Nguyên lý
tải về 20.99 Kb.
|
- Điều hướng trang này:
- Ly tâm ở 2.000 vòng/phút trong 10 phút
- Hematocrit để đo tỉ lệ hồng cầu
- 3.2.5 Qui trình thực hiện phản ứng HI
|
3.2.4 Qui trình thực hiện phản ứng HA Nguyên lý: virus Newcastle có khả năng ngưng kết hồng cầu. Khi hồng cầu được rửa sạch sẽ bộc lộ ra những thụ thể bề mặt và virus Newcastle sẽ kết hợp với hồng cầu qua những thụ thể này (Burnet, 1942). Đây là đặc điểm quan trọng để xác định một cách gián tiếp sự hiện diện của virus nhằm định lượng và chuẩn độ kháng nguyên virus Newcastle dùng cho phản ứng HI. Chuẩn bị và bảo quản hồng cầu gà 1%: chọn gà khỏe, chưa tùng tiêm phòng vaccine Newcastle, lấy máu gà cho vào ống nghiệm chứa chất kháng đông alsever, sao cho tỉ lệ máu và chất kháng đông là 3:1. Thêm một lượng nước muối sinh lý theo tỉ lệ nước muối sinh lý và máu là 3:1 vào phần máu vừa lấy, lắc đều. Ly tâm ở 2.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần nước phía trên, sau đó ly tâm lặp lại từ 3 – 4 lần cho đến khi phần nước phía trên trong suốt. Cho một lượng nước muối 0,85% tương đương phần máu đã lấy vào ống nghiệm chứa hồng cầu gà sau khi rửa, lắc đều và dùng Hematocrit để đo tỉ lệ hồng cầu. Pha hồng cầu 1% theo công thức: C1xV1=C2xV2 Trong đó: C1: nồng độ hồng cầu ban đầu. C2: nồng độ hồng cầu cần pha. V1: thể tích hồng cầu ban đầu. V2: thể tích hồng cầu cần pha. Pha hồng cầu bằng nước muối 0,85% và bảo quản hồng cầu ở nhiệt độ 4oC. Thành phần phản ứng: nước muối 0,85%, hồng cầu gà pha loãng 1%, kháng nguyên là vaccine chủng Lasota được pha trong nước muối 0,85%. Tiến hành phản ứng: thực hiện trên đĩa microplate 96 giếng đáy chữ U. Cho 25 µl nước muối 0,85% vào mỗi giếng từ giếng 1 đến giếng 12. Sau đó, cho 25 µl vaccine chủng Lasota vào giếng 1 do đó kháng nguyên đã được pha loãng 1/2 trong nước muối 0,85%. Dùng micropipet trộn đều rồi hút 25 µl của giếng 1 chuyển sang giếng 2 trộn đều, rồi hút 25 µl của giếng 2 sang giếng 3 và tiếp tục làm như thế cho đến giếng 11 rồi hút bỏ đi 25 µl. Giếng thứ 12 được dùng làm đối chứng hồng cầu gồm 25 µl nước muối 0,85% và 25 µl hồng cầu gà 1%. Thêm vào mỗi giếng (từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12) 25 µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ đĩa nhựa bằng tay để trộn đều kháng nguyên và hồng cầu, để ở nhiệt độ 4oC và đọc kết quả sau 30 phút. Bảng 3.4: Trình tự thực hiện phản ứng HA
- Phản ứng dương tính: có hiện tượng ngưng kết hồng cầu (hồng cầu ngưng kết tạo mạng đa chiều không chìm xuống tâm đáy giếng mà dàn trải đều khắp lỗ hoặc nếu chìm chúng cũng tỏa rộng và thường tạo một lớp nhăn nheo khắp mặt đáy giếng. - Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, hồng cầu tụ lại dưới đáy giếng đĩa phản ứng. - Hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên là độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên còn khả năng ngưng kết và được gọi là một đơn vị ngưng kết hay một đơn vị HA. 3.2.5 Qui trình thực hiện phản ứng HI Nguyên lý: khi cho huyết thanh có kháng thể kháng virus có khả năng ngưng kết hồng cầu tương ứng thì sau một thời gian virus sẽ bị trung hòa và mất khả năng ngưng kết hồng cầu. Trong phản ứng này người ta sử dụng lượng kháng nguyên cố định với 4 – 8 đơn vị HA, còn huyết thanh được pha loãng cho đến khi lượng kháng thể có trong huyết thanh không còn đủ khả năng ngăn trở hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Chuẩn bị kháng nguyên 4 đơn vị để làm phản ứng HI: giả sử hiệu giá của kháng nguyên một đơn vị là 1/128 thì kháng nguyên 4 đơn vị sẽ có hiệu giá là 1/32. Pha kháng nguyên 4 đơn vị như sau: lấy 1ml của kháng nguyên thêm 31 ml nước muối 0,85%. Kiểm tra kháng nguyên 4HA đã pha: Tiến hành phản ứng HA nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên là kháng nguyên pha loãng. Dựa vào kết quả đó để bổ sung thêm kháng nguyên hoặc nước muối 0,85% để có kháng nguyên 4HA chuẩn. Thành phần phản ứng: huyết thanh chim trĩ cần kiểm tra, kháng nguyên có 4 đơn vị ngưng kết pha loãng, hồng cầu gà 1%, nước muối 0,85%. Tiến hành phản ứng HI: thực hiện trên đĩa microplate 96 giếng đáy chữ U. Cho 25 µl dung dịch nước muối 0,85% vào mỗi giếng từ giếng 1 đến giếng 12. Tiếp theo, cho 25 µl huyết thanh chim trĩ cần xét nghiệm vào giếng 1, dùng micropipet trộn đều, rồi hút 25 µl sang giếng 2 trộn đều, rồi hút 25 µl chuyển sang giếng 3, làm tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 9, sau đó hút bỏ 25 µl. Cho tiếp vào mỗi giếng 25 µl kháng nguyên, lắc đều, để ở nhiệt độ 4oC trong 30 phút cho kháng thể hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên. Sau đó cho vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 1% và lắc đều, để ở nhiệt độ 4oC cho đến khi hồng cầu trong giếng đối chứng tụ lại thành cụm tròn nhỏ ở đáy giếng. Thực hiện phản ứng đối chứng: giếng thứ 10 và 11 dùng làm đối chứng dương và âm, thực hiện tương tự như các mẫu huyết thanh kiểm tra nhưng thay mẫu huyết thanh cần kiểm tra bằng mẫu huyết thanh dương tính và âm tính chuẩn. Giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu: 25 µl dung dịch nước muối 0,85% và 25 µl hồng cầu gà 1%. Bảng 3.5: Trình tự thực hiện phản ứng HI
Ghi chú: ĐC+: đối chứng dương; ĐC-: đối chứng âm; ĐCHC: đối chứng hồng cầu Đọc kết quả phản ứng Phản ứng dương tính: khi hồng cầu tụ lại thành chấm đỏ ở dưới đáy giếng. Hiệu giá kháng thể được xác định là độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh còn khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, có thể đọc được: Dương tính ở giếng thứ 1 tương ứng với hiệu giá 1/2. Dương tính ở giếng thứ 2 tương ứng với hiệu giá 1/4. Âm tính: hồng cầu bị ngưng kết. tải về 20.99 Kb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||