Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao
tải về 0.66 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 1. 3.2. Phương pháp nuôi cấy
- 1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng nguyên kháng thể
- 1.3.4. Phương pháp γ-interferon
- 1. 3.5. Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO1.3.1. Phương pháp soi trực tiếpNhuộm Ziel-Neelsen: Do đặc tính kháng cồn kháng toan nên sau khi nhuộm đỏ bằng fucsin dù tẩy màu bằng axit và cồn, nhuộm lại bằng xanh methylen vi khuẩn lao vẫn có màu đỏ fucsin, không bắt màu xanh methylen như các vi khuẩn khác. Phương pháp nhuộm Ziel-Neelsen mẫu bệnh phẩm và soi dưới kính hiển vi có thể thu được kết quả trong vòng vài giờ. Tuy nhiên số lượng vi khuẩn phải có từ 103 đến 104 vi khuẩn trên 1ml bệnh phẩm trở lên. Chương trình chống lao quốc gia qui định đọc kết quả như sau: - 0 vi khuẩn / 300 vi trường: âm tính. - 1-299 vi khuẩn / 300 vi trường = (+) - 1-10 vi khuẩn / 1 vi trường = ( ++ ) - > 10 vi khuẩn / 1 vi trường = ( +++ ). Phương pháp này vừa không đặc hiệu cho M. tuberculosis vừa không thể phân biệt M. tuberculosis với các Mycobacterium khác. Phương pháp nhuộm diacetate đánh dấu huỳnh quang được sử dụng gần đây nhằm đánh giá sự có mặt cũng như khả năng tồn tại của vi khuẩn trong các mẫu đờm. Phương pháp này được đề xuất để phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn lao đã qua điều trị nhưng chưa thành công do giá thành còn cao [29, 37]. 1.3.2. Phương pháp nuôi cấyKhi bệnh phẩm có ít vi khuẩn lao phải nuôi cấy hoặc tiêm truyền cho chuột lang. Phương pháp tiêm truyền chỉ áp dụng trong phòng thí nghiệm để nghiên cứu, vì tốn kém, thời gian phát hiện sau 2 – 4 tuần. Phương pháp nuôi cấy có thể được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán lao. Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường Lowenstein phải sau 4 – 8 tuần mới có kết quả do M. tuberculosis sinh trưởng chậm. Môi trường nuôi cấy phải đảm bảo giàu chất khoáng, đạm, vitamin…Các Mycobacterium không điển hình mọc nhanh trong 1 tuần, M. tuberculosis mọc chậm hơn ở tuần thứ 3 đến tuần thứ 8. Ngày nay với những phương pháp nuôi cấy mới như MGIT (Mycobacteria growth indicator tube), BACTEC 460... có thể phát hiện vi khuẩn lao sớm nhất là 12 ngày. Kĩ thuật nuôi cấy MGIT 960 được phát triển bởi Becton Dickinson, đây là một kĩ thuật tự động sử dụng huỳnh quang. Sự phát triển của vi khuẩn được phát hiện dựa vào việc sử dụng oxi của Mycobacterium, điều này làm tăng khả năng phát quang của thuốc nhuộm có trong ống, qua đó sẽ định lượng được sự phát triển của vi khuẩn thong qua mối liên hệ tuyến tính với độ phát quang. Phương pháp này giúp phát hiện nhanh Mycobacterium (7 đến 12 ngày). Phương pháp BACTEC là một phương pháp tự động dựa trên việc đo lượng 14CO2 phóng xạ được giải phóng ra bởi quá trình trao đổi chất của Mycobacterium từ axit palmitic đánh dấu phóng xạ 14C (cơ chất) được thêm vào môi trường nuôi cấy Middlebrook 7H12 cải tiến. Hệ thống này giúp phát hiện nhanh Mycobacterium từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 10 [18, 71]. 1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng nguyên kháng thểCác kháng nguyên tự do của Mycobacterium được phát hiện trong các loại dịch cơ thể khác nhau ở một nồng độ nhỏ nhất từ 3 đến 20 µg/ml. Các kháng nguyên được sử dụng nhiều nhất là PPD, glycolipid, sulpholipid, lipopolysacharide, kháng nguyên 5 (38 kDa), kháng nguyên A60, 45/47 kDa, KP90, 30 kDa, P32, lipoarabinomannan (LAM), yếu tố thừng (cord factor - trehalose-6, 6’dimycolate), và kháng nguyên phenolglycolipid-lipid. Phương pháp phát hiện kháng nguyên M. tuberculosis bao gồm ELISA, gắn latex. Phương pháp Dipstick phát hiện LAM ở các mẫu bệnh phẩm thuộc phổi và ngoài phổi với độ nhậy 93% và độ đặc hiệu 95% [59, 71]. Kháng thể kháng với các kháng nguyên mycobacteria có trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng và đa dòng. TB STAT PAK là một xét nghiệm sắc ký miễn dịch có thể phân biệt lao hoạt động và lao không hoạt động bằng cách xét nghiệm máu, huyết tương hoặc huyết thanh. Isocitrate dehydrogenase (ICD) được mã hoá bởi gen icd-2 của Bacille Calmette Guérin (BCG) là một chất chẩn đoán rất nhậy trong các xét nghiệm kháng thể, hiệu quả của phương pháp này đã được công nhận toàn cầu [59, 71]. Một số lượng lớn kháng nguyên đã được sử dụng để chẩn đoán nhưng không một kháng nguyên đơn lẻ nào đạt được độ nhậy 100%, do đó cần phải tập trung vào xác định sự kết hợp một cách tốt nhất các kháng nguyên để chẩn đoán. Một số phòng thí nghiệm đã tạo ra một hỗn hợp các kháng nguyên tinh sạch từ thành tế bào M. tuberculosis H37Rv kết hợp với các hạt liposome bề mặt. Hỗn hợp này phản ứng với kháng thể đặc hiệu có trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng tạo ra ngưng kết màu xanh. Xét nghiệm này phân biệt được những người khoẻ mạnh, những người đã tiêm vaccine BCG với những bệnh nhân có lao hoạt động. ASSURE TB rapid test (Gene labs Diagnosis Pte Ltd., Singapore) là một xét nghiệm sắc ký miễn dịch pha lỏng để phát hiện kháng thể trong mẫu bệnh phẩm. Xét nghiệm sử dụng một protein gắn kháng thể kết hợp với hạt vàng keo và một hỗn hợp các kháng nguyên mới (Mtb11, Mtb8, Mtb48, Mtb81 và 38 kDa được cố định trên màng [71]. Tuy nhiên phương pháp này cần tập trung nhiều loại kháng nguyên vi khuẩn lao để đạt được độ nhậy và độ đặc hiệu cần thiết và rất khó áp dụng đối với các trường hợp số lượng bệnh phẩm ít hoặc lao ngoài phổi. Các phương pháp tinh sạch kháng nguyên mycobacteria không được phổ biến nên thu được các kết quả khác nhau ở các phương pháp khác nhau. Ngoài ra còn một số phương pháp chẩn đoán khác cũng được đề cập tới như phương pháp γ-interferon (IFN-γ), phương pháp BacT/Alert 3D. Tuy nhiên phương pháp này chủ yếu được dùng để đánh giá mức độ sản xuất IFN-γ của các tế bào T, qua đó đánh giá khả năng đáp ứng của hệ thống miễn dịch trong quá trình điều trị lao. Ngoài ra giá thành, thời gian cũng như độ chính xác của những phương pháp này cần xem xét lại. Do vậy chúng không được phổ biến trong chẩn đoán lao.
Kĩ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) được phát minh bởi nhà hóa sinh học người Mỹ Kary Mullis vào năm 1985. Đây là một kỹ thuật cho phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu trong môi trường invitro như trong quá trình phân bào. Kỹ thuật này đã mang lại giải Nobel hóa học cho Kary vì những ứng dụng rộng rãi của nó trong rất nhiều lĩnh vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các mầm bệnh…[4, 14, 16, 22, 30]. Kỹ thuật PCR sử dụng trong chẩn đoán lao cho phép phát hiện nhanh, chính xác M. tuberculosis trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng, xác định các loài thuộc giống Mycobacterium, phát hiện tính kháng thuốc và nghiên cứu dịch tễ học vi khuẩn lao. Để chẩn đoán lao trình tự đích được sử dụng thường xuyên nhất là IS6110, đây là trình tự có ở hầu hết các chủng M. tuberculosis complex. Ngoài ra người ta còn sử dụng các trình tự đích khác để chẩn đoán như IS1081, 23S rDNA, 16S rDNA. Những nghiên cứu gần đây về các yếu tố DNA lặp lại trong vi khuẩn lao M. tuberculosis có liên quan tới sự đa dạng DNA trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao. Sự đa dạng này giúp phân biệt được các chủng lao khác nhau. Do đó các yếu tố này rất quan trọng và cần thiết trong các nghiên cứu dịch tễ học bệnh lao, như nghiên cứu sự lây truyền trong cộng đồng, sự bùng nổ dịch và đặc biệt là đường lây của các chủng kháng thuốc. Có 2 dạng yếu tố lặp lại trong vi khuẩn lao đó là: -Yếu tố IS6110: yếu tố này có khả năng di chuyển, đoạn gen đích có chiều dài 1300 cặp base. -Yếu tố lặp lại trực tiếp DR Trong 2 loại trên, yếu tố IS6110 là yếu tố được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu dịch tễ học vì nó có ở nhiều chủng vi khuẩn lao khác nhau. Kĩ thuật PCR đã được chứng minh là công cụ hữu ích trong chẩn đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm. Một số xét nghiệm bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu loài cho phép phát hiện một loài hoặc một số loài Mycobacterium nhất định và nó cũng hữu ích trong việc phát hiện và xác định các loài thuộc họ Mycobacterium. 1.3.4.2. Kĩ thuật multiplex PCR Để tăng cường khả năng chẩn đoán và vượt qua những thiếu sót của PCR, Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên mô tả, phát triển kỹ thuật multiplex PCR vào năm 1988. Trong kỹ thuật multiplex PCR, nhiều gen đích được khuyếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật multiplex PCR tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA, phân tích định lượng, phân tích đột biến và phát hiện RNA. Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất có giá trị trong chẩn đoán xác định virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng, ngoài ra kỹ thuật này còn để phân tích các sinh vật chuyển gen, phân tích microsatelite và xác định kiểu gen. Đặc biệt, phản ứng multiplex PCR rất hữu ích cho việc phát hiện trực tiếp M. tuberculosis từ các mẫu lâm sàng và phân biệt các mẫu âm tính giả và âm tính thật do những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng có những chủng M. tuberculosis không chứa trình tự IS6110, đặc biệt là các chủng phân lập được từ Đông Nam Á và Ấn Độ. Các nghiên cứu cũng đã phát hiện trình tự IS1081 có ở tất cả các chủng M. tuberculosis đã nghiên cứu và không tìm thấy ở các loài thuộc họ Mycobacterium khác. Do đó IS1081 được đưa vào cho phản ứng PCR và multiplex PCR để phát hiện M. tuberculosis đặc biệt là các chủng ở Đông Nam Á. Ngoài ra còn có gen 23S rDNA và 16S rDNA là đoạn gen mã hóa cho các tiểu phần 23S và 16S của ribosome cũng được sử dụng trong việc phát hiện và xác định sự có mặt của vi khuẩn lao. 1.3.4.3. Kĩ thuật Real – time PCR Kỹ thuật real-time PCR gần đây cũng là một phương pháp mới và khá hữu ích cho việc phát hiện nhanh các trường hợp lao kháng thuốc. Các đầu dò khác nhau được sử dụng trong chẩn đoán ví dụ như đầu dò TaqMan (các mẫu dò hoặc mồi đặc hiệu chuỗi được đánh dấu huỳnh quang), các đầu dò năng lượng cộng hưởng huỳnh quang, các tín hiệu phân tử và các mẫu dò cặp đôi [28]. Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Các kết quả của real-time PCR có thể là định tính (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA), số liệu của real-time PCR có thể thu được mà không cần điện di trên gel agarose. Ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật real-time PCR là thời gian thí nghiệm được rút ngắn và do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống khép kín, do đó giảm thiểu tối đa sự nhiễm mẫu. Tuy nhiên, real-time PCR có nhược điểm là đòi hỏi trang thiết bị và hóa chất đắt tiền đồng thời cũng đòi hỏi người làm thí nghiệm có kinh nghiệm và trình độ cao. Kỹ thuật real-time PCR đã được áp dụng đối với các chủng M. tuberculosis và gần đây hơn nó đã được áp dụng với các mẫu lâm sàng [6, 21, 22]. Kết quả thu được chỉ trong 1,5 – 2 giờ sau khi DNA được tách chiết. Real-time PCR có thể là một trang thiết bị hữu hiệu trong những phòng thí nghiệm trọng điểm phục vụ cho công tác chẩn đoán và kiểm soát tình hình bệnh nhân mắc bệnh lao. Ngoài ra, trên thế giới một số các xét nghiệm phát hiện M. tuberculosis đã được thương mại hóa. Chẳng hạn như, Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (AMTD) được phát triển bởi Gen-Probe, có ưu điểm là phát hiện rRNA, rRNA theo lý thuyết là tồn tại nhiều hơn hàng nghìn lần so với DNA trong hệ gen của vi sinh vật, do đó độ nhạy cao hơn. Thực chất nó là một hệ thống khuyếch đại gián tiếp vùng đặc hiệu của RNA ribosome 16S thông qua sự sao chép của vùng gen đó ở một điểm đẳng nhiệt 42oC [10, 12, 16]. Tuy nhiên sản phẩm khuếch đại là RNA dễ bị phân huỷ hơn so với DNA. Каталог: files -> ChuaChuyenDoi ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05 ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường tải về 0.66 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|