Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao


Các nghiên cứu về chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam và tạo kit PCR về chẩn đoán



tải về 0.66 Mb.
trang5/9
Chuyển đổi dữ liệu26.08.2017
Kích0.66 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

1.3.6. Các nghiên cứu về chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam và tạo kit PCR về chẩn đoán


Ở Việt Nam hiện nay phương pháp để phát hiện lao chủ yếu vẫn là nhuộm Ziehl - Neelsen và nuôi cấy trên môi trường Lowenstein. Một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử vào trong chẩn đoán lao, các cơ sở này mới chỉ sử dụng các kít chẩn đoán của công ty Nam Khoa nhằm vào nhân đoạn IS 6110 là một trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao. Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR như tác giả Trần Thị Thanh Hoa và cộng sự (2005) đã sử dụng kết hợp phương pháp hoá sinh và PCR để xác định đa kháng thuốc của vi khuẩn lao [7]. Tác giả Phan Thị Thu Hương và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường bệnh viện lao [9]. Các tác giả Đặng Đức Anh (2001) và Nguyễn Văn Hưng (2001) nghiên cứu về đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao và khả năng đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao [1, 8]. Đã có nhiều tác giả trong nước tiến hành nghiên cứu về multiplex PCR như tác giả Phạm Hùng Vân (2006) và (2007), các nghiên cứu này tập trung vào các mầm bệnhkhác không phải vi khuẩn lao [17]. Năm 2007 tại Học Viện Quân Y các tác giả Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu, áp dụng các quy trình multiplex PCR khuyếch đại nhiều gen đích đặc trưng cho vi khuẩn lao vào chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao. Với nghiên cứu này các tác giả đã tiến hành hoàn thiện quy trình PCR cho hai gen đích mới là IS 1081 và 23S rDNA dùng để chẩn đoán lao, và tiến hành nghiên cứu tối ưu hoá quy trình multiplex PCR đồng thời cho cả 3 gen đích IS1081, IS6110 và 23S rDNA trong nâng cao hiệu quả chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao [13, 14].

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao


Các chủng vi khuẩn gây bệnh lao (M. tuberculosis complex) được thu thập từ các bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh Viện Đa Khoa TW Huế, Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TW. Các chủng vi khuẩn ngoài lao (Mycobacterium other than tuberculosis – MOTT) được thu thập từ Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TW và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch gồm M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. Kansasii. Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường Lowenstein rồi tách chiết DNA và sử dụng làm panel mẫu đối chứng.

2.1.2. Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng


Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng được thu thập từ các bệnh nhân lao và nghi lao tại Bệnh viện 103. Mẫu bệnh phẩm chủ yếu là dịch màng phổi, dịch rửa phế quản, đàm, dịch khớp, dịch màng tim, dịch màng bụng, nước tiểu, dịch não tủy. Các mẫu này được xử lý và tách chiết thu DNA làm mẫu chẩn đoán.
    1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU


Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược – Học viện Quân Y.

      1. Các hóa chất và thiết bị

Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chất chính

Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA




PBS

Rectopur(CE- EMB)

Tris – Base

Applied BioSiciences (Mỹ)

Protease K

Sigma (Mỹ)

Lyzozyme

Fermentas

Các dung môi hữu cơ

Gibco BRL Life technology

Ethanol

Wako (Japan)

Natri acetat

Wako (Japan)

Phenol/Chloroform/Isomyl

Wako (Japan)

  1. 2. Hóa chất trong mPCR




Dream Taq polymerase

Fermentas

Primers

Bioneer

MgCl2

Fermentas

Dream Taq

Fermentas

DNTPs

Fermentas

  1. 3. Hóa chất trong điện di và soi gel

Fermentas

Agarose

Fermentas

Thang chuẩn DNA

Fermentas

Loading Dye

Fermentas

Red safe

Sigma (Mỹ)



Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính


Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Máy PCR iCyler (Gradient nhiệt)

Bio-Rad

Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700)

Appiled BioSystems

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Heraeus

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Thomas Scientific

Máy làm khô chân không

Eppendorf

Máy chụp ảnh Gel – Doc

Dolphin

Tủ lạnh 0oC, 4oC, -20oC; -80oC

Nuaire

Lò vi song

Sanyo

Cân điện tử (Electronic balances)

Adam

Pippetman

Gilson, Haminlton, Bio-Rad

Vortex

OSI Rotolab

Bể ổn nhiệt

Memmert

Khối ổn nhiệt có lắc

Eppendorf

Máy lắc Gyromax 737R

Amerex Instrument

Bộ điện di DNA

Labnet

Tủ cấy an toàn sinh học

Nuaire

Tủ ấm

Shelab


2.2.2. Các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR

Các mồi đặc hiệu để phát hiện trực khuẩn lao được sử dụng cho phản ứng multiplex PCR nhân các đoạn gen đích có trình tự và độ dài như sau:



Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dung trong nghiên cứu


Gen đích

Mồi

Trình tự

Sản phẩm

(bp)

23S rDNA

23S-F

5’ ACC TGA AAC CGT GTG CCT AC 3’

206

23S-R

5’ GGT CCA GAA CAC GCC ACT AT 3’

IS1081

IS1081-F

5’ TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3’

300

IS1081-R

5’ CGC AGC TTG GGG ATC GCG AC 3’

IS6110

IS6110-F

5’ GGT CGC CCG TCT ACT TGG TG 3’

416

IS6110-R

5’ TGG ACG CGG CTG ATG TGC TC 3’

Dựa trên trình tự các gen quan tâm (IS6110, IS1081, 23S rDNA) đã công bố trên ngân hàng dữ liệu gen chúng tôi kết hợp sử dụng các phần mềm thiết kế primer như Primer3, DNAclub, Oligo...để tạo ra các primer thích hợp cho mục tiêu nghiên cứu và giúp loại bỏ các cặp primer không tối ưu.

Các cặp mồi IS6110, IS1081 và 23S được thiết kế nhằm khuếch đại các đoạn gen đích quan tâm dựa trên trình tự gen đích của các chủng đã được công bố trên genbank như: NC_000952; CP000611.1; AM408590.1; AB244270.1; AB244268.1; AB244265.1;…



    1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

      1. Sơ đồ nghiên cứu



Tạo mPCR

với 3 gen đích




Chủng

vi khuẩn MTBC và MOTT


Bệnh phẩm





Panel DNA chủng vi khuẩn

DNA

bệnh phẩm







Tối ưu hóa

phản ứng mPCR


Đánh giá độ ổn định kit mPCR



Đánh giá hiệu quả chẩn đoán trên bệnh phẩm lâm sàng


Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện



Sơ đồ nghiên cứu

: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương