Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và đánh giá sự biểu hiện của các gene vạn tiềm năng đặc trưng của tế bào gốc phôi bò

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Mã số: 62 42 30 01

Họ tên nghiên cứu sinh: Lê Thành Long

Khóa đào tạo: 2012

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn, PGS.TS.BS. Huỳnh Nghĩa

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG.HCM

1. TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN ÁN:

Mục tiêu của luận án là phân lập, nuôi cấy và đánh giá sự biểu hiện của các gene vạn tiềm năng đặc trưng của tế bào gốc phôi bò. Nghiên cứu này đã cải thiện chất lượng phôi bò bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm với môi trường dịch ống dẫn trứng biến đổi Sofaa bổ sung nhân tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF) với nồng độ là 10³ IU/ml. Khối tế bào nội phôi (ICM) bò giai đoạn phôi nang được phân lập một cách hiệu quả bằng phương pháp xử lý phôi nang với enzyme pronase nồng độ 5 mg/ml qua hai bước: bước một là loại bỏ zona pellucida của phôi nang với pronase 5 mg/ml, bước hai là xử lý phôi nang trần với pronase 5 mg/ml cho đến khi loại bỏ lớp dưỡng bào. Nghiên cứu này xác định được môi trường phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào gốc phôi bò bao gồm Knock-out DMEM chứa 20 % Knock-out Serum Replacement, 1 % pen/strep, 200 µM mercaptoethanol, 1 % L-glutamine, 1 % Non-essencial amino acid, 1 % nucleoside, 10³ IU/ml LIF. Môi trường này giúp duy trì sự biểu hiện của các gene vạn tiềm năng như Oct4 và Nanog, từ đó giúp duy trì tính vạn tiềm năng và khả năng tự làm mới của tế bào gốc phôi bò. Các quần thể tế bào gốc phôi bò đều biểu hiện marker alkaline phosphatase. Quá trình biểu hiện của Nanog và Sox2 giảm qua các lần cấy chuyền. Ngược lại, sự biểu hiện của Oct4 và C-myc của tế bào gốc phôi bò lại tăng ở lần cấy chuyền thứ ba. Các marker đặc trưng cho giai đoạn phôi SSEA1 và SSEA4 cũng biểu hiện trong quần thể tế bào gốc phôi bò, tuy nhiên SSEA1 giảm biểu hiện ở lần cấy chuyền thứ ba. Quá trình methyl hóa vùng CpG của gene Oct4 và Nanog tăng ở lần cấy chuyền thứ ba. Quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ nhất và thứ ba đều có khả năng biệt hóa thành thể phôi. Các thể phôi này biểu hiện các marker đặc trưng cho ba lớp mầm phôi là nội bì (Sst, Afp), trung bì (Ucp2, Hbz) và ngoại bì (Nes).

2. NHỮNG KẾT QUẢ MỚI CỦA LUẬN ÁN:

- Phương pháp xử lý hai bước phôi bò giai đoạn phôi nang với pronase 5mg/ml hiệu quả cho việc phân lập và nuôi cấy ICM.

- Sự biểu hiện của một số gene vạn tiềm năng Nanog, Sox2 giảm và Oct4, C-myc tăng qua các lần cấy chuyền khác nhau.

- Tế bào gốc phôi bò biểu hiện cả hai marker đặc trưng cho giai đoạn phôi là SSEA1 và SSEA4.

3. CÁC ỨNG DỤNG/ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG THỰC TIỄN HAY NHỮNG VẤN ĐỀ CÒN BỎ NGỎ CẦN TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU:

Kết quả của nghiên cứu này có thể được áp dụng để cải thiện khả năng nuôi cấy phôi bò giai đoạn phôi nang, giúp tạo nguồn phôi tốt cho việc phân lập và nuôi cấy ICM. Hiện nay việc nghiên cứu tế bào gốc phôi của nhóm động vật móng guốc nói chung và của bò nói riêng còn nhiều hạn chế do những cơ chế đặc thù loài. Việc duy trì dòng tế bào gốc phôi bò có thể cấy chuyền từ 50 đến 70 lần còn gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc tìm ra được phương pháp duy trì lâu dài mà không thay đổi đặc tính vạn tiềm năng của tế bào gốc phôi bò vẫn còn bỏ ngỏ và thách thức, đặc biệt là việc nghiên cứu các con đường tín hiệu đặc thù của tế bào gốc phôi bò đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì này.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn, PGS.TS.BS. Huỳnh Nghĩa

NGHIÊN CỨU SINH Lê Thành Long

XÁC NHẬN CỦA CƠ SỞ ĐÀO TẠO

PHÓ HIỆU TRƯỞNG

THESIS INFORMATION
Thesis title: “Isolation, culture and assessing of the pluripotent genes of bovine embryonic stem-like cells”

Speciality: Human and Animal Physiology

Code: 62 42 30 01

PhD Student: Lê Thành Long

Academic year: 2012

Supervisor: Assoc. Prof. Hoàng Nghĩa Sơn PhD., Assoc. Prof. Huỳnh Nghĩa PhD. MD.

At: UNIVERSITY OF SCIENCE – VNU.HCMC

1. ABSTRACT:

The thesis aimed to isolate, culture, and assess the pluripotent gene expression of bovine embryonic stem-like cells. The quality of bovine embryo was enhanced using the Sofaa medium supplemented leukemia inhibitory factor 10³ IU/ml. This factor increased the cell number in blastocyst and inner cell mass. The inner cell mass of bovine blastocyst was facilitated to isolate using replicated treatment of 5 mg/ml pronase: firstly, the zona pellucida was removed using 5 mg/ml pronase; then the trophoblast of zona-free blastocyst was subsequently removed using 5mg/ml pronase. The effective medium was used for bovine embryonic stem-like cells culture including Knock-out DMEM supplemented 20 % Knock-out Serum Replacement, 1 % pen/strep, 200 µM mercaptoethanol, 1 % L-glutamine, 1 % Non-essential amino acid, 1 % nucleoside, 10³ IU/ml LIF. This medium improved the Oct4 and Nanog transcript expression, thus maintaining the pluripotency and renewal of bovine embryonic stem like-cells. The bovine embryonic stem like-cells expressed alkaline phosphatase. The Nanog and Sox2 transcript expression were down-regulated and the Oct4 and C-myc transcript expression ware up-regulated during bovine embryonic stem like-cells passing. The bovine embryonic stem-like cells express both of stage-specific embryonic antigen 1 and stage-specific embryonic antigen 4. However, the stage-specific embryonic antigen 1 was down-regulated in the third passage. The CpG island methylation of Oct4 and Nanog were increased during cell passing. The bovine embryonic stem like-cells differentiated to embryoid body which expressed markers of three germ layers including endoderm (Sst, Afp), mesoderm (Ucp2, Hbz) and ectoderm (Nes).
2. NEW RESULTS FROM THE THESIS:

- Bovine inner cell mass were efficiently isolated and cultured using replicated treatment of using 5 mg/ml pronase from blastocyst.

- The Nanog and Sox2 expression were down-regulated and the Oct4 and C-myc expression ware up-regulated during bovine embryonic stem like-cells passing.

- The bovine embryonic stem cells express both of stage-specific embryonic antigen 1 and stage-specific embryonic antigen 4.

3. APPLICATION AND FURTHER RESEARCH

The results of this thesis could be applied to improve bovine blastocyst embryo development in pre-implantation stage. The cell number of blastocyst was enhanced with leukemia inhibitory factor that facilitates ICM isolation and culture from blastocyst. The current study of embryonic stem-like cells of ungulate animals has been still limited due to the species-specific mechanism. There are a lot of difficulties to maintain bovine embryonic stem cells for long-term culture. Thus, the long-term bovine embryonic stem cell establishment is challenged. The further research of signaling pathway should be carried out to prolong the pluripotency and renewal of bovine embryonic stem cells.