Theo thống kê của tổ chức y tế Thế giới (who), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao



tải về 0.66 Mb.
trang3/9
Chuyển đổi dữ liệu26.08.2017
Kích0.66 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

1.2.3.1. Môi trường và dạng khuẩn lạc


Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC , ở nhiệt độ dưới 37oC và trên 42oC vi khuẩn lao hầu như không mọc. Vi khuẩn lao không sinh trưởng trong môi trường thông thường mà phải nuôi trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng gồm trứng, khoai tây, citrat, glixerol, asparagin, xanh malachite. Môi trường thường dùng là môi trường Loewenstein đặc đã được cải tiến bởi Jensen hoặc môi trường lỏng Sauton. Trong môi trường đặc, trực khuẩn lao mọc rất chậm, phải mất 4 đến 6 tuần mới mọc khuẩn lạc điển hình dạng R.


Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html)

Sau một thời gian nuôi cấy trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh sẽ phát triển thành các khuẩn lạc có bề mặt dính và xù xì. Các Mycobacterium không gây bệnh và các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc khuẩn lạc nhẵn, tạo thành đám trong môi trường nuôi cấy [3, 4, 12, 58].



1.2.3.2. Chu kì tế bào

Trong điều kiện phòng thí nghiệm cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia một lần. Chu kì tế bào của M. tuberculosis khá dài, điều này có thể do tính thẩm thấu của thành tế bào gây hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Theo Harshey và Ramakrishnan sự tổng hợp RNA là tác nhân liên quan đến thời gian sống kéo dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA ở M. tuberculosis chậm hơn 10 lần so với E.coli. Một đặc điểm nữa là chỉ có một operon duy nhất cần thiết trong tổng hợp RNA. Mặt khác khi trực khuẩn chuyển từ trạng thái ổn định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên hai lần, khiến cho việc tổng hợp protein bị chậm lại [58].


1.2.4. Khả năng gây bệnh


Độc lực của trực khuẩn lao có liên quan trực tiếp đến yếu tố “Cord” (trehalose-6,6’-dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mãn tính. M. tuberculosis sinh ra ngoại độc tố nhưng không có ý nghĩa gây bệnh.

Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều đường. Thường là qua đường hô hấp, có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt…Sau khi gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát. Nhiều cơ quan như phổi, thận, màng não, xương, da, hạch... đều có thể bị bệnh lao, nhưng thường bị hơn cả là phổi, vị trí thường gặp ở phổi là đỉnh phổi.

Miễn dịch trong lao là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của trực khuẩn lao, gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn và cuối cùng làm phá hủy trực khuẩn. Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá mẫn muộn. Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ ở trong các u hạt nên cơ thể không thanh toán được. Đặc biệt là trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không thanh toán được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được, đây là một vấn đề nan giải trong điều trị lao [1].


1.2.5. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao

1.2.5.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacterium tuberculosis

Hệ gen của chủng H37Rv được công bố năm 1998 có chiều dài 4.411.529 cặp base. Trong đó có 3.918 gen và các gen này đều được dự đoán là có mã hóa protein, tỷ lệ G+C chiếm 65,61% không thay đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen. Genome của Mycobacterium tuberculosis có tới 90,8% trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [25, 31, 58].

Mycobacterium có một nhóm gồm 172 gen có tỷ lệ G-C >80% mã hóa cho họ protein PE (Pro-Glu) hoặc PPE (Pro-Pro-Glu). Trong đó 104 gen mã hóa PE và 68 mã hóa PPE, chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis. Trình tự PE và PPE có ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều dài xấp xỉ 110 và 180 amino axit. Các protein PE và PPE đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của Mycobacterium trong các môi trường khác nhau. Họ PE được chia thành 3 phân họ, trong đó họ quan trọng nhất gồm 61 thành viên chứa các trình tự đa hình giàu G-C (PGRS). Các protein được mã hóa bởi 104 gen mã hóa cho họ protein PE được chia nhỏ hơn thành 3 lớp, lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập 9, lớp thứ 3 gồm 67 protein tạo thành dưới họ PE-PGRS. PGRS (polymorphic GC-rich repetitive sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự lặp lại nhiều lần Gly-Gly-Ala hoặc Gly-Gly-Asn. Chức năng của các họ này vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả thuyết cho rằng một số protein này có liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên của M. tuberculosis trong quá trình lây nhiễm. Các protein PE-PGRS đặc trưng cho M. tuberculosis có chức năng ức chế trình diện kháng nguyên thông qua phức hệ hoà hợp tổ chức (MHC) lớp đầu tiên. Một số gen PE mã hoá cho các protein chỉ chứa vùng 110 axit amin được đi kèm gần với một gen mã hoá một protein PPE. Trong một số trường hợp, cặp PE-PPE (Rv2431c-Rv2430c) biểu hiện cùng nhau và có thể tạo thành một phức hệ [31, 58, 61, 65].

Một số ít gene với tỷ lệ G+C < 50% mã hoá cho các protein xuyên màng hoặc enzyme polyketide synthase. Hơn 200 gen đã được nghiên cứu mã hoá cho các enzyme của quá trình trao đổi axit béo, chiếm 6% tổng số. Trong số này có khoảng 100 gen được dự đoán về chức năng trong oxy hoá β của các axit béo, trong khi E. coli chỉ có 50 enzyme liên quan đến chuyển hoá axit béo. Số lượng lớn các enzyme ở M. tuberculosis được cho là sử dụng axit béo có thể liên quan đến khả năng gây bệnh phát triển trong mô của vật chủ nơi mà axit béo có thể là nguồn carbon chính [31, 58, 64].

Trong số 50 gen mã hoá cho các RNA chức năng thì chỉ có một operon RNA ribosome, operon này nằm ở vị trí cách 1,5 Mbp so với vị trí khởi đầu sao mã (losus oriC). Phần lớn vi khuẩn có nhiều hơn một operon rrn định vị gần locus oriC để tăng quá trình sao mã. Vi khuẩn lao chỉ có một operon rrn đơn ở một vị trí tương đối xa so với oriC do đó gây ra kiểu hình phát triển chậm. Có hai thể tiền thực khuẩn được phát hiện trong genome, cả hai giống nhau về độ dài và cách tổ chức. Một là prophage PhiRv1 có trong hệ gen của M. tuberculosis H37Rv phá vỡ trình tự lặp lại của họ 13E12. Hệ gen của M. tuberculosis chứa 7 vị trí cho PhiRv1 chèn vào do đó các chủng có những vị trí biến đổi cao trong hệ gen. Prophage thứ hai PhiRv2 ổn định hơn, ít biến đổi hơn giữa các chủng. Các gen mã hoá protein ở M. tuberculosis H37Rv mã hoá cho 3.924 ORF (Open Reading Frame), sự khởi đầu khác ở codon GTG được sử dụng trong 35% trường hợp so với 14% hoặc 9% trong Bacillus subtilis hoặc Escherichia coli. Từ trình tự hệ gen cho thấy M. tuberculosis có khả năng chuyển từ một con đường trao đổi chất này thành con đường trao đổi chất khác bao gồm cả hiếu khí (quá trình phosphoryl hoá oxy hoá) và hô hấp kỵ khí (quá trình khử nitrate). Tính linh hoạt này rất có lợi cho sự thích nghi bên trong các môi trường khác nhau như trong cơ thể người cả khi trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí trong các nang lao. Một đặc tính khác của hệ gen M. tuberculosis là có các gen tổng hợp và phân huỷ hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các phân tử phức như axit mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250 enzyme khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen của E. coli [37, 78]. Trong số các protein điều khiển, M. tuberculosis có 13 yếu tố sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase) tương ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tương ứng 0,6% tổng số. Số lượng tương ứng trong M. tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [65].

Phân tích hệ thống trao đổi chất DNA của M. tuberculosis thấy có một hệ thống sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác rất cao. Hệ gen của M. tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa trên mutS nhưng được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến các cơ chế sửa chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT. Gen này mã hoá cho enzyme chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự bắt cặp sai giữa các cặp base trong quá trình sao chép [25, 31, 58].



1.2.5.2. Gen 23S rDNA

Trong DNA vi khuẩn thì locus di truyền rRNA bao gồm các vùng 16S rDNA, 23S rDNA và 5S rRNA, giữa các vùng này là vùng đệm (Internally Transcribed Spacer - ITS). DNA trong vùng 16S-23S có sự thay đổi lớn về độ dài và trình tự, sự thay đổi này rất có ích cho việc phân biệt loài ở prokaryotes [24, 39].

ITS giữa 16S rDNAvà 23S rDNA có tính đa hình nucleotide cao hơn so với 16S rDNA nhưng không thể phân biệt giữa những loài vi khuẩn có quan hệ gần nhau như những loài thuộc M. tuberculosis complex. IST này có trình tự và tính đa hình thấp hơn so với gen 23S rDNA [73], gen 23S rDNA là đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 23S của ribosome. Ngoài ra theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại vùng gen đích 23S rDNA là một thuận lợi cho việc phát hiện M. tuberculosis complex trong những trường hợp không có trình tự IS6110 ở một số chủng M. tuberculosis complex. Trình tự 23S rDNA ở M. tuberculosis khác với các loài đã phát hiện ở 7 vị trí, đây là các vị trí thích hợp cho việc thiết kế các primer và probe. Sự khác nhau đáng kể giữa các loài không phải Mycobacterium Mycobacterium có ý nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng này trong chẩn đoán [24, 45]. Trình tự 23S rDNA cũng có thể được sử dụng để phân biệt M. tuberculosisM. bovis và cũng được sử dụng để phân biệt các chủng lao gây bệnh trong các Mycobacterium [36, 44].

1.2.5.3. Các trình tự chèn

Các trình tự chèn (IS – Insertion sequences) không có chức năng mã hoá mà chỉ liên quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. Chúng gồm các yếu tố cis, các trình tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này được mã hoá bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu như toàn bộ độ dài của trình tự chèn.

Đa số các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngược chiều ở hai đầu (IR-Inverted Repeat), các trình tự này có chiều dài khoảng 10 đến 40 bp. IR được phân thành hai vùng chức năng, một định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn. Các promoter của IS thường định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn Tpase. Các vị trí gắn các protein đặc hiệu cũng được tìm thấy bên trong hoặc ở gần đầu IR và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase.

Tpase có hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein được quy định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở vùng C. Cấu trúc này tạo nên sự tương tác của phân tử protein mới sinh với các trình tự đích trên IS.





Hình 1.5. Cấu trúc của IS [69]

- IRL - left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái



- IRR - right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải

- Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình tự IRR.

- XYZ chứa các trình tự lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình chèn của IS vào vị trí đích

- p: Promotor định vị trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base ở tận đầu của IS cần thiết cho sự nhận biết các trình tự chèn thông qua Tpase. Vùng II chứa các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình tự đặc hiệu và gắn của Tpase
Một đặc điểm nữa của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA ngắn lặp lại trực tiếp (DR-Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến 14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định.

Chức năng của IS:

Kiểm soát sự biểu hiện của các gen bên cạnh: Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen gần kề, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh. Khi hai yếu tố đứng cạnh nhau theo kiểu đầu-đuôi thì có thể tạo thành các promoter mạnh dẫn đến sự biểu hiện Tpase ở mức cao làm tăng hoạt tính di chuyển của IS.

Điều khiển hoạt tính di chuyển: Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã và độ bền của Tpase [58].

Các trình tự chèn không có chức năng mã hóa mà chỉ liên quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển.



  • IS6110

IS 6110 là một trình tự chèn có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lượng bản copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng. IS 6110 tồn tại rải rác nhiều nơi trong genome của M. tuberculosis. IS6110 có chiều dài 1355 bp, đã được xác định là có mặt trong các chủng M. tuberculosis, và chỉ khác nhau ở một vài nucleotid giữa các bản copy với nhau, IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó nó được chọn làm gen đích trong phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện M. tuberculosis [15].



Hình 1. 6. Một số bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis [61]

Hiện nay IS6110 typing là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho các nghiên cứu dịch tễ học phân tử bởi vì có độ phân biệt cao. Ở một số vùng số lượng bản copy IS6110 thấp (<5 copy) chiếm 25% số chủng, thậm chí có một số chủng không có IS6110 [20, 69]. Sự thay đổi này là nền tảng của tính đa hình và thường được sử dụng trong fingerprinting M. tuberculosis. Các trình tự chèn có các vị trí ưu tiên đã được xác định cho sự hợp nhất vào hệ gen của Mycobacteria, gọi là các “điểm nóng”. Các nghiên cứu gần đây cho thấy quá trình chuyển vị trí của IS6110 là không ngẫu nhiên và cũng có các điểm nóng nhất định cho quá trình hợp nhất với hệ gen. Một số ít điểm nóng đã được xác định, 3 nghiên cứu đã cho thấy các vùng DR là một trong số các điểm nóng đó. Ba vùng ưu tiên khác cho sự hợp nhất của IS6110 với hệ gen cũng đã được mô tả là locus ipl, vùng hợp nhất dnaA-dnaN và vùng nằm giữa Rv1754c và Rv1762c. Bằng phân tích sự phân bố của các đoạn RFLP-IS6110, McHugh và cộng sự đã cho thấy rằng có bằng chứng về các yếu tố IS6110 có thể có nhiều hơn các điểm nóng. Warren và cộng sự đã xác nhận điều này và cũng cho thấy mô hình RFLP có thể thay đổi mặc dù yếu tố IS6110 vẫn được xác định vị trí là ở trong các điểm nóng, có nghĩa là vùng gần điểm nóng có tần số đột biến cao tạo nên những vị trí giới hạn mới cho enzyme giới hạn. Những chủng chứa ít bản copy IS6110 hơn thì giống nhau hơn trong các mô hình fingerprint so với các chủng chứa nhiều bản copy. Oligonucleotide có nguồn gốc từ trình tự này được sử dụng cho phát hiện M. tuberculosis trong các bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật PCR [39, 68].



  • IS1081

Trình tự IS1081 có độ đa hình thấp hơn so với IS6110, theo Collins và Stephens năm 1991, IS1081 là một trình tự chèn có độ dài 1324 bp có ở M. tuberculosis complex, và có từ 5 đến 6 bản copy trong hệ gen. IS1081 có các tận cùng lặp lại ngược chiều và chứa khung đọc mở lớn (ORF) [26]. IS1081 có độ đa hình thấp hơn so với IS6110 bởi IS1081 có hoạt tính di chuyển yếu. Số lượng bản copy cũng thấp hơn IS6110, do đó có những hạn chế trong việc sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học. Nó cũng không được sử dụng thường xuyên để phân biệt B. bovis - BCG với các thành viên khác thuộc M. tuberculosis complex [20]. IS1081 không liên quan mật thiết với các yếu tố DNA khác nhưng transposase của IS1081 giống với IS 256 của Staphylococcuc aureus . Tuy nhiên, IS1081 cũng rất hữu ích cho các thao tác di truyền và phát triển các xét nghiệm chẩn đoán phát hiện M. tuberculosis dựa trên phản ứng PCR và multiplex PCR . Một trong những ưu điểm mà IS1081 được chọn là để nhằm khắc phục hiện trượng khuyết gen IS6110 ở các chủng lao tại Đông Nam châu Á, Việt Nam và Ấn Độ và qua đó khắc phục được hiện tượng phản ứng PCR cho kết quả âm tính giả, nâng cao được hiệu quả chẩn đoán vi khuẩn lao [7, 77].

: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường


1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương