ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO


Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)



tải về 1.28 Mb.
trang6/20
Chuyển đổi dữ liệu07.07.2016
Kích1.28 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   20

Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)


Loại chỉ thị AFLP được phát hiện bởi Zabeau Vos (1993) và được mô tả chi tiết bởi Vos và cs. (1995). Các chỉ thị này được dùng như một công cụ đặc trưng để xác định mức độ quan hệ giữa các giống, loài và là nguồn chỉ thị di truyền cho lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các đặc điểm hình thái, năng suất, chất lượng hoặc các locus gen khác [68].

Kỹ thuật AFLP dựa trên sự nhân bản chọn lọc ADN từ hệ gen đã xử lý bằng enzyme giới hạn. Kỹ thuật này gồm bốn bước:

• Cắt ADN hệ gene bằng enzyme giới hạn và gắn các oligonucleotide tiếp hợp (adapter).

• Khuếch đại tiền chọn lọc bằng cặp mồi tiền chọn lọc.

• Khuếch đại chọn lọc sử dụng các tổ hợp mồi EcoRI và MseI chọn lọc khác nhau.

• Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên.

Kỹ thuật này cho phép nhân cùng một lúc một cách đặc trưng với một số lượng lớn các đoạn cắt giới hạn (50 - 100 đoạn). Mỗi đoạn bao gồm một phần cố định dài hơn 15bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một phần thay đổi ngắn 2 - 4bp. Phần cố định dài tạo ra sự ổn định của sản phẩm và phần thay đổi ngắn tạo ra nhiều locus, có thể trên 100 locus với một tổ hợp mồi AFLP. Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hoặc không có mặt của một phân đoạn ADN. Sản phẩm PCR sau đó được phân tách trên gel có độ phân giải trình tự cao và có thể nhìn thấy bằng phóng xạ tự chụp. Nếu không sử dụng nucleotit được đánh dấu phóng xạ, có thể sử dụng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang hoặc nhuộm bạc để quan sát sản phẩm.

Ưu điểm: là một kỹ thuật có độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống [68].

AFLP cho đa hình cao, vì vậy kỹ thuật AFLP hứa hẹn cho phép xem xét kỹ sự đa hình ở một số lượng lớn locus trong một thời gian rất ngắn và đòi hỏi một lượng rất nhỏ ADN. Điều này tạo cho AFLP trở thành một hệ thống chỉ thị lý tưởng cho hàng loạt nghiên cứu di truyền.

Nhược điểm: AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Phương pháp phức tạp, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý số liệu tự động trong quá trình phân tích, giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao [68], [43]



  • Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – ADN đa hình được nhân bội ngẫu nhiên)

Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dùng một mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Vào đầu thập kỷ 90, những người đầu tiên đã thông báo về việc sử dụng các đoạn mồi đơn dài 10 nucleotide và có trình tự tuỳ ý để phân tích đa hình của bộ genome thực vật (khoai tây, lúa mì). Ngày nay kỹ thuật RAPD đã được thống nhất theo phương pháp là sử dụng các đoạn mồi đơn dài từ 9 – 12 nucleotide, tối thiểu là 4 nucleotide, có trình tự ngẫu nhiên.

Điểm khác của RAPD so với các chỉ thị khác là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên. Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào trong hệ gen khi tìm được vị trí bổ sung. Với đặc điểm đoạn được nhân bản là ngắn ( khoảng từ 200 – 2000 nucleotide) nên khả năng đoạn mồi tìm ra được điểm gắn trên ADN khuôn là không quá khó khăn. Theo lý thuyết, số lượng các đoạn ADN được nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí các đoạn mồi, kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc ADN hệ gen. Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được tính đa hình dựa trên các phân đoạn ADN được nhân bản [15], [70].

Nhiệt độ gắn mồi của RAPD không cao (300C – 360C) cho nên sẽ có nhiều đoạn ADN khác nhau được nhân bản.

Các chỉ thị RAPD thường được sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các quần thể, loài sinh vật, giống cây trồng hay các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo giống hoặc phân loại. Đồng thời, chúng cũng được sử dụng như chỉ thị phân tử để xác định kiểu gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở sinh vật.

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD nếu hai cá thể có hệ gen hoàn toàn giống nhau thì khi làm phản ứng PCR – RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho băng ADN giống nhau. Nếu chúng có ít nhiều khác biệt về genome thì với một số mồi sẽ có những băng khác nhau giữa chúng, sự khác nhau này sẽ thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể nghiên cứu [70].

Ưu điểm: Nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích là thấp, không cần biết những thông tin về trình tự, dễ dàng phân tích cho số lượng mẫu lớn.

Nhược điểm: Đây là một kỹ thuật nhạy cảm, phụ thuộc và điều kiện thí nghiệm, các thiết bị nghiên cứu, giai đoạn nghiên cứu. Mặt khác, RAPD là chỉ thị trội nên không thể nhận biết được cá thể dị hợp tử. Khó nhận biết những đoạn cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra từ cùng 1 vị trí trên hệ gen [27].

Để khắc phục những hạn chế này người ta nhân những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế mồi những đoạn dài khoảng 20bp từ cả hai đầu gọi là chỉ thị SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions).



  • Chỉ thị Microsatellite (SSR – Simple Sequence Repeats - sự lặp lại của một trật tự đơn giản).

Trong cơ thể thực vật, hiện tượng lặp lại của một trật nucleotide đơn giản là khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể ít hay nhiều và số lần lặp có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần. Phương thức lặp lại rất phong phú, được chia ra làm 3 kiểu lặp lại sau [145], [34]:

• Lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau).

• Lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác).

• Lặp lại phức tạp (có sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau).

Chỉ thị SSR có hai ưu điểm so với các chỉ thị ADN khác:


  • Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự

sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên

  • Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motip SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau. Do đó phản ứng SSR-PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong cùng một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử của locus đó.

Khác với chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trên các vị trí giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR được phát triển dựa trên trình tự ADN đã biết trước đối tượng nghiên cứu.

Kỹ thuật SSR cho phép ta phát hiện được tính đa hình về chiều dài các trình tự nucleotide đơn giản. SSR dùng để chọn lọc tính trạng kháng bệnh khảm do virut ở cây đậu tương, chọn lọc năng suất lúa, xác lập mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng (cà chua, lúa, đậu tương...) xây dựng bản đồ liên kết. Mặt khác, kỹ thuật còn được sử dụng trong công việc xác định giới tính ở động vật và thực vật [29].

Nhược điểm cơ bản của việc sử dụng chỉ thị này là: tốn công sức, giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình bao gồm việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN trong hệ gen chứa SSR , mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài [27].


  • Một số loại chỉ thị ADN khác

  • Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu)

Chỉ thị STS do M. Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong genome.

STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc trưng này [5] Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR. Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là một mốc trong genom. Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh, sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa [14]. Nhờ đó việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến hành dễ dàng. Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài.



  • Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)

Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, như vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit (Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) [37]. Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã được dùng để tách, lập bản đồ gen kháng và phân tích đa dạng di truyền [31]. Những mồi RGA đã sử dụng cũng tách biệt những giống lúa có hệ gen di truyền Indica từ hệ gen di truyền japonica. Ngoài ra, mối liên kết giữa chỉ thị RGA với gen kháng bệnh rỉ sắt cũng được phát hiện [32]

  • Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn)

 SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất cao nhất trong genome người. Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong genome, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp. Một cặp base ở một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí. Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta gọi vị trí cặp base đó là một SNP. Hiện nay, người ta đã công bố 3 triệu SNP trong genome người, nhiều hơn bất cứ chỉ thị phân tử nào đã được công bố trước đó. Chỉ thị SNP được áp dụng vào đầu những năm 2000, từ genome người cho đến genome các sinh vật khác như­ cây Arabidopsis, cây lúa (Oryza sativa).


: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá thực trạng và ĐỀ xuất giải pháP


1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   20


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương