cho cả 3 gen đích IS1081, IS6110 và 23S rDNA trong nâng cao hiệu quả chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao [13, 14].
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao
Các chủng vi khuẩn gây bệnh lao (M. tuberculosis complex) được thu thập từ các bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh Viện Đa Khoa TW Huế, Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TW. Các chủng vi khuẩn ngoài lao (Mycobacterium other than tuberculosis – MOTT) được thu thập từ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TW và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch gồm M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. Kansasii. Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường Lowenstein rồi tách chiết DNA và sử dụng làm panel mẫu đối chứng.
2.1.2. Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng
Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng được thu thập từ các bệnh nhân lao và nghi lao tại Bệnh viện 103. Mẫu bệnh phẩm chủ yếu là dịch màng phổi, dịch rửa phế quản, đàm, dịch khớp, dịch màng tim, dịch màng bụng, nước tiểu, dịch não tủy. Các mẫu này được xử lý và tách chiết thu DNA làm mẫu chẩn đoán.
VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược – Học viện Quân Y.
-
Các hóa chất và thiết bị
Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chất chính
Tên hóa chất
|
Hãng sản xuất
|
1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA
|
|
PBS
|
Rectopur(CE- EMB)
|
Tris – Base
|
Applied BioSiciences (Mỹ)
|
Protease K
|
Sigma (Mỹ)
|
Lyzozyme
|
Fermentas
|
Các dung môi hữu cơ
|
Gibco BRL Life technology
|
Ethanol
|
Wako (Japan)
|
Natri acetat
|
Wako (Japan)
|
Phenol/Chloroform/Isomyl
|
Wako (Japan)
| -
2. Hóa chất trong mPCR
|
|
Dream Taq polymerase
|
Fermentas
|
Primers
|
Bioneer
|
MgCl2
|
Fermentas
|
Dream Taq
|
Fermentas
|
DNTPs
|
Fermentas
| -
3. Hóa chất trong điện di và soi gel
|
Fermentas
|
Agarose
|
Fermentas
|
Thang chuẩn DNA
|
Fermentas
|
Loading Dye
|
Fermentas
|
Red safe
|
Sigma (Mỹ)
|
Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính
Tên thiết bị
|
Hãng sản xuất
|
Máy PCR iCyler (Gradient nhiệt)
|
Bio-Rad
|
Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700)
|
Appiled BioSystems
|
Máy ly tâm (Biofuge Primo R)
|
Heraeus
|
Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)
|
Thomas Scientific
|
Máy làm khô chân không
|
Eppendorf
|
Máy chụp ảnh Gel – Doc
|
Dolphin
|
Tủ lạnh 0oC, 4oC, -20oC; -80oC
|
Nuaire
|
Lò vi song
|
Sanyo
|
Cân điện tử (Electronic balances)
|
Adam
|
Pippetman
|
Gilson, Haminlton, Bio-Rad
|
Vortex
|
OSI Rotolab
|
Bể ổn nhiệt
|
Memmert
|
Khối ổn nhiệt có lắc
|
Eppendorf
|
Máy lắc Gyromax 737R
|
Amerex Instrument
|
Bộ điện di DNA
|
Labnet
|
Tủ cấy an toàn sinh học
|
Nuaire
|
Tủ ấm
|
Shelab
|
2.2.2. Các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR
Các mồi đặc hiệu để phát hiện trực khuẩn lao được sử dụng cho phản ứng multiplex PCR nhân các đoạn gen đích có trình tự và độ dài như sau:
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dung trong nghiên cứu
Gen đích
|
Mồi
|
Trình tự
|
Sản phẩm
(bp)
|
23S rDNA
|
23S-F
|
5’ ACC TGA AAC CGT GTG CCT AC 3’
|
206
|
23S-R
|
5’ GGT CCA GAA CAC GCC ACT AT 3’
|
IS1081
|
IS1081-F
|
5’ TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3’
|
300
|
IS1081-R
|
5’ CGC AGC TTG GGG ATC GCG AC 3’
|
IS6110
|
IS6110-F
|
5’ GGT CGC CCG TCT ACT TGG TG 3’
|
416
|
IS6110-R
|
5’ TGG ACG CGG CTG ATG TGC TC 3’
|
Dựa trên trình tự các gen quan tâm (IS6110, IS1081, 23S rDNA) đã công bố trên ngân hàng dữ liệu gen chúng tôi kết hợp sử dụng các phần mềm thiết kế primer như Primer3, DNAclub, Oligo...để tạo ra các primer thích hợp cho mục tiêu nghiên cứu và giúp loại bỏ các cặp primer không tối ưu.
Các cặp mồi IS6110, IS1081 và 23S được thiết kế nhằm khuếch đại các đoạn gen đích quan tâm dựa trên trình tự gen đích của các chủng đã được công bố trên genbank như: NC_000952; CP000611.1; AM408590.1; AB244270.1; AB244268.1; AB244265.1;…
-
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
-
Sơ đồ nghiên cứu
Chủng
vi khuẩn MTBC và MOTT
|
Đánh giá hiệu quả chẩn đoán trên bệnh phẩm lâm sàng
|
Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện
|
Sơ đồ nghiên cứu
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |