Nghiên cứu xây dựng quy trình đỊnh lưỢng aflatoxin b1 trong thực phẩm có chứa ngũ CỐC ĐỂ Áp dụng tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm thực phẩm thừa thiên huế

1. MỤC ĐÍCH: Giới thiệu quy trình định lượng aflatoxin B₁ trong các mẫu thực phẩm có chứa ngũ cốc đã được xây dựng và áp dụng tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm thực phẩm Thừa Thiên Huế.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) detector huỳnh quang kết hợp với kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng cột silicagel để tách và làm giàu mẫu.

3. KẾT QUẢ: Quy trình phân tích đạt được độ lặp lại cao (RSD = 3,03%, n = 5), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi từ 80,0 đến 108,3%), giới hạn phát hiện thấp (2,12 ng/ml) và có tương quan tuyến tính tốt giữa diện tích píc và nồng độ aflatoxin B₁ (R = 0,9992). Với quy trình này, có thể áp dụng để kiểm tra độc tố aflatoxin B₁ trong hầu hết các mẫu thực phẩm có chứa ngũ cốc.

4. KẾT LUẬN : Đã xây dựng quy trình định lượng aflatoxin B₁ trong các sản phẩm thực phẩm có chứa ngũ cốc. Quy trình đã được thẩm định và áp dụng tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm thực phẩm Thừa Thiên Huế cho kết quả tốt.

ABSTRACT

ESTABLISHMENT OF AFLATOXIN B₁ IN CEREAL FOOD ANALYTICAL PROCEDURE FOR APPLICATION AT THE DRUG COSMETIC AND FOOD QUALITY CONTROL CENTER OF THUA THIEN HUE PROVINCE

Dang Van Khanh, PhD.^(a), Nguyen Tan Si, MSc.^(a), Hoang Trong Si, PhD.<sup>(b)

(a)</sup> Drug cosmetic and food quality control center of Thua Thien Hue province

^(b) College of Medicine and Pharmacy – Hue university

1. OBJECTIVES: Proposal a procedure for analysis of aflatoxin B₁ contaminated in cereal food samples which is established and applicated successfully at the Drug cosmetic and food quality control center of Thua Thien Hue province.

2. METHODS: A combination of the high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescent detector and the solid phase extraction (SPE) with silicagel column technique has been used.

3. RESULTS: Under suitable conditions, the procedure gained high reproducibility (RSD = 3,03%, n = 5), good accuracy (recovery from 80,0 to 108,3%), low limit of detection (2,12 ng/ml) and good linear correlation between peak area and the aflatoxin B₁ concentration (R = 0,9992). This procedure could be applied to control of aflatoxin B₁ contaminated in most cereal food samples.

4. CONCLUSIONS: The proposal procedure has been applicated successfully at the Drug cosmetic and food quality control center of Thua Thien Hue province for analysis of aflatoxin B₁ contaminated in cereal food samples.
1.ĐẶT VẤN ĐỀ

Các loại thực phẩm có chứa ngũ cốc và các hạt có dầu đều có khả năng nhiễm độc tố aflatoxin B₁ do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus gây nên. Các aflatoxin là những tinh thể màu vàng tan trong một số dung môi hữu cơ (cloroform, methanol, acetone,…) và có độc tính cao, rất bền vững với các tác nhân hóa lý, chỉ bị phân huỷ ở nhiệt độ trên 120⁰C trong môi trường kiềm [3].

Do trong công thức cấu tạo hóa học có vòng dihydrofuran nên aflatoxin B₁ liên kết được với một số enzym làm cản trở sự trao đổi chất. Ngoài ra, aflatoxin B₁ còn có thể tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) gây tổn thương gan và gây ung thư gan. Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng đáng kể sẽ dẫn đến di tật thai nhi hoặc quái thai nặng có thể chết non [3].

Vì vậy, việc kiểm tra các sản phẩm thực phẩm có chứa ngũ cốc có nguy cơ nhiễm aflatoxin B₁ là rất cần thiết. Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế qui định mức giới hạn ô nhiễm aflatoxin B₁ trong thực phẩm dùng cho người lượng không vượt quá 5 ng/ml [4].

Hiện nay quy trình phân tích aflatoxin B₁ trong các mẫu thực phẩm có chứa ngũ cốc theo Tiêu chuẩn Việt Nam sử dụng cột chiết sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp với việc tạo dẫn xuất sau cột [5]. Phương pháp này tuy có độ nhạy cao, nhưng phải qua nhiều giai đoạn, khó thao tác, tốn kém thời gian, chi phí phân tích cao.

Trong bài báo này chúng tôi giới thiệu quy trình định lượng aflatoxin B₁ trong các mẫu thực phẩm có chứa ngũ cốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng cột silicagel để tách và làm giàu mẫu, đã được xây dựng và áp dụng tại trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm thực phẩm Thừa Thiên Huế (TTKN).

- Cân phân tích điện tử AUX 220, Shimadzu, Nhật Bản.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Series 20A detector huỳnh quang, Shimadzu, Nhật Bản.

- Các thiết bị khác: tủ sấy, thiết bị lọc nước siêu sạch, máy cất nước hai lần.

- Các dụng cụ thủy tinh chính xác như bình định mức, pipet, ... loại class A.

- Micropipet các loại 0,5 ÷ 10 l, 10 ÷ 100 l, 100 ÷ 1000 l.

- Chuẩn Aflatoxin B₁ của Supelco có nồng độ 1 µg/ml.

- Các hóa chất, silicagel, bột celitte, các loại dung môi của Merck loại dùng cho HPLC.

Các loại thực phẩm có chứa ngũ cốc được kiểm nghiệm tại TTKN năm 2008 và 2009.

- Cột phân tích pha đảo C18 (250mm×4,6mm; 5µm).

- Detector huỳnh quang: _ext = 360nm; _em = 450 nm.

- Pha động (acetonitril : methanol : nước) =  22,5 : 22,5 : 55,0

- Tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

- Thể tích tiêm 20 µl.

- Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn trong dung môi methanol có nồng độ aflatoxin B₁ = 0,015 µg/ml.

- Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 50,0g mẫu đã nghiền nhỏ cho vào bình nón nút mài, thêm 200 ml cloroform (đối với mẫu có chứa chất béo, thêm 10g celitte để loại béo). Lắc siêu âm 45 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc được cô quay ở nhiệt độ 40⁰C, đến còn khoảng từ 5 đến 10 ml. Cho dịch thu được qua cột chiết pha rắn silicagel với tốc độ 1,0ml / phút. Loại tạp lần lượt với 150 ml benzen, 150 ml dietylether. Rửa giải aflatoxin B₁ bằng 100 ml hỗn hợp cloroform: methanol = 97 : 3 và cô quay đến cạn. Hoà tan cắn bằng 1ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45µm, chạy sắc ký trên máy HPLC.

* Chuẩn bị cột chiết pha rắn silicagel: Cho 5g natri sulfat khan (Na₂SO₄) vào cột chiết chuyên dụng, thêm cloroform tới ½ thể tích cột, cho 10g silicagel vào, rửa thành ống bằng 20ml cloroform, cho tiếp 5g Na₂SO₄ khan, rồi thêm từ từ dung dịch cloroform vào cột tới cách đỉnh Na₂SO₄ 1cm, lưu ý giữ cho cột không bị khô trong suốt quá trình thử (hình 1).


Hình1: Cột SPE nhồi Silicagel

Hình 2. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu

3.KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử

Với điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu được cho pic aflatoxin B₁ cân đối, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu chuẩn (hình 3a). Trên sắc ký đồ của mẫu thử (kẹo mè đen, hình 3b) có xuất hiện píc có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic aflatoxin B₁ trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn (t_R  7,6 phút).

Pha một dãy 5 dung dịch chuẩn aflatoxin B₁ trong methanol có nồng độ từ 2,0 ng/ml đến 20,0 ng/ml. Tiến hành sắc ký với các điều kiện như đã nêu ở mục 2.3. Kết quả được ghi ở bảng 1 cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính tốt giữa nồng độ aflatoxin B₁ với diện tích píc của chúng, R = 0,9992. (bảng 1).

Tiến hành định lượng 5 mẫu thử kẹo mè đen được thêm chính xác một lượng dung dịch chuẩn aflatoxin B₁, chuẩn bị mẫu như ở mục 2.4. Độ lặp lại được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 5 kết quả định lượng. Các kết quả và số liệu thống kê trong bảng 2 chỉ ra quy trình phân tích có độ lặp lại tốt (RSD = 3,03%, n = 5).

Tiến hành thêm chuẩn aflatoxin B₁ vào mẫu thử kẹo mè đen đã xác định hàm lượng aflatoxin B₁ trên (3 nống độ 16, 20, 24 ng/ml). Tiến hành chiết và xác định hàm lượng aflatoxin B1 theo quy trình đã xây dựng, tính tỷ lệ thu hồi (recovery). Kết quả ghi ở bảng 3.

Tiến hành đánh giá quy trình phân tích đã nghiên cứu đối với các mẫu có chứa ngũ cốc khác như kẹo mè xửng, kẹo đậu phụng, bột bắp, ... cũng cho các kết quả tương tự.

Giới hạn phát hiện (LOD) là lượng thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính. Giới hạn định lượng (LOQ) là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử, có thể phát hiện được về mặt định lượng, với độ đúng và độ chính xác thích hợp. Giới hạn định lượng được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện.

Xác định giới hạn phát hiện của chất cần phân tích theo công thức sau [1]:

Trong đó, C_LOD là nồng độ giới hạn phát hiện (µg/ml), t_ là giá trị tra bảng student với độ tin cậy 99%, bậc tự do (n-1), SD là độ lệch chuẩn giữa các mẫu thử, M là hệ số góc của phương trình hồi qui tuyến tính.

Tiến hành thực nghiệm trên 7 mẫu thử. Thêm dung dịch chuẩn aflatoxin B₁ vào từng mẫu thử sao cho nồng độ cuối cùng tương ứng với khoảng nồng độ thấp nhất của đường tuyến tính. Phân tích theo quy trình đã đề xuất, xác định giá trị SD của diện tích píc. Tính nồng độ giới hạn phát hiện theo công thức đã nêu.

- Giới hạn phát hiện (LOD) thu được: 2,12 ng/ml

- Giới hạn định lượng (LOQ) thu được: 6,99 ng/ml

Với giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng này, cho phép phát hiện và xác định hàm lượng aflatoxin B₁ trong các loại thực phẩm có chứa ngũ cốc.

Ứng dụng quy trình phân tích trên để kiểm tra 115 mẫu các sản phẩm thực phẩm có chứa ngũ cốc được kiểm nghiệm tại TTKN trong 2 năm 2008 và 2009, như: kẹo lạc, bánh bột nếp, bánh đậu xanh, kẹo mè đen… Kết quả kiểm nghiệm được cho ở bảng 4.

Đã xây dựng quy trình định lượng aflatoxin B₁ trong các sản phẩm thực phẩm có chứa ngũ cốc. Quy trình có độ lặp lại tốt (RSD = 3,03%, n = 5), giới hạn phát hiện thấp (LOD = 2,12 ng/ml) và tương quan tuyến tính tốt (R = 0,9992 trong khoảng nồng độ 2,0 ÷ 20,0 ng/ml). Với quy trình này có thể áp dụng để kiểm tra độc tố aflatoxin B₁ trong tất cả các mẫu thực phẩm có chứa ngũ cốc.

Đã áp dụng quy trình vào việc kiểm tra 155 mẫu thực phẩm có chứa ngũ cốc tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm thực phẩm Thừa Thiên Huế. Qua kết quả kiểm tra đã phát hiện 8,3% số mẫu vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Bùi Minh Đức, Tô Việt Bắc,Trần Quang, Bùi Thị Thanh Hà, Phan Thị Kim (2001), “Đánh giá hàm lượng aflatoxin ăn vào qua khẩu phần ăn của nhân dân Việt Nam”, Tạp chí phân tích hoá, lý và sinh học số 3.2001, tập 6, trang 18 – 21.

[2]. Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Việt Hà (2008), “Nghiên cứu xác định hàm lượng aflatoxin G₁, G₂, B₁, B₂ ô nhiễm trong một số dược liệu chứa nhiều tinh bột bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao”,Tạp chí kiểm nghiệm thuốc số 2 .2008, tập 6 - số 20, trang 10 – 14.

[3]. Lâm Thanh Hiền (2008),“Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin B₁ trong bắp và đậu phộng bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng”, Đại học Hùng Vương – TPHCM, Khoa công nghệ sau thu hoạch.

[4].Bộ Y tế (2008), Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007, “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm”, Nhà xuất bản Hà Nội – 2008.

[5]. Bộ Khoa học và Công nghệ (2004), Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7404 : 2004, “Ngũ cốc, đậu đỗ và hạt có dầu – Xác định Aflatoxin bằng phương pháp sử dụng cột ái lực miễn dịch”.