MỤc lụC ĐẶt vấN ĐỀ



tải về 370.03 Kb.
trang3/4
Chuyển đổi dữ liệu19.07.2016
Kích370.03 Kb.
1   2   3   4

Giữ mẫu ở 40C

2.2.3. Điện di sản phẩm PCR

+ Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 12cm):

Nước cất khử ion: 22,2ml

10X TBE: 1,5ml

Dung dịch acrylamide 40%: 6ml

Dung dịch APS 10%: 300µl

Dung dịch TEMED: 25µl

Tổng thể tích gel: 30ml

Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính.

+ Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker X174 có trọng lượng chuẩn (ΦX174ADN/HinfI, 20g/µl) ở điều kiện 150V.

Thời gian điện di khoảng 50 - 60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.



      1. Phân tích và xử lí số liệu

Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng lúa, các kết quả thu được từ quá trình điện di sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN nhờ khuếch đại bằng PCR.

  • Số 1: các allele có xuất hiện băng ADN

  • Số 0: các allele không xuất hiện băng ADN

  • Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các allele (mất số liệu)

Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi.

- Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau:

PIC=1- Pi2

Trong đó: Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i

Sau đó, số liệu được chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 [47] để phân tích, tìm ra hệ số tương đồng di truyền (Jaccard) và thành lập cây quan hệ phát sinh.

- Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi giống lúa được tính theo công thức:

H% =

Trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện nhiều hơn 1 băng ADN/1 locus SSR

Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN

29 là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu

- Tính tỷ lệ số mồi không xuất hiện băng ADN (M%) bằng công thức:

M% =

Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng ADN

29 là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 1%





Hình 1:Ảnh điện di ADN tổng số của các giống lúa kháng đạo ôn

Qua kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy rằng các băng ADN tổng số của các giống lúa kháng đạo ôn thu được gọn, sáng đồng đều, không đứt gẫy hay lẫn tạp. Nồng độ ADN cao, đủ tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng PCR và các thí nghiệm tiếp theo .



3.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng mồi

Theo Smith và cộng sự (1997), hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo tính đa dạng di truyền của các allele ở từng locus SSR. Weir (1996) cho rằng, giá trị PIC có thể được hiểu như là sự đa dạng di truyền của locus gen nghiên cứu [52], [61].



Qua kết quả thu được ở bảng 3 cho thấy rằng, giá trị PIC của 29 marker thay đổi từ 0,34 (RM261 - 3 allele) đến giá trị PIC cao nhất là 0,85 (RM302 - 8 allele và RM340 - 9 allele). Hệ số PIC trung bình của 29 cặp mồi nghiên cứu khá cao (0,71).
Bảng 3: Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng mồi

TT

Tên mồi

Vị trí trên NST

Số allele

PIC

TT

Tên mồi

Vị trí trên NST

Số allele

PIC

1

RM13

5

6

0,74

16

RM224

11

6

0,75

2

RM17

12

5

0,69

17

RM241

2

5

0,76

3

RM229

1

7

0,76

18

RM245

9

5

0,78

4

RM282

3

6

0,70

19

RM257

9

5

0,73

5

RM135

3

4

0,70

20

RM261

4

3

0,34

6

RM138

2

5

0,73

21

RM270

12

7

0,77

7

RM142

4

6

0,78

22

RM345

6

3

0,47

8

RM143

3

5

0,67

23

RM286

11

8

0,79

9

RM153

5

7

0,79

24

RM302

1

8

0,85

10

RM156

3

4

0,64

25

RM310

8

7

0,83

11

RM161

5

5

0,75

26

RM323

1

3

0,60

12

RM162

6

6

0,81

27

RM337

8

7

0,76

13

RM171

10

5

0,79

28

RM340

6

9

0,85

14

RM172

7

4

0,66

29

RM341

2

8

0,82

15

RM174

2

3

0,42

Tổng

162

20,74

Trung bình

5,58

0,71

Phân tích 29 mồi SSR trên tập đoàn 34 giống lúa kháng đạo ôn thu được 162 loại allele với 956 băng ADN, trong đó không có mồi nào cho allele đơn hình.

- Các mồi thu được 3 allele: gồm 4 mồi (RM174, RM261, RM345, RM323)

- Các mồi thu được 4 allele: gồm 3 mồi (RM135, RM156, RM172)

- Các mồi thu được 5 allele: gồm 8 mồi (RM17, RM138, RM143, RM161, RM171, RM241, RM245, RM257)

- Các mồi thu được 6 allele: gồm 5 mồi (RM13, RM282, RM142, RM162, RM224)

- Các mồi thu được 7 allele: gồm 5 mồi (RM229, RM153, RM270, RM310, RM337).

- Các mồi thu được 8 allele: gồm 3 mồi (RM286, RM302, RM341).

- Các mồi thu được 9 allele: gồm duy nhất một mồi RM340.



3.3. Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ số liệu khuyết (M%) của các giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu

Qua kết quả thu được ở bảng 4 cho thấy rằng, tỷ lệ đồng hợp và dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác biệt và rõ ràng. Tỷ lệ dị hợp tử (H%) cao nhất ở giống lúa Nếp cái đỏ với tỷ lệ 13,79%, tiếp theo là giống Plẩu tâu đằng dạng 2 với tỷ lệ dị hợp 11,11%. Giống lúa length có tỷ lệ dị hợp 6,9%. Giống lúa Đất tam Đăng có tỷ lệ dị hợp 3,85%. Giống lúa San pa toong có tỷ lệ dị hợp 3,7%. Các giống lúa Khẩu giăng căm, Nếp lùn, Khẩu tan nhe, OM5471 đều có tỷ lệ dị hợp 3,57%. Các giống lúa Đle tư, Ple lia đều có tỷ lệ dị hợp 3,45%. Còn lại 25 giống có tỷ lệ dị hợp tử 0% có nghĩa là các dòng này đều đồng hợp ở cả 29 mồi nghiên cứu (chỉ có 1 allele duy nhất/locus). Tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 1,57%.



Bảng 4: Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ số liệu khuyết (M%)

của các giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu

TT

Tên dòng

M%

H%

TT

Tên dòng

M%

H%

1

Tan lanh

3,57

0,00

18

Plẩu tâu đằng dạng 2

7,41

11,11

2

Nếp nương cẩm

0,00

0,00

19

Nếp cái đỏ

0,00

13,79

3

Nếp râu

3,57

0,00

20

Đle tư

0,00

3,45

4

I mèo

0,00

0,00

21

Nếp lùn

3,57

0,00

5

Lâu châu plat

7,41

0,00

22

Kháu hạng khoai

0,00

0,00

6

San pa toong

7,41

3,70

23

Ple lia

0,00

3,45

7

Đle la tong

3,57

0,00

24

Khẩu lếch

7,41

0,00

8

Đle te lo

3,57

0,00

25

Khẩu tan nhe

3,57

3,57

9

Đ'le p'lu

0,00

0,00

26

Kháu hút đạnh

7,41

0,00

10

Lúa venth

3,57

0,00

27

Kháu mặc Đuộc

0,00

0,00

11

Lúa length

0,00

6,90

28

Plề chớ

7,41

0,00

12

Nếp cẩm

7,41

0,00

29

Đất tam Đăng

11,54

3,85

13

Chiêm ngân

3,57

0,00

30

Ló đếp cẩm

7,41

0,00

14

Chiêm nhỡ Đắc Ninh 2

3,57

0,00

31

OM5471

3,57

0,00

15

Khẩu giăng căm

3,57

3,57

32

OM5629

0,00

0,00

16

Đ'le la

0,00

0,00

33

OM8923

0,00

0,00

17

Lúa gốc đỏ

0,00

0,00

34

OM6377

0,00

0,00
















Trung bình

3,24

1,57

Tỷ lệ số liệu khuyết (M%) cao nhất ở giống lúa Đất tam Đăng với tỉ lệ 11,54% (khuyết số liệu ở 3 mồi). Các giống Lâu châu plat, San pa toong, Nếp cẩm, Plẩu tâu đằng dạng 2, Khẩu lếch, Kháu hút đạnh, Plề chớ và Ló đếp cẩm có tỉ lệ khuyết số liệu là 7,41% (khuyết số liệu ở 2 mồi). Các giống Tan lanh, Nếp râu, Đle la tong, Lúa venth, Chiêm ngân, Chiêm nhỡ Đắc Ninh 2, Khẩu giăng căm, Nếp lùn, Khẩu tan nhe, OM5471 có tỉ lệ khuyết số liệu là 3,57% (khuyết số liệu ở 1 mồi). Còn lại 14 giống không bị khuyết số liệu ở tất cả các mồi.

3.4. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu



Hình 2: Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi RM224


Hình 3: Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi RM257


Hình 4: Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi RM261

Số liệu thu được từ bản điện di 29 mồi SSR của tập đoàn 34 giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền (bảng 5) và xây dựng sơ đồ phát sinh chủng loại (hình 5).

Qua kết quả thu được ở bảng 5 và hình 5 cho thấy: hệ số tương đồng di truyền của 34 giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,00 (ở giống Kháu hạng khoai và giống OM 5629) đến 0,69 (ở hai giống Kháu hạng khoai và Ple lia). Từ sơ đồ phát sinh chủng loại, xét ở hệ số tương đồng di truyền 19%, tổng số 34 giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu được chia thành 6 nhóm như sau:

* Nhóm I: Gồm duy nhất một giống Tan lanh

* Nhóm II: Gồm có 5 giống: Plề chớ, Đất tam Đăng, OM5471, OM5629, OM8923, OM6377. Hệ số tương đồng di truyền trong nhóm này dao động từ 0,17 (giữa giống Plề chớ và OM8923) đến 0,53 (giữa giống OM5629 và OM8923)

* Nhóm III: Gồm có 10 giống được chia thành 2 nhóm phụ



- Nhóm phụ III.1: gồm 6 giống: I mèo, San pa toong, Lâu châu plat, Chiêm ngân, Chiêm nhỡ Đắc Ninh 2, Nếp cẩm. Nhóm phụ này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,1 (I mèo và Lâu châu plat) đến 0,5 (Chiêm ngân và Chiêm nhỡ Đắc Ninh 2).

- Nhóm phụ III.2: gồm 4 giống: Lúa length, Đ'le la, Lúa gốc đỏ, Nếp lùn. Nhóm phụ này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,18 (Lúa length và Lúa gốc đỏ; Lúa length và Nếp lùn) đến 0,36 (Lúa length và Đ'le la).

* Nhóm IV: gồm 6 giống: Nếp nương cẩm, Nếp râu, Đle la tong, Đ'le p'lu, Đle te lo, Lúa venth. Hệ số tương đồng di truyền trong nhóm này dao động từ 0,15 (giữa giống Nếp râu và Lúa venth) đến 0,60 (giữa giống Đle la tong và Đ'le p'lu).

* Nhóm V: gồm 10 giống: Khẩu giăng căm, Plẩu tâu đằng dạng 2, Nếp cái đỏ, Đle tư, Kháu hạng khoai, Ple lia, Khẩu lếch, Khẩu tan nhe, Kháu hút đạnh, Kháu mặc Đuộc. Trong nhóm này, hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,13 (giữa giống Plẩu tâu đằng dạng 2 và Kháu hút đạnh) đến 0,69 (giữa giống Kháu hạng khoai và Ple lia).

Xét tại vị trí có hệ số tương đồng di truyền là 0,28, nhóm này có thể được chia thành 3 nhóm phụ như sau:

- Nhóm phụ V.1: gồm duy nhất giống Khẩu giăng căm

- Nhóm phụ V.2: gồm 2 giống Plẩu tâu đằng dạng 2 và Nếp cái đỏ có hệ số tương đồng di truyền với nhau là 0,36.

- Nhóm phụ V.3: gồm 7 giống: Đle tư, Kháu hạng khoai, Ple lia, Khẩu lếch, Khẩu tan nhe, Kháu hút đạnh, Kháu mặc Đuộc. Nhóm phụ này có hệ số tương đồng cao nhất trong tập đoàn 34 giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu là 0,69. Hệ số tương đồng di truyền thay đổi trong khoảng từ 0,17 đến 0,69.

* Nhóm VI: gồm duy nhất giống Ló đếp cẩm.





Hình 5: Sơ đồ phát sinh chủng loại của các giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu

Bảng 5: Hệ số tương đồng di truyền của các giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu



IV. KẾT LUẬN

Kết quả phân tích 29 cặp mồi SSR với tập đoàn 34 giống lúa kháng đạo ôn thu được tổng số 162 loại allele. Hệ số PIC của 29 cặp mồi thay đổi từ 0,34 (ở mồi xuất hiện 3 allele - RM261) đến giá trị PIC cao nhất là 0,85 (ở mồi xuất hiện 8 allele - RM302 và ở mồi xuất hiện 9 allele - RM340). Hệ số PIC trung bình của 29 cặp mồi nghiên cứu khá cao là 0,71.



Có 25 giống lúa có tỷ lệ dị hợp tử 0% có nghĩa là các dòng này đều đồng hợp ở cả 29 mồi nghiên cứu (chỉ có 1 allele duy nhất/locus).Tỷ lệ dị hợp tử (H%) cao nhất ở giống lúa Nếp cái đỏ với tỷ lệ 13,79%. Tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 1,57%. Tỷ lệ số liệu khuyết (M%) cao nhất ở giống lúa Đất tam Đăng với tỉ lệ 11,54% (khuyết số liệu ở 3 mồi). 14 giống lúa không bị khuyết số liệu ở tất cả các mồi. Ở hệ số tương đồng 19%, Tổng số 34 giống lúa kháng đạo ôn trong nghiên cứu được phân chia thành 6 nhóm, trong đó các nhóm I và nhóm VI đều chỉ có một mẫu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

  1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2001), "Nguồn tài nguyên di truyền cây lúa", Cây lúa Vit Nam thế k 20, Tp I, NXB Nông nghiệp: 117-172.

  2. Nguyễn Mạnh Cường và Nguyễn Thị Lang (2004), "Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR và STS để chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn", Tp chí Nông nghip và phát trin nông thôn (12/2004): 1669-1672.

  3. Lê Xuân Đắc, Bùi Văn Thắng, Lê Trần Bình, Lê Duy Thành, Lê Thị Muội (2003), “Đánh giá đa dạng di truyền của một số giống lúa Tám ở Việt Nam”, Tp chí Công ngh Sinh hc 1 (4): 493-501.

  4. Nguyễn Thị Phương Đoài, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thúy Điệp, Hà Minh Loan, Trần Danh Sửu, Đặng Trọng Lương (2010). Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa nếp và lúa nương bản địa Việt Nam bằng chỉ thị phân tử SSR. Tạp chí Công nghệ sinh học 8(3): 337-343.

  5. Đặng Quang Hào, Nguyễn Thị Lang (2006), "Ứng dụng microsatellite markers để đánh giá bệnh bạc lá trên lúa địa phương (Oryza Sativa L.)", Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn (12/2006): 19-24.

  6. Trần Văn Minh (2004) (Chủ biên), Giáo trình cây lương thc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

  7. Trần Danh Sửu, Lưu Ngọc Trình (2001), "Sử dụng chỉ thị DNA để nghiên cứu quan hệ di truyền tiến hoá của lúa địa phương các vùng Tây Bắc và Tây Nam nước ta" Thông tin công ngh sinh hc ng dng số 1/2001. Tr. 25-29. Viện Di truyền nông nghiệp.

  8. Trần Danh Sửu, Đỗ Đức Tuyến, Lưu Ngọc Trình, Nguyễn Thị Ngọc Huệ (2004), "Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa do nông dân đặt tên (Oryza sativa) trên cơ sở phân tích đẳng men", Bo tn ni vi tài nguyên cây trng vì s phát trin bn vng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Tr. 54-60

  9. Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa, Hà Minh Loan, Ngô Kim Hoài, Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Mạnh Hải (2011). Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nếp địa phương ở các tỉnh đồng bằng bắc bộ bằng chỉ thị SSR. Tạp chí Công nghệ sinh học.

  10. Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

  11. Tổng cục Thống kê (2010) Niên giám thống kê năm 2010, NXB Thống kê, Hà Nội.

  12. : phenotype -> upload -> article
    article -> MỤc lục báo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 7)
    article -> Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh LỜi cảM ƠN
    article -> BÁo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 5)
    article -> 1. 1 Vài nét sơ lược về cây lú
    article -> ĐẶt vấN ĐỀ 2 I. TỔng quan nghiên cứU 3
    article -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr
    article -> MỤc lụC 1 Triệu chứng bệnh 4
    article -> Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng
    article -> Xanthomonas oryzea pv oryze, đ
    article -> ChuyêN ĐỀ 1 Tách chiết adn với số lượng cực lớn, chất lượng cao của 30 giống lúa


1   2   3   4


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương