Sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá trình sinh học

Công nghệ sinh học được định nghĩa là “sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá trình sinh học”. Hơn một thế kỷ qua, công nghệ sinh học được chú trọng phát triển tại hầu hết các quốc gia trên thế giới với nhiều thành tựu đáng kinh ngạc. Để thúc đẩy sự phát triển công nghệ sinh học ở Việt Nam, các phòng thí nghiệm sinh học ngày càng được trang bị máy móc hiện đại, nguồn nhân lực trình độ chuyên môn tốt. Do đó, các chế phẩm sinh học phục vụ cho lĩnh vực nghiên cứu này đòi hỏi phải đảm bảo chất lượng và độ chính xác cao. Một chế phẩm sinh học thường dùng trong nghiên cứu sinh học là thang chuẩn ADN. Đây là công cụ hữu ích được sử dụng để đánh giá kích thước và nồng độ các đoạn ADN. Tuy nhiên, thang chuẩn hiện nay đều phải nhập khẩu với giá thành cao, thiếu tính chủ động trong nguồn cung cấp. Nhược điểm này đã gây nhiều khó khăn trong quá trình triển khai nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam.

Một trong những mặt hàng thang chuẩn có nhu cầu sử dụng cao và thuận tiện trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là thang chuẩn ADN 100 bp, thường gồm dải băng có kích thước từ 100 bp đến 3000 bp. Mặc dù sản phẩm này có nhu cầu sử dụng lớn, nhưng lại phải nhập khẩu với giá thành cao, phụ thuộc thời gian đặt hàng và vận chuyển đã phần nhiều ảnh hưởng tới tính chủ động trong các thí nghiệm. Để khắc phục những khó khăn này chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết Kế Thang Chuẩn ADN”. Mục tiêu của đề tài là: thiết kế được thang chuẩn ADN 100 bp đảm bảo chất lượng tốt, giá cả hợp lí, đáp ứng nhu cầu sử dụng cũng như phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm trong nước. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học, Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. THANG CHUẨN ADN

• 
  Định nghĩa thang chuẩn ADN
  

• 
  Phân loại thang chuẩn ADN
  

- ADN Ladder: Để tạo ra ADN ladder người ta thường sử dụng các enzyme giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích thước lớn, không có nguồn gốc tự nhiên (ví dụ như các plasmid đã bị biến đổi bằng kỹ thuật di truyền, đoạn ADN kích thước lớn). ADN ladder gồm các đoạn ADN có kích thước đặc trưng, với bước nhảy mong muốn (Hình 1) [16].

Hình 1. Ảnh ADN ladder 500 bp (Takara) [45]; ADN ladder 200 bp (Fermentas) [33] và ADN ladder 10 bp (Invitrogen) [35].

- ADN Marker: Cũng như ADN ladder, để sản xuất ADN marker người ta sử dụng các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích thước lớn, nhưng phân tử ADN này có sẵn trong tự nhiên như: ADN genome của thực khuẩn thể lambda, plasmid pBR322, hay ΦX174... (Hình 2) [16]. Thang chuẩn loại này gồm các đoạn ADN có kích thước khác nhau với bước nhảy ngẫu nhiên.

Hình 2. ADN marker thương mại được tạo ra từ ΦX174; pBR322 và pUC19 [33].

Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử việc tiến hành xác định nồng độ và kích thước các đoạn ADN luôn rất cần thiết trong các thí nghiệm như: sử dụng kít tinh sạch, tách chiết ADN hay nhân dòng gen… Thông thường để xác định chính xác kích thước và nồng độ ADN cần phải sử dụng đến phương pháp giải trình tự và xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ. Cả hai phương pháp này đều cần nhiều thời gian, thao tác thí nghiệm tương đối phức tạp, đặc biệt giá thành để giải trình tự một mẫu ADN khá cao, lại không phải lúc nào cũng cần thiết. Cách đơn giản, nhanh chóng để xác định nồng độ và kích thước đoạn ADN nghiên cứu là so sánh với một đoạn ADN đã biết nồng độ và kích thước [24]. Để thực hiện mục đích này kỹ thuật điện di đã được sử dụng một cách thường xuyên.

Với mục đích phân tách các đoạn ADN trên gel agarose hoặc polyacrylamide, thang chuẩn ADN đã trở thành một công cụ rất hữu ích để đánh giá chất lượng, kích thước và nồng độ của mẫu ADN. Thang chuẩn thường chạy cùng một lúc trên gel với các mẫu ADN, sự so sánh giữa các băng ADN mẫu với các băng ADN thang chuẩn cho phép ước tính kích thước và nồng độ các đoạn ADN chưa biết [16]. Để thang chuẩn có thể thực hiện vai trò quan trọng này thì mỗi băng trong thang chuẩn ADN thương mại luôn được mô tả chính xác kích thước và nồng độ ADN tương ứng với lượng thể tích [40].

1.1.3. Sản xuất thang chuẩn ADN

1.1.3.1. Cung ứng và sản xuất thang chuẩn ADN trên thế giới

Thị trường thang chuẩn ADN trên thế giới hiện có sự góp mặt của nhiều hãng sản xuất và cung ứng danh tiếng như Fermentas - Đức [33]; Takara - Nhật Bản [46]; Invitrogen - Mỹ [35]… Kích thước những đoạn ADN trong các thí nghiệm là khác nhau, chính vì thế mà thang chuẩn ADN bán trên thị trường cũng phân thành nhiều loại, tùy thuộc số lượng băng, kích thước băng ở từng hãng sản xuất [38, 47]. Những khác biệt đó đã góp phần tạo ra một thị trường thang chuẩn đa dạng và phong phú (Hình 3). Các thang chuẩn hiện có mặt trên thị trường thường gồm các băng trong khoảng từ 5 bp đến 50.000 bp [43, 44].

Hình 3. Một số thang chuẩn ADN thương mại bán trên thị trường [33, 34].

Sự phát triển của các phòng thí nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam góp phần làm tăng nhu cầu sử dụng thang chuẩn ADN. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có một cơ sở trong nước nào đăng ký cung ứng sản phẩm này. Thang chuẩn hiện vẫn phải nhập khẩu từ các hãng sản xuất lớn trên thế giới với giá thành cao, phụ thuộc thời gian đóng gói và vận chuyển đã ảnh hưởng đến tính chủ động trong các thí nghiệm và nguồn cung cấp.

Trong những năm gần đây, chúng tôi được biết Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài thiết kế thang chuẩn [2, 6]. Tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội cũng đã sản xuất thành công thang chuẩn ADN 4,6 kb với bước nhảy 500 bp và hiện đang trong quá trình dùng thử [1]. Tuy nhiên, các sản phẩm thang chuẩn này vẫn chưa được thương mại hóa. Chính vì vậy, mặc dù cho đến nay thang chuẩn ở Việt Nam có nhu cầu sử dụng rất lớn, nhưng vẫn chưa có sự góp mặt của một nhà sản xuất trong nước.

1.1.3.3. Phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN

Thang chuẩn ADN là một sản phẩm mang tính chất thương mại. Vì vậy, mặc dù mặt hàng này được bán rất rộng rãi trên thị trường nhưng các kỹ thuật liên quan đến thiết kế và sản xuất lại không được công bố. Do đó, rất khó để có được một tài liệu tham khảo về quy trình sản xuất thang chuẩn ADN. Từ những tài liệu hiếm hoi mà chúng tôi tổng hợp được cho thấy có bốn phương pháp chủ yếu được áp dụng để thiết kế thang chuẩn ADN với những ưu và nhược điểm riêng [1, 2].

• 
  Phương pháp hóa tổng hợp
  

Phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng các thiết bị hiện đại, dễ thực hiện, nhanh chóng tổng hợp được bất cứ một trình tự ADN ngắn nào với độ tinh sạch và chính xác cao (thông thường đạt độ chính xác cao khi tiến hành tổng hợp các phân tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotide [15]). Tuy nhiên, mặt hạn chế của phương pháp này là khó có thể tổng hợp được trình tự dài hơn 100 nucleotide mà đảm bảo được số lượng và chất lượng mong muốn. Máy móc và các hóa chất tổng hợp có giá thành cao, thang chuẩn tạo ra phải qua bước tạo cặp bổ sung để chuyển ADN sợi đơn thành dạng sợi kép. Do đó, phương pháp này thường áp dụng để tạo thang chuẩn có kích thước nhỏ, như thang chuẩn 5 bp hay 10 bp với nhu cầu sử dụng không cao (Hình 4) [1].

Hình 4. Ảnh ADN ladder 5 bp (Fermentas) điện di trên agarose 5% và gel polyacrylamide 10% [33].

• 
  Phương pháp áp dụng kỹ thuật PCR
  

- Bước biến tính: ADN khuôn dạng sợi đôi được biến tính bằng nhiệt độ để tách thành hai sợi đơn [3].

- Bước hồi tính: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng sẽ được làm nguội dần xuống, cho phép các mồi liên kết bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn.

- Bước tổng hợp: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng sẽ được tăng lên đến nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của enzyme ADN polymerase. Quá trình tổng hợp ADN sẽ được diễn ra theo chiều từ 3’ đến 5’ (Hình 5) [4, 8].

Hình 5. Kéo dài mồi bởi Taq ADN polymerase. Mồi được gắn vào trình tự bổ sung trên sợi khuôn và Taq ADN polymerase kéo dài mồi bằng cách gắn chính xác các deoxynucleotide (dNTP) theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung với sợi ADN khuôn, quá trình tổng hợp diễn ra theo chiều 3’ - 5’.

Các ADN polymerase bền nhiệt sử dụng trong phản ứng PCR được tách chiết từ một số loại vi khuẩn chịu nhiệt như Sulfolobus solfataricus, Bacillus steriotherphilus, Pyrococus fumaricus. Tuy nhiên loại enzyme sử dụng phổ biến nhất hiện nay là Taq ADN polymerase được tách chiết từ một loại vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus [8, 23].

Các mồi được thiết kế phải tuân thủ một số nguyên tắc sau: (1) Có tỷ lệ GC chiếm từ 40 - 75%, khoảng cách giữa hai mồi thường không dài quá 3 kb, các mồi không được tạo cấu trúc bậc hai do liên kết giữa các nucleotide ngay trong một mồi [3]. Nhiệt độ gắn mồi (T_m) cũng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR.

Dựa trên trình tự đã biết của một phân tử ADN kích thước lớn, các cặp mồi khác nhau đã được thiết kế tùy thuộc kích thước băng, số lượng băng và bước nhảy giữa các băng ADN trong thang chuẩn sản xuất. Thông qua phản ứng PCR hay Multiplex PCR sử dụng các cặp mồi này sẽ khuếch đại các đoạn ADN kích thước mong muốn. Các đoạn ADN sẽ được tinh sạch và phối trộn theo tỷ lệ nồng độ nhất định tạo thang chuẩn ADN. Loại thang chuẩn này có kích thước băng và bước nhảy mong muốn, phương pháp thực hiện đơn giản, dễ ứng dụng trong điều kiện của nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, mặt hạn chế của phương pháp này là các hóa chất đi kèm có giá thành cao, các băng thang chuẩn thường không rõ nét [1, 7].

• 
  Phương pháp sử dụng các enzyme cắt giới hạn
  

Các enzyme cắt giới hạn type II đóng vai trò quan trọng trong quy trình nhân dòng gen. Khi một mẫu ADN được xử lý với một trong những enzyme này ở một điều kiện, thành phần phản ứng không đổi sẽ luôn tạo ra cùng một tổ hợp các đoạn ADN trong những lần cắt khác nhau. Do đó, enzyme cắt giới hạn type II trở thành một công cụ hữu hiệu trong sản xuất thang chuẩn ADN [15]. Thang chuẩn loại này chủ yếu sử dụng các phân tử ADN kích thước lớn có sẵn trong tự nhiên, thao tác đơn giản dễ thực hiện, giá thành rẻ. Tuy nhiên chính việc sử dụng các phân tử ADN có sẵn trong tự nhiên lại trở thành một nhược điểm lớn của phương pháp này, vì vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn là ngẫu nhiên, nên các băng của thang chuẩn loại này có bước nhảy không xác định [16].

• 
  Kỹ thuật ADN tái tổ hợp
  

Bước 1: Đoạn ADN chèn mong muốn sẽ được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn, tạo đầu tận cùng 3’ và 5’ phù hợp.

Bước 2: Vector tách dòng cũng được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn tương ứng với đoạn ADN chèn.

Bước 3: Thực hiện phản ứng nối đoạn ADN đích vào vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để nhân lên số lượng lớn.

Bước 4: Chọn lọc các tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp.

Vector tái tổ hợp sẽ được cắt bằng enzyme cắt giới hạn để tạo ra thang chuẩn. Thang chuẩn loại này có giá thành rẻ, đơn giản, dễ thực hiện, thời gian bảo quản lâu, lại có thể chủ động được kích thước của các băng trong thang chuẩn. Đây là phương pháp được áp dụng nhiều nhất trong sản xuất thang chuẩn tại các trung tâm sản xuất chế phẩm sinh học lớn hiện nay [6].

• 
  Thuận lợi
  

• 
  Khó khăn
  

1.2. THANG CHUẨN 100 bp

ADN ladder 100 bp thường gồm dải băng có kích thước từ 100 bp đến 3000 bp, được sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất danh tiếng trên thế giới như: Fermentas - Đức; Takara - Nhật Bản; Invitrogen - Mỹ; New England Biolab - Anh; Roche - Thụy Sỹ; Promega - Mỹ. ADN ladder 100 bp của từng hãng sản xuất lại có số lượng băng và giá thành sản phẩm khác nhau (Hình 6 A, Bảng 2). Một số hãng thương mại còn kết hợp sử dụng ADN ladder 100 bp với loại thang chuẩn ADN khác (ADN ladder 500 bp; High Range ADN ladder,…), nhằm tăng dải kích thước băng ADN cũng như tăng tính ứng dụng của loại sản phẩm này (Hình 6 B) [33, 36]. Chính những điều đó đã góp phần tạo ra một thị trường thang chuẩn 100 bp đa dạng và phong phú, đáp ứng mọi nhu cầu của người sử dụng [41, 42].