NẤm côn trùng tại vưỜn quốc gia cát tiêN: nguồn tài nguyên quý cho cáC Ứng dụng sinh họC

Viện Sinh học Nhiệt đới

9/621 Xa lộ Hà Nội, Linh Trung, Thủ Đức

Email: letanhung@itb.ac.vn

Trong tự nhiên, mối quan hệ giữa nấm với côn trùng và các loài chân khớp khác có thể là cộng sinh đến ký sinh gây hại. Thuật ngữ “entomogenous fungi” được sử dụng trong khoa học dùng để chỉ những loài nấm sống trên hoặc trong cơ thể côn trùng. Theo tác giả Evan (1988) [1], những loài nấm này có thể được chia làm bốn nhóm. Nhóm cộng sinh bao gồm những loài sống trên ký chủ và mang lại những lợi ích nhất định lẫn nhau; nhóm nội ký sinh bao gồm những loài sống bên trong đường tiêu hóa và nhóm ngoại ký sinh bao gồm những loài sống bám bên ngoài lớp biểu bì ký chủ, cả hai nhóm này không có khả năng tiêu diệt ký chủ; nhóm ký sinh gây hại bao gồm những loài nấm trực tiếp hoặc gián tiếp gây chết cho ký chủ của nó. Thuật ngữ “nấm côn trùng” (insect-pathogenic fungi hay entomopathogenic fungi) dùng để chỉ giới hạn những loài nấm có thể lây nhiễm côn trùng khỏe mạnh, gây hại hoặc tiêu diệt ký chủ của nó (Samson và cộng sự, 1988) [2]. Ngoài ra, các loài nấm ký sinh gây hại trên nhện hoặc các loài chân khớp khác cũng được xếp vào nhóm nấm côn trùng vì cách thức xâm nhập, gây độc cho ký chủ, sinh sản, sinh bào tử là tương tự nhau.

Nấm côn trùng là thiên địch phổ biến của các loài chân khớp trên khắp thế giới và được xem như là các đối tượng kiểm soát sinh học (Hajek và St. Leger, 1994; Shah và Pell, 2003) [3-4]. Nhóm nấm này có sự phân bố rộng, sự phân bố và tính đa dạng các loài nấm côn trùng tùy thuộc vào điều kiện môi trường, tính đa dạng của các loài côn trùng và tình trạng của ký chủ (Hajek and St. Leger, 1994) [3]. Khu vực có khí hậu nhiệt đới hay ôn đới, đặc biệt ở các nước nhiệt đới có ẩm độ không khí cao, có sự đa dạng và phong phú của các loài côn trùng là điều kiện lý tưởng cho nấm côn trùng phát triển.

Nhiều loài nấm côn trùng đã được ứng dụng rộng rãi trong đấu tranh sinh học kiểm soát dịch hại, trong đó phổ biến là các loài Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Theo McCoy (1990) [5], các tiêu chí quan trọng để các loài nấm côn trùng có thể được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học bao gồm (1) khả năng gây độc cho ký chủ cao, (2) có tác dụng nhanh, (3) có phổ ký chủ rộng, (4) có tính ổn định trong nuôi cấy và bảo quản, (5) dễ dàng lên men chìm, (6) dễ kiểm soát và phân tích số lượng, và (7) an toàn cho con người. Theo Taborsky (1992) [6], ứng dụng đầu tiên sử dụng Metarhizium anisopliae cho đấu tranh sinh học được thực hiện vào năm 1888 bởi Krassilstchik. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng nấm côn trùng phòng trị các loại côn trùng và sâu hại cây trồng, điển hình như nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã được ứng dụng trong phòng trừ mối nhà (Nguyễn Dương Khuê, 2005) [7], sâu khoang hại cải xanh (Võ Thị Thu Oanh và cộng sự, 2005) [8], sâu hại đậu tương và đậu xanh (Phạm Thị Thùy và cộng sự, 2005) [9], rầy mềm và các loài sâu hại lúa (Trần Văn Hai và cộng sự, 2006; Nguyễn Thị Lộc và cộng sự, 2002) [10-11].

Trong y học cổ truyền, Ophiocordyceps sinensis (tên cũ Cordyceps sinensis, tiếng Việt gọi là “Đông Trùng, Hạ Thảo”) được sử dụng như thuốc trị bệnh và bồi bổ cơ thể từ hơn 1000 năm qua tại các nước châu Á, đặc biệt là Trung Quốc và Nhật Bản. Đây là loài nấm sống ký sinh trên sâu bướm thuộc loài Thitarodes armoricanus, và được tìm thấy trên vùng núi có độ cao từ 3000-5000 m tại Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal và Bhutan. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, “Đông Trùng, Hạ Thảo” dùng để chữa các bệnh về phổi và hô hấp, thận, gan, tim mạch; trị bệnh yếu sinh lý và cao huyết áp; trị rối loạn miễn dịch và chống ung thư (Zhou và cộng sự, 1998a,b) [12-13].

Nấm côn trùng còn được ứng dụng trong sản xuất thuốc trị bệnh, các chất có hoạt tính sinh học và các enzym. Cyclosporine là loại thuốc chống thải hồi trong cấy ghép cơ quan được sản xuất từ nấm Tolyplocadium inflatum, là loài vô tính của nấm Cordyceps subsessilis. Các nghiên cứu cũng công bố rằng, cordycepin, hoạt chất chính có trong “Đông Trùng, Hạ Thảo” và các chất có hoạt tính sinh học khác cũng được sản xuất từ một số loài nấm côn trùng (Hung và cộng sự, 2009; Rukachaisirikul và cộng sự, 2004; Isaka và cộng sự 2001; Kittakoop và cộng sự, 1999) [14-17].

Trên thế giới đã có trên 750 loài nấm côn trùng đã được ghi nhận và có rất nhiều loài mới đang và sẽ được công bố. Theo các nghiên cứu, phần lớn số loài nấm côn trùng được ghi nhận ở châu Á, trong đó, Thái Lan có số lượng chủng loại phong phú nhất với 321 loài đã được ghi nhận (Hywel-Jones, 2002) [18], tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có công bố chính thức nào về sự đa dạng và phân bố của nhóm nấm này tại các nước trong khu vực, đặc biệt là tại Việt Nam.

Nghiên cứu này đánh giá sự đa dạng và phân bố của các loài nấm côn trùng tại khu vực phía nam Vườn Quốc gia Cát Tiên, các mẫu nấm côn trùng được thu thập, định danh, phân lập và bảo quản là nguồn nguyên liệu quý giá cho các nghiên cứu và ứng dụng sau này.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Địa điểm và phương pháp thu mẫu

Việc thu mẫu được thực hiện tại bốn khu vực bao gồm khu vực từ văn phòng đến tuyến Bằng Lăng (Khu vực 1), tuyến Bằng Lăng (Khu vực 2), tuyến Cây gõ Bác Đồng (Khu vực 3), và 2 km dọc theo đường chính từ khu Thác Trời đến Bàu Sấu (Khu vực 4) của vườn Quốc gia Cát Tiên, Huyện Tân Phú, Tỉnh Đồng Nai. Thời gian khảo sát từ ngày 6 đến ngày 8 tháng 9 năm 2007. Mẫu nấm thu được được bảo quản riêng biệt trong các hộp nhựa trong và được ký hiệu bằng số thứ tự ITB (viết tắt của “Institute of Tropical Biology”).

Việc phân lập được thực hiện tại nhà khách của Vườn Quốc gia ngay sau các buổi thu mẫu. Mẫu được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi soi nổi Olympus SZ60. Một ít bào tử được tách ra và hòa tan trong 1 giọt nước vô trùng trên phiến kính, sau đó dùng que cấy chuyển qua môi trường thạch khoai tây dextrose (PDA) có bổ sung 100 mg/L kháng sinh Chlortetracycline-HCL và Chloramphenicol, nuôi cấy qua đêm. Sau 5-8 giờ nuôi cấy, bào tử nẩy chồi được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, từng bào tử đơn không bị nhiễm khuẩn hoặc nấm men được tách ra bằng kim nhọn và chuyển sang đĩa PDA khác, mỗi đĩa cấy 8-10 điểm tương ứng với 8-10 bào tử. Các đĩa này sau đó được bảo quản tại phòng thí nghiệm và quan sát dưới kính hiển vi mỗi ngày, loại bỏ phần nhiễm cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần khiết.

Việc phân loại, định danh mẫu đến mức độ chi hoặc loài được thực hiện bằng phương pháp hình thái học dựa trên các đặc điểm về ký chủ, màu sắc, loại bào tử, kích thước và hình dạng bào tử,… sau đó so sánh dựa trên các tài liệu và khóa phân loại đã được xuất bản (Samson và cộng sự, 1988; Kobayashi, 1982; Tzean và cộng sự, 1997; Luangsa-ard và cộng sự, 2007) [2, 19-21].

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Thu thập mẫu nấm côn trùng tại vườn Quốc gia Cát Tiên

Tổng cộng 259 mẫu nấm đã được thu thập trong thời gian khảo sát. Số lượng mẫu thu được tại mỗi khu vực là khác nhau (Hình 1), trong đó, tổng số mẫu thu được ở Khu vực 1 là 73, Khu vực 2 là 156, Khu vực 3 là 16, và Khu vực 4 là 14. Số lượng mẫu khác nhau tại các khu vực không phản ánh về sự đa dạng và phân bố nấm côn trùng tại các khu vực đó. Trong nghiên cứu này, số lượng mẫu thu được tại khu vực 2 nhiều hơn là do địa hình ở đây dể khảo sát và thời gian tập trung thu mẫu tại đây nhiều hơn.

Các mẫu nấm côn trùng thu được được phân bố trên hai môi trường sống chính (sinh cảnh) là trên mặt đất và trên lá cây bụi. Tổng số mẫu thu được trên mặt đất là 39 (tương ứng với tỉ lệ 15%) trong khi tổng số mẫu thu được trên lá cây rừng là 220 (tương ứng với tỉ lệ 85%) (Hình 2).

Các yếu tố ngoại cảnh bao gồm sinh vật và phi sinh vật có ảnh hưởng rất lớn đến sự tiếp xúc, lây nhiễm, phát triển của bào tử nấm trên ký chủ của nó. Các yếu tố phi sinh vật chính bao gồm ẩm độ, nhiệt độ, điều kiện chiếu sang…, các yếu tố sinh vật bao gồm mật độ bào tử nấm, mật độ và sự đa dạng của côn trùng (ký chủ), sự hiện diện của các vi sinh vật khác… Độ đa dạng và dày đặc của các tán cây trong Vườn Quốc gia Cát Tiên là môi trường sống lý tưởng của các loài côn trùng đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho nấm côn trùng phát triển. Theo quan sát, trên mặt đất tại khu vực thu mẫu không được lớp lá rụng bao phủ. Lớp lá rụng dưới mặt đất là môi trường sống của rất nhiều loài côn trùng và là nơi che chắn các điều kiện ngoại cảnh bất lợi cho côn trùng và bào tử nấm phát triển. Do đó, có rất ít mẫu nấm côn trùng được thu trên mặt đất tại các khu vực này.

Kết quả sơ bộ phân loại và định danh hình thái và so sánh với các tài liệu phân loại cho thấy trong tổng số 259 mẫu thu được, có tất cả 17 Chi nấm côn trùng được ghi nhận bao gồm Akanthomyces, Aschersonia, Beauveria, Conoideocrella, Cordyceps, Gibellula, Hirsutella, Hymenostilbe, Hypocrella, Isaria, Metarhizium, Moelleriella, Nomuraea, Ophiocordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticillium. Tất cả các chi ghi nhận được đều thuộc ngành Ascomycota, bộ Hypocreales trong giới Nấm. Số lượng mẫu thu được ở mỗi chi là khác nhau (Hình 3), mẫu Aschersonia thu được nhiều nhất với 72 mẫu (chiếm tỉ lệ 27,8%) kế đến là Isaria (12,7%), Ophiocordyceps (11,2%), Gibellula (10,8%), hai loài hữu tính (teleomorph) của Aschersionia là Moelleriella và Hypocrella có tỉ lệ lần lượt là 10,4% và 10,0%. Hai chi được biết đến trong ứng dụng đấu tranh sinh học là Beauveria và Metarhizium cũng được tìm thấy, tuy nhiên chỉ thu được một mẫu Beauveria và ba mẫu Metarhizium. Ngoài ra còn có 6 mẫu thu được không thể xác định tên do mẫu quá cũ và bị nhiễm loại nấm khác.

Trong 17 chi, có tổng cộng 41 loài nấm côn trùng được ghi nhận. Danh sách tên loài được liệt kê chi tiết ở Bảng 1. Kết quả cho thấy chi Aschersonia có số lượng loài cao nhất với 7 loài. Các loài hữu tính của Aschersonia là Hypocrella và Moelleriella là những loài có ký chủ đặc hiệu là rệp sáp (bộ Homoptera) sống bám trên mặt dưới lá cây. Trên thực tế, số loài nấm côn trùng có thể nhiều hơn nếu việc thu mẫu được lặp lại nhiều lần trong năm, mùa mưa và mùa khô và ở nhiều khu vực khác nhau của Vườn Quốc gia Cát Tiên.

Số loài sinh sản vô tính (anamorph) được ghi nhận có sự khác biệt so với số loài sinh sản hữu tính (teleomorph) (Hình 4). Sự khác biệt giữa vô tính và hữu tính được căn cứ trên phương thức hình thành bào tử. Trong nghiên cứu này, tất cả các loài vô tính có sự hình thành đính bào tử trong khi các loài hữu tính hình thành nang bào tử. Tổng số loài vô tính ghi nhân được là 29 bao gồm tất cả loài thuộc các chi Akanthomyces, Aschersonia, Beauveria, Gibellula, Hirsutella, Hymenostilbe, Isaria, Metarhizium, Nomuraea, Paecilomyces và Verticillium; tổng số loài hữu tính được ghi nhận là 12 gồm tất cả những loài thuộc chi Conoideocrella, Cordyceps, Hypocrella, Moelleriella, Ophiocordyceps và Torrubiella.

Kết quả khảo sát cho thấy có tám bộ côn trùng và nhện được ghi nhận là ký chủ của các loài nấm côn trùng tại Vườn Quốc gia Cát Tiên bao gồm Araneida, Blattaria, Coleoptera, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Lepidoptera và Mantodea (Bảng 1). Kết quả cũng cho thấy rằng một số loài có ký chủ đặc hiệu và chỉ ký sinh trên một lài hoặc họ hàng gần của các loài côn trùng như Ophiocordyceps unilateralis ký sinh trên loài kiến (Camponotus leonardi, bộ Hymenoptera), các loài thuộc chi Isaria ký sinh trên sâu bướm (bộ Lepidoptera), các loài thuộc chi Aschersonia, Hypocrella và Moelleriella có ký chủ là rệp sáp (bộ Homoptera), các loài thuộc chi Gibellula và Nomuraea ký sinh trên nhện (Bộ Araneae).

Số mẫu nấm ký sinh trên côn trùng thuộc bộ Homoptera được thu nhiều nhất với tổng cộng 131 mẫu, tiếp đến là Hymenoptera (39 mẫu) và Aranaea (38 mẫu), trong khi đó chỉ có một mẫu có ký chủ thuộc bộ Blattaria và Mantodea (số liệu không được thể hiện). Kết quả nghiên cứu này không phản ánh được sự đa dạng về ký chủ của một số loài, tuy nhiên có nhiều loài nấm côn trùng có ký chủ đa dạng thuộc nhiều bộ côn trùng khác nhau (Inglis và cộng sự, 2001) [22], ví dụ như Metarhizium spp., Beauveria spp. và Paecilomyces spp.. Các loài thuộc chi Paecilomyces đã được tìm thấy trên các ký chủ thuộc bộ Coleoptera, Homoptera, Lepidoptera, Orthoptera, etc. (Kwong, 2003) [23].

Hình 1: Số lượng mẫu thu được tại bốn khu vực khảo sát.	Hình 2: Sự khác biệt về số lượng và tỉ lệ mẫu trên hai môi trường sống khác nhau.
Hình 3: Số lượng mẫu và số lượng phân lập của mỗi chi nấm côn trùng.	Hình 4: Sự khác biệt về số lượng các chi, loài vô tính và hữu tính.

Việc phân lập được thực hiện ngay sau khi thu mẫu tại thực địa, một số mẫu được phân lập sau đó trong phòng thí nghiệm. 149 mẫu đã được phân lập thành công trong tổng số 259 mẫu thu được. Số lượng mẫu phân lập được của mỗi chi được thể hiện ở Hình 3. Kết quả cho thấy Aschersonia có số lượng phân lập được nhiều nhất tiếp đến là Isaria, Gibellula, Moelleriella và Hypocrella. Có tổng số 22 mẫu của nấm Ophiocordyceps unilateralis được thu thập (số liệu không được thể hiện) tuy nhiên không có mẫu nào được phân lập thành công. Các báo cáo công bố rằng bào tử nang của loài nầy không thể phát triển trên môi trường nuôi cấy thông thường mà cần phải có môi trường dinh dưỡng đặc biệt (Kocharin và Wongsa, 2006; Wongsa và cộng sự, 2005) [24-25].

Vườn Quốc gia Cát Tiên có sự đa dạng về chi, loài nấm côn trùng với tổng số 41 loài thuộc 17 chi ghi nhận được. Nấm côn trùng được phân bố chủ yếu trên lá của những cây bụi, ký sinh trên các ký chủ thuộc tám bộ côn trùng khác nhau. Đa số các loài ghi nhận được ở trạng thái vô tính. Số lượng mẫu nấm phân lập được hiện tại và trong tương lai sẽ là nguồn nguyên liệu quý giá cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học.

Tác giả xin chân thành cảm ơn Viện Sinh học Nhiệt đới và Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan (BIOTEC) đã cung cấp tài chính và phương tiện để hoàn thành nghiên cứu này.

A C B D I K J L M E G F H N O

Hình 6: Một số hình ảnh nấm côn trùng ký sinh trên rệp sáp tại Vườn Quốc gia Cát Tiên. A: Aschersonia badia; B: Aachersonia marginata; C: Aschersonia samoensis; D: Aschersonia oxystoma; E: Aschersonia placenta; F: Aschersonia confluens; G: Hypocrella siamensis; H: Moelleriella raciborskii; I: Hypocrella calendulina; J: Paecilomyces cinnamomeus; K: Conoideocrella tenuis; L: Moelleriella sp.; M: Khuẩn lạc Moelleriella sp. mọc trên môi trường PDA; N: Bào tử nang của Moelleriella sp.; O: Bào tử nang của Moelleriella sp. nẩy mầm trên môi trường sinh ra bào tử thứ cấp.

1 mm 1 mm 1 mm 1 mm A B C D 6 mm 1 cm 1 cm 5 mm 1 cm A B C D K J A B C N D E F G H I J K L M

Hình 6: Một số hình ảnh nấm côn trùng ký sinh trên các ký chủ khác nhau. A: Ophiocordyceps unilateralis, B: Ophiocordyceps myrmecophila; C: Torrubiella sp.2; D: Isaria sp.; E: Paecilomyces lilacinus: F: Isaria tenuipes; G: Gibellula sp.2; H: Gibellula pulchra; I: Gibellula sp.1; J: Nomuraea atypicola; K: Hirsutella formicarum: L: Metarhizium sp.; M: Akanthomyces pistillariiformis; N: Hirsutella citriformis.

1. 
   Evans, H.C.. 1988. Coevolution of entomogenous fungi and their insect hosts. In: K.A. Pirozynski and D.L. Hawksworth (eds.): Coevolution of Fungi with Plants and Animals, Academic Press, London, pp. 149–171.
   
2. 
   Samson, R.A., H.C. Evans, and J.P. Latgé. 1988. Atlas of Entomopathogenic Fungi. Springer-Verlag, Berlin. Heidelberg, New York. 187pp.
   
3. 
   Hajek, A.E. and R.J. St. Leger. 1994. Interactions between fungal pathogens and insect hosts. Annu. Rev. Entomol. 39. 293-322.
   
4. 
   Shah, P.A. and J.K. Pell. 2003. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Appl. Microbiol. Biotech. 61: 413-423.
   
5. 
   McCoy, C.W.. 1990. Entomogenous fungi as microbial pesticides, pp. 139-159. In R.R. Baker, and P.E. Dunn (eds.), New Directions in Biological Control. Alan R. Liss, New York. pp. 139-159.
   
6. 
   Taborsky, V.. 1992. Small-scale processing of microbial pestcides. FAO Agric. Service Bull. 96. Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome.
   
7. 
   Nguyễn Dương Khuê, 2005. Sử dụng nấm Metarhizium anisopliae Sorok. phòng trừ mối nhà (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo phương pháp lây nhiễm. Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ 5. Hà Nội 11-12/04/2005. Trang 409 – 414.
   
8. 
   Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến. 2007. Đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đối vời sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.). Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2. Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Trang 58-63.
   
9. 
   Phạm Thị Thùy, Trần Văn Huy, Nguyễn Duy Mạn. 2005. Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria và Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tương và đậu xanh ở Hà Tĩnh năm 2003-2004. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc. Hà Nội 11-12/4/2005. Trang 494 -497.
   
10. 
    Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân, Phạm Kim Sơn, 2006. Tạo sinh khối và thử nghiệm hiệu lực của một số loại nấm ký sinh trên sâu ăn tạp và rầy mềm hại rau cải tại TP. Cần Thơ. Tạp chí nghiên cứu khoa học, trường ĐHCT.
    
11. 
    Nguyễn Thị Lộc, Võ Thị Bích Chi, Nguyễn Thị Nhàn, Phạm Quang Hưng, Huỳnh Văn Nghiệp, Vũ Tiến Khang và Nguyễn Đức Thành. 2002. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng hai chế phẩm sinh học để quản lý các loài sâu hại lúa. Viện lúa ĐBSCL. Trang 274 – 295.
    
12. 
    Zhu, J.S., G.M. Halpern, and K. Jones. 1998a. The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis. Part I. J. Altern. Complement. Med. 4(3): 289-303.
    
13. 
    Zhu, J.S., G.M. Halpern, and K. Jones. 1998b. The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis. Part II. J. Altern. Complement. Med. 4(4): 429-457.
    
14. 
    Hung, L.T., S. Keawsompong, V.T. Hanh, S. Sivichai and N.L. Hywel-Jones. 2009. Effect of Temperature on Cordycepin Production in Cordyceps militaris. Thai Journal of Agricultural Science. 42(4): 219-225
    
15. 
    Rukachaisirikul, V., S. Pramjit, C. Pakawatchai, M. Isaka, and S. Supothina. 2004. 10-membered macrolides from the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris BCC 2816. J. Nat. Prod. 67: 1953-1955.
    
16. 
    Isaka, M., P. Kongsaeree, and Y. Thebtaranonth. 2001. Bioxanthracenes from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620, II. Structure elucidation. J. Antibiot. 54(1): 36-43.
    
17. 
    Kittakoop, P., J. Punya, P. Kongsaeree, Y. Lertwerawat, A. Jintasirikul, M. Tanticharoen, and Y. Thebtaranonth. 1999. Bioactive naphthoquinones from Cordyceps unilateralis. Phytochemistry. 52(3): 453-457.
    
18. 
    Hywel-Jones, N.L.. 2002. The importance of invertebrate-pathogenic fungi from the tropics. Trop. Mycol. 2: 133-144.
    
19. 
    Kobayashi, Y. 1982. Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella. Trans. Mycol. Soc. Jpn. 23:329–364.
    
20. 
    Tzean, S. S., L. S. Hsieh và W. J. Wu. 1997. Atlas of Entomopathogenic Fungi from Taiwan. Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan, R. O. C. 214pp.
    
21. 
    Luangsa-ard, J.J., Tasanathai, K, Mongkolsamrit, S. and Hywel-Jones, N.L. 2007. Atlas of Invertebrate-Pathogenic Fungi of Thailand, vol. 1. NSTDA publication. Themma Group Co., Ltd. 82 p. ISBN 978-974-229-522-6.
    
22. 
    Inglis, G.D., M.S. Goettel, T.M. Butt, and H. Strasser. 2001. Used of hyphomycetous fungi for managing insect pests. In: Butt T.M., Jackson C., and Magan N. (eds.), Fungi as Biocontrol Agents, CAB International, Wallingford. pp. 23-69.
    
23. 
    Kwong, T.F.N.. 2003. A study of the distribution and molecular phylogeny of arthropod-pathogenic fungi. Ph.D Thesis. City University of Hong Kong. 372pp.
    
24. 
    Kocharin, K. and P. Wongsa. 2006. Semi-defined medium for in vitro cultivation of the fastidious insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis. Mycopathologia 161(4): 255-260.
    
25. 
    Wongsa, P., K. Tasanatai, P. Watts, and N.L. Hywel-Jones. 2005. Isolation and in vitro cultivation of the insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis. Micol. Res. 109(8): 936-940.