Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung



tải về 450.48 Kb.
trang1/3
Chuyển đổi dữ liệu10.08.2016
Kích450.48 Kb.
#16364
  1   2   3

Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung

MỞ ĐẦU


Tình hình biến đổi khí hậu toàn cầu (BĐKH) hiện nay đang là một vấn đề hết sức thời sự, thu hút sự quan tâm, lo lắng của toàn nhân loại. BĐKH hiện đang diễn ra thường xuyên trên diện rộng, vượt ra ngoài tầm kiểm soát của con người và gây ra những tác động rất lớn đến đời sống và kinh tế toàn cầu, đặc biệt là nông nghiệp. Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo các giống cây trồng có khả năng thích ứng cao với bất lợi thời tiết là hết sức cần thiết và cấp bách.

Việt Nam là một trong những quốc gia được dự đoán là bị ảnh hưởng nhiều nhất do tác động bởi biến đổi khí hậu. Diễn biến thời tiết trong những năm gần đây cho thấy hạn đã và đang là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng; thậm chí có nơi, có vụ hạn gây thất thu làm sản lượng nông nghiệp không ổn định. Vì vậy, việc tạo ra các giống cây trồng có tính kháng hạn cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng góp phần tăng năng suất, xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội, tăng dân trí và vị thế quốc gia.

Từ hàng ngàn năm về trước, con người đã biết tạo ra giống cây trồng mang các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa hai dòng mang gen mong muốn). Tuy nhiên, phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức và trong nhiều trường hợp, cây lai thu được kèm cả tình trạng không mong muốn. Ngày nay, các nghiên cứu hệ gen đã xác định đặc tính, chức năng của các gen hữu ích và kỹ thuật di truyền đã chuyển trực tiếp các gen hữu ích vào các đối tượng cây trồng khác nhau và tạo ra các cây trồng chuyển gen mang các đặc tính quý như tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hóa học cần sử dụng…

Trong những năm vừa qua, hàng loạt các nghiên cứu chuyển các gen hữu ích vào các đối tượng cây trồng đã được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm và kết quả đã tạo được nhiều giống cây trồng chuyển gen mang các đặc tính quý như chống sâu, kháng thuốc diệt cỏ, năng suất cao, chất lượng tốt.... Đặc biệt một số giống chuyển gen đã được thương mại và diện tích gieo trồng ngày càng tăng trong sản xuất, đáp ứng được kỳ vọng của thực tế sản xuất.

Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen, vì vậy mặc dù rất nhiều nghiên cứu tạo giống cây trồng chuyển gen chịu hạn đã được nghiên cứu trong những năm qua nhưng kết quả là vẫn chưa có giống cây trồng chịu hạn thương mại hóa [9, 54, 60]. Gần đây, xu hướng tạo giống cây trồng chuyển gen chịu hạn đang tập trung vào các nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn (gen điều khiển chịu hạn) vì những lý do: (1) sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn liên quan chặt chẽ đến quá trình phiên mã, (2) các gen điều khiển tính chịu hạn mã hoá các protein có khả năng hoạt hoá sự biểu hiện của hàng loạt các gen chức năng liên quan đến chịu hạn thông qua quá trình phiên mã và kết quả là thực vật tăng cường tính chịu hạn. Điều này giải thích vì sao tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen nhưng chỉ cần chuyển một gen điều khiển tính chịu hạn có thể tăng sức chống hạn của cây chuyển gen. Vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu đặc tính của các gen điều khiển đang trở thành vấn đề thời sự mang tính toàn cầu cả về nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu áp dụng. Hiện đã có rất nhiều công bố chuyển thành công các gen điều khiển chịu hạn vào cây mô hình Arabidopsis, lúa, cà chua, đậu tương, ngô...

Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati“

Với những mục tiêu chính như sau:


  • Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 điều khiển tính chịu hạn ở lúa.

  • Tập trung tối ưu hoá quy trình chuyển gen và thao tác di truyền trên cây lúa.

  • Tạo ra cây lúa chuyển gen OsNAC6 có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn.


Chương 1. TỔNG QUAN


1.1. NÔNG NGHIỆP TRONG ĐIỀU KIỆN BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU

1.1.1. TÌNH HÌNH BIẾN ĐỔI KHÍ HẦU TOÀN CẦU

Theo Bộ Tài nguyên- Môi trường, biến đổi khí hậu đã và đang diễn ra trên phạm vi toàn cầu, khu vực và ở Việt Nam. Biến đổi khí hậu đã và sẽ tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi thế giới, trong đó có Việt Nam.

Biến đổi khí hậu chính là sự thay đổi của hệ thống khí hậu gồm khí quyển, thuỷ quyển, sinh quyển, thạch quyển hiện tại và trong tương lai bởi các nguyên nhân tự nhiên và nhân tạo trong một giai đoạn nhất định từ tính bằng thập kỷ hay hàng triệu năm. Sự biển đổi có thể là thay đổi thời tiết bình quân hay thay đổi sự phân bố các sự kiện thời tiết quanh một mức trung bình. Sự biến đổi khí hậu có thể giới hạn trong một vùng nhất định hay trên toàn Địa Cầu. Trong những năm gần đây, biến đổi khí hậu được gọi chung bằng hiện tượng nóng lên toàn cầu. Nguyên nhân chính của hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu là do sự gia tăng các hoạt động tạo ra các chất thải khí gây hiệu ứng nhà kính (bao gồm hơi nước, CO2, CH4, N2O, O3, các khí CFC), các hoạt động khai thác quá mức các bể hấp thụ và bể chứa khí nhà kính như sinh khối, rừng, các hệ sinh thái biển, ven bờ và đất liền khác.

Theo Trung tâm Nghiên cứu Khí tượng - Khí hậu (Viện Khoa học Khí tượng thủy văn và Môi trường), tình hình biến đổi khí hậu ở Việt Nam đang diễn ra theo chiều hướng gia tăng tần suất và cường độ của các hiện tượng bão, mưa lớn, nhiệt độ cao và hạn hán. Thời tiết trong năm 2010 diễn biến phức tạp, bất thường, dịch bệnh trên cây trồng, vật nuôi xảy ra ở nhiều huyện thị, hạn hán nặng ở vụ hè thu, lũ lụt hồi tháng 10/2010 đã gây ảnh hưởng không nhỏ đến sản xuất nông nghiệp của người dân. Theo Phó phòng Dự báo khí tượng hạn vừa và dài (Trung tâm dự báo Khí tượng-Thủy văn Trung ương) Nguyễn Đức Hoà thì trong những tháng tiếp theo của mùa khô 2010, ở Bắc bộ, đặc biệt là Bắc Trung bộ hạn hán sẽ gay gắt hơn nhiều so với năm ngoái. Cùng với đó, vào đầu vụ từ tháng 1 đến tháng 3-2011, mực nước trên các sông lớn sẽ ở mức thấp hơn TBNN, trong khi đó độ mặn vùng cửa sông khả năng cao hơn TBNN, nước mặn sẽ xâm nhập sâu vào các cửa sông và thẩm thấu ngầm, ảnh hưởng đến nhiều diện tích canh tác của các địa phương ven biển. Do vậy khả năng vào vụ có thể thiếu hụt lượng nước tưới tiêu tương đương với khoảng 200.000 ha. [80]

1.1.2. ẢNH HƯỞNG CỦA BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU ĐẾN SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

Nông nghiệp thế giới hiện nay đang đối mặt với những khó khăn lớn do tình trạng biến đổi khí hậu gây ra. Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy ra ở các tỉnh miền Bắc. Tính trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng 7 năm nay đã ảnh hưởng nghiêm trọng vùng trồng ngô lớn nhất Trung Quốc và có nguy cơ thu hẹp 60% diện tích trồng trọt. Ấn Độ đang phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng nhất trong vòng 7 năm qua. Hiện nay đã có hơn 1/3 số quận của Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán. Thiếu hụt lượng mưa cần thiết có thể khiến tăng trưởng kinh tế của quốc gia này giảm sút 1% trong năm nay. Đợt hạn hán tồi tệ nhất trong lịch sử gần 20 năm qua tại Thái Lan trong năm nay đang đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu. Thông báo mới nhất cho biết, sản lượng gạo của nước này trong vụ mùa tới, kết thúc vào tháng 8, có thể chỉ đạt 2 triệu tấn so với mức dự báo 5 triệu tấn trước đó.

Chưa bao giờ vấn đề biến đổi khí hậu (BĐKH) lại được đề cập nhiều và nóng bỏng như trong thời điểm này. Theo nghiên cứu mới nhất của Liên Hợp Quốc [81], Việt Nam sẽ là quốc gia bị ảnh hưởng nhiều nhất ở khu vực Đông Nam Á từ sự BĐKH này.

Việt Nam, một nước đang phát triển trong thời kỳ công nghiệp hóa, nằm trong nhóm nước dễ bị tổn thương bởi các vấn đề môi trường do BĐKH gây ra như lũ lụt, hạn hán, bão… Bên cạnh đó, với bờ biển dài, vấn đề mực nước biển dâng cao có thể làm mất 12,2% diện tích đất của Việt Nam và đe dọa tới chỗ sinh sống của 17 triệu người. Những biến động thời tiết bất thường gây thiệt hại lớn cho đời sống dân nhân và đất nước mà chúng ta thường gọi là thiên tai cần được nghiên cứu, xem xét theo hướng báo động toàn cầu về gia tăng nhiệt độ bề mặt trái đất và mực nước biển ngày càng dâng cao. Theo nghiên cứu mới nhất chuẩn bị công bố, đến cuối thế kỷ (2100), nhiệt độ của Việt Nam sẽ tăng lên khoảng 2 đến 4,5oC và mực nước biển sẽ dâng lên khoảng 10 đến 68 cm. Và nếu sự biến đổi khí hậu cứ diễn ra như với tốc độ hiện nay thì trong vòng khoảng 100 năm nữa, nhiều diện tích đất liền trên trái đất, trong đó có vùng đồng bằng châu thổ sông Cửu Long và sông Hồng, có thể sẽ ngập chìm trong nước biển [81]. Theo ước tính của IPCC, nếu mực nước biển dâng cao 1 m thì làm cho 22 triệu người Việt Nam mất nhà cửa, đồng bằng Sông Hồng sẽ bị ngập 5.000 km2 và đồng bằng Sông Cửu Long bị ngập 15.000 - 20.000 km2; mà đây là hai vựa lúa lớn nhất, tập trung đông dân cư nhất cả nước. Mất đất, sản lượng lương thực của Việt Nam sẽ giảm 12% (xấp xỉ 5 triệu tấn). Trong khi miền Trung vẫn chưa hết mùa mưa lũ, các tỉnh miền Bắc lại đang phải gồng mình chống hạn. Sự thay đổi khắc nghiệt và bất thường của thời tiết đang khiến cả dải đồng bằng sông Hồng "khát" nước. Mực nước các sông, hồ chứa đều xuống thấp, ba hồ thuỷ lợi lớn của miền Bắc là Hoà Bình, Thác Bà, Tuyên Quang hiện mới chỉ tích được hơn 5,2 tỉ m3, còn thiếu hơn 4,5 tỉ m3 so với thiết kế, đe doạ ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực [82].

Theo tính toán của Tổng cục Thuỷ lợi, nếu kéo dài tình trạng ít mưa như hiện nay thì sẽ có khoảng 650.000 ha lúa Đông Xuân 2010- 2011 rơi vào cảnh thiếu nước tưới. Trong khi đó, nhận định của Trung tâm Dự báo Khí tượng Thuỷ văn Trung ương cho thấy, thời tiết từ nay đến cuối năm và đặc biệt đúng thời điểm gieo cấy vụ Đông Xuân sẽ rất khắc nghiệt do khô hạn tiếp tục kéo dài. Đến hết năm 2010, dòng chảy các sông Bắc Bộ từ thượng lưu đến hạ lưu giảm nhanh và có khả năng nhỏ hơn mức trung bình nhiều năm (TBNN) từ 20-40%. Trong đó, 2 hệ thống sông chính là sông Hồng và sông Thái Bình sẽ thiếu hụt với mức 35-45%.

1.2. HẠN VÀ PHÂN LOẠI HẠN

1.2.1. KHÁI NIỆM HẠN

Tất cả các sinh vật trên Trái đất đềucần có nước để duy trì các hoạt động sống của cơ thể, vì vậy nước có ý nghĩa sống còn đối với sinh vật, đặc biệt là thực vật – những sinh vật không có khả năng di chuyển để tìm nguồn nước. Lượng nước cần thiết cho cơ thể thực vật phụ thuộc vào từng loài và từng giai đoạn phát triển của chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm chỉ sự thiếu nước do môi trường gây ra trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đọan phát triển, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển.

Mức độ tổn thương của thực vật do khô hạn gây ra có nhiều mức độ khác nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường. Khả năng giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là “tính chịu hạn” của thực vật và những cây trồng có khả năng phát triển bình thường trong điều kiện khô hạn gọi là “cây chịu hạn”. Khả năng có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là “tính chịu hạn” của thực vật [3].

Tuy nhiên, rất khó để xác định được thế nào là trạng thái hạn đặc trưng vì mức độ khô hạn do môi trường gây ra khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trước được. Mức độ khô hạn do môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, làm giảm năng suất cây trồng, thậm chí có thể dẫn đến mất mùa... [61]

Các yếu tố của môi trường như thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng... gây nên hiện tượng mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa cây và môi trường, dẫn đễn sự thiếu hụt nước trong tế bào, gây ra hiện tượng hạn hán. Hạn được phân biệt thành 3 loại là hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện [11].

1.2.2. PHÂN LOẠI HẠN


        1. Hạn không khí

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39 - 420C) và độ ẩm thấp (< 65%). Hiên tượng này thường gặp ở những tỉnh miền Trung nước ta vào những đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông. Hiện tượng này còn xuất hiện ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel; gió Mistral ở miền nam nước Pháp… đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loài cây trồng như phong lan, cam, chanh, đậu tương…. [56].

Hạn không chỉ ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây như hoa, lá, chồi non… nhất là ảnh hưởng đến quá trình tung phấn của cây. Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời vì nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát hơi nước nhanh vượt qua mức độ bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ bù lại lượng nước mất, cây lâm vào tình trạng mất cân bằng về nước. Nước cũng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và giai đoạn cuối cùng của quá trình chuyển hóa hóa sinh, là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra [63]. Vì vây, việc cung cấp đủ nước cho cây chính là một biện pháp canh tác quan trọng. Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là một trong những mục tiêu của các nhà tạo chọn giống.

Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh trưởng của cây. Thiếu nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng quá trình già hóa tế bào. Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương và chết.


        1. Hạn đất

Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề măt và khả năng giữ nước của đất. Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến mức cây không thể lấy nước qua tế bào rễ, vì thế hạn đất có thể gây ra cho cây héo lâu dài. Hạn đất tác động trực tiếp đến bộ phận rễ làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Đối với cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt và nảy mầm. Lượng nước trong đất không đủ làm co mầm và héo; nếu thiếu nước nặng sẽ gây thui chột mầm và chết.

        1. Hạn toàn diện

Hạn toàn diện là hiện tượng khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng một lúc. Trong trường hợp này, cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ cung cấp cho cây. Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục hồi. Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy ra ở các tỉnh miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh…), gây nên thiệt hại đáng kể cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng.

    1. PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN

Điều kiện bất lợi môi trường gây ra hàng loạt các thay đổi về hình thái, sinh lí, sinh hoá và phân tử, ảnh hưởng bất lợi cho sinh trưởng và phát triển của thực vật. Trong các điều kiện bất lợi môi trường, hạn là một trong những yếu tố quan trọng nhất, đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu. Điều kiện hạn hán sẽ làm cho thực vật phải tạo ra hàng loạt các thay đổi về mặt sinh lý để tồn tại và thích nghi với điều kiện hạn như: Cụ thể hạn hán sẽ dẫn đến việc thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô, chậm quá trình sinh trưởng. Ở mức độ phân tử, điều kiện hạn sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện và tích luỹ của các gen/protein chống chịu stress [15, 59, 74].

Arabidopsis, các protein như kinase, nhân tố phiên mã (transcription factor), phosphatase, protease, protein biểu hiện trong giai đoạn muộn của phôi (late embryogenesis abundant(LEA), protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), các protein sinh tổng hợp đường (proline, mannitol, sorbitol) và hàng loạt các protein chức năng khác tham gia vào quá trình chịu hạn ở thực vật [59].

Các protein tham gia vào quá trình chống hạn của thực vật được phân thành hai nhóm: (1) nhóm protein chức năng trực tiếp tham gia chống lại với điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mannitol, sorbitol...); (2) nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã, kinase...). Các nhân tố phiên mã này bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi động gen của các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của các gen này, kết quả là tăng cường tính chịu hạn ở thực vật. Các nghiên cứu về gen đã chứng minh vùng khởi động gen của nhiều gen chức năng chứa một hoặc nhiều trình tự ADN đặc hiệu là điểm bám của một nhân tố phiên mã. Điều này chứng tỏ một nhân tố phiên mã có thể hoạt hóa biểu hiện của nhiều gen chức năng. Các nghiên cứu biểu hiện gen đã chứng minh nhiều nhân tố phiên mã biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn chứng tỏ nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa và biểu hiện của các gen tăng cường tính kháng hạn ở thực vât. [60, 74].



Hình 1. Cơ chế phân tử của quá trình tăng cường tính chịu hạn ở thực vật

1.3.1. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CÁC QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA

Sự thay đổi chuyển hóa sơ cấp trong cơ thể là một cách đáp ứng thông thường với điều kiện stress ở thực vật. Ví dụ, một cADN mã hoá cho enzym glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase được phân lập từ cây C. plantagineum (bảng 1) tăng cường biểu hiện khi bị xử lý trong điều kiện hạn và xử lý ABA [68]. Tuy nhiên các mức độ tăng cường hoạt động của enzym có liên quan với các yếu tố stress môi trường ở thực vật, phản ánh sự gia tăng nhu cầu về năng lượng. Các protease có thể cũng là một đặc điểm quan trọng của các quá trình chuyển hoá trong điều kiện stress. Chúng góp phần làm ngừng việc sử dụng các protein thừa và phân hủy các chuỗi peptit trong các túi chứa, qua đó giải phóng các axit amin tự do để sử dụng cho việc tổng hợp số lượng lớn các protein mới (bảng 1 và 2, [24]).



1.3.2. CÁC GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH BIẾN ĐỔI TÍNH THẤM CỦA TẾ BÀO

Thực vật có thể giữ được thế nước (giúp duy trì dòng chảy của nước trong cây) trong điều kiện khô hạn nhẹ bằng cách biến đổi tính thấm của tế bào, quá trình này bao gồm việc tận dụng các phân tử đường hay các giải pháp tương thích khác [12]. Cả các kênh dẫn nước và ion đều có vai trò quan trọng như nhau trong việc điều hòa dòng chảy của nước và sự liên hệ giữa các kênh này với điều kiện stress hạn đã được khẳng định qua việc phân lập được các gen mã hóa cho protein của các kênh này, biểu hiện trong việc đáp ứng sự khô hạn.

Phân tử cADN 7a từ cây đậu Hà Lan (bảng 2, [24]) mã hóa một chuỗi peptit với các điểm đặc trưng của các kênh dẫn ion, trong khi phân tử cADN RD28 từ cây A. thaliana (bảng 1, [72]) và có thể là cả phân tử cADN H2-5 từ cây C. plantagineum đều mã hóa cho protein của các kênh dẫn nước [16].

1.3.3. CÁC GEN THAM GIA BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC

Các nhà khoa học đã chứng minh điều kiện stress hạn là nguyên nhân gây ra sự biến đổi trong thành phần hóa học, đặc điểm sinh lý của thành tế bào và những sự thay đổi này có thể liên quan đến các gen mã hóa cho enzym sinh tổng hợp S-adenosylmethionine (bảng 1, [21]). Trong điều kiện binh thường, việc tăng cường biểu hiện của các gen sinh tổng hợp S-adenosyl- L-methionine có liên quan đến các vùng đang diễn ra sự hóa gỗ [47]. Do đó, việc tăng cường biểu hiện trong các mô chịu điều kiện stress hạn có thể dẫn đến việc hóa gỗ của thành tế bào. Quá trình kéo dài tế bào bị dừng lại dưới điều kiện stress hạn kéo dài liên tục và ngay sau đó các quá trình hóa gỗ được khởi động [44].



Bảng 1. Các gen được tăng cường biểu hiện bởi stress hạn và mã hoá cho chuỗi polypeptide của các protein có chức năng đã biết (J.Ingram và D. Bartels)

Espartero và cộng sự đã chứng minh được ở nấm sự thiếu nước có thể gây ra hiện tượng đồng cảm ứng phiên mã enzym sinh tổng hợp S-adenosyl-L- methionine với các enzym khác như enzym thủy phân S-adenosyl-L-homocystein hay một enzym chuyển hóa methyl cần thiết cho việc tạo thành tế bào [21].



Bảng 2. Các cADN tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn nhưng chức năng chưa xác định (J.Ingram và D. Bartels)



1.3.4. CÁC GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH PHÁ HỦY VÀ KHÔI PHỤC

Các gen cảm ứng với điều kiện hạn mã hóa cho các protein có trình tự tương đồng với các enzym phân hủy protein đã được phân lập từ P. sativum (bảng 2, [24]) vµ A. thaliana (bảng 1 và 2 [8, 35, 36, 70]). Một trong những chức năng của các enzyme này là phá hủy các protein bị mất chức năng do tác động của điều kiện hạn [24]. Trong giai đoạn đầu của quá trình bị hạn hán, A. Thaliana tăng cường tổng hợp các phân tử ARN thông tin mã hóa cho các protein ubiquitin có hoạt tính mạnh [35]. Một protein dung hợp trong nhóm này có hoạt tính ubiquitin được phát hiện ra trong quá trình dung giải protein và sự gia tăng này có thể tương đồng với việc phân hủy protein đã xảy ra vì quá trình gắn ubiquitin có vai trò xác định protein cho quá trình phân hủy

Sản phẩm của gen cảm ứng điều kiện hạn được phân lập bằng phương pháp sàng lọc biệt hóa có trình tự tương đồng với các protein shock nhiệt (bảng 2; [35]). Các gen mã hóa cho các protein này có thể là các chaperonin, có liên quan đến việc sửa chữa protein thông qua sự trợ giúp các các phân tử protein khác để phục hồi cấu trúc tự nhiên của protein sau khi bị phá hủy hay gấp nếp sai trong quá trình bị hạn. Các protein shock nhiệt có khối lượng phân tử nhỏ cũng có thể là các chaperonin.

1.3.5. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN VIỆC LOẠI BỎ ĐỘC TỐ

Các enzym liên quan đến việc loại bỏ độc tố trung gian trong các quá trình chuyển hóa hiếu khí như khử hóa glutathione, bẻ gẫy liên kết superoxide được tăng cường trong quá trình đáp ứng lại stress hạn chứng tỏ chúng có vai trò quan trọng trong các quá trình chống chịu [39]. Việc giảm lượng nước ở lá và đóng khí khổng dẫn đến việc giảm lượng CO2 [58]. Sự gia tăng hoạt động hô hấp sáng trong quá trình hạn hán cũng đồng thời xảy ra do có sự tăng cường các hoạt động oxi hóa glycolate, dẫn đến việc tạo ra các phân tử H2O2 [39]. Điều này có thể giải thích tại sao các gen mã hóa cho các enzym có hoạt tính loại bỏ độc tố như ascorbate peroxidase (bảng 1; [39]) và superoxide dismutase (bảng 1; [49, 69]) lại tăng cường biểu hiện trong quá trình đáp ứng hạn hán.





Hình 2. Phân loại các gen biểu hiện đáp ứng với điều kiện hạn ở thực vật

    1. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

Dòng chảy di truyền từ ADN đến protein trải qua quá trình rất quan trọng là quá trình phiên mã. Các nhân tố phiên mã bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi động gen của các gen đích và điều hòa biểu hiện các gen này.



Hình 3. Mô hình quá trình phiên mã

Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8 - 10 % trong mỗi hệ gen và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động của sự sống như quá trình sinh trưởng, phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường... Ở lúa, hơn 2600 gen mã hóa nhân tố phiên mã đã được phân lập và phân chia thành các nhóm, họ và siêu họ dựa theo trình tự nucleotide và chức năng. Rất nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đã được nghiên cứu chức năng ở mức độ phân tử.

Đặc điểm đặc trưng của các protein điều khiển (nhân tố phiên mã) là có hai vùng hoạt động (domain): (1) vùng hoạt hoá các protein chức năng (activation domain) và (2) vùng liên kết (binding domain) với các trật tự ADN đặc hiệu (cis-acting element) trên vùng điều khiển của gen (promoter). Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen chịu hạn được phân loại dựa vào trật tự ADN đặc hiệu mà chúng liên kết. Vùng khởi động (promoter) của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn thường chứa một hoặc nhiều trật tự ADN đặc hiệu phổ biến là: ABRE (ABA responsive element - yếu tố đáp ứng ABA) và DREB/CRT (Dehydration responsive element/C repeat - yếu tố/đoạn C lặp lại đáp ứng hạn), NAC, MYB... với chức năng tương ứng là điểm bám của các protein điều khiển quá trình phiên mã biểu hiện phụ thuộc và không phụ thuộc vào nồng độ ABA (hình 4)

Hình 4. Hệ thống điều khiển phiên mã của vùng ADN đặc hiệu và nhân tố phiên mã điều khiển biểu hiện các gen chức năng tham gia phản ứng chống chịu với điều kiện bất lợi ở Arabidopsis
1.4.1. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN KHÔNG PHỤ THUỘC ABA

a. Nhóm nhân tố NAC

Các nhân tố phiên mã họ NAC chứa trình tự đồng nhất (đầu tiên được phát hiện từ petunia NAM, từ Arabidopsis ATAF1, ATAF2 và CUC) gọi là vùng hoạt động NAC ở đầu N-tận cùng, là một họ gen đặc trưng của thực vật có vai trò quan trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi [50]; biệt hóa các cơ quan rễ, hoa trong sinh trưởng phát triển thực vật [7]; phản ứng với điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại tấn công [7; 14]. Có ít nhất 100 gen NAC trong hệ gen Arabidopsis và 75 gen NAC trong hệ gen lúa đã được phân lập nhưng chỉ một số ít gen NAC được nghiên cứu chức năng [46]. Phần lớn protein của gen NAC chứa đựng vùng bám ADN ở tận cùng đầu N có độ bảo thủ cao, trình tự tín hiệu định vị nhân và một vùng tận cùng đầu C biến đổi [29].

Dựa vào phân tích trình tự axit amin, các gen thuộc nhóm NAC ở thực vật có thể được chia thành vài phân họ như NAM, ATAF và OsNAC3. Ở lúa, OsNAC1OsNAC2 được xếp vào trong phân họ NAM. Trong phân họ này còn bao gồm NAM và CUC. Trong khi đó, OsNAC5OsNAC6 thuộc hoàn toàn phân họ ATAF. Ngoài những thành phần của các phân họ này thì trong bộ gen của lúa còn có các gen OsNAC3, OsNAC4 (thuộc phân họ OsNAC3), OsNAC7OsNAC8.

Trật tự ADN đặc hiệu NACR bao gồm 62 nucleotide lần đầu tiên được phát hiện trên đoạn điều khiển gen ERD1 (early responsive to dehydration-1) liên quan đến tính kháng hạn ở thực vật. Sản phẩm protein của ba gen điều khiển quá trình phiên mã thuộc nhóm gen NAC bám vào trật tự ADN đặc hiệu NACR (14bp CACTAAATTGTCAC và trình tự lõi CATGTG giống MYC) trên đoạn điều khiển các gen tăng cường tính kháng hạn làm cho các gen này biểu hiện mạnh và kết quả là cây chuyển gen có tính kháng rất cao với điều kiện hạn. Các phân tích ADN microarray về sự liên quan giữa biểu hiện của các gen điều khiển quá trình phiên mã thuộc nhóm NAC với biểu hiện của các gen liên quan đến tính kháng hạn cũng đã đưa ra kết luận là khi các gen điều khiển quá trình phiên mã biểu hiện trong cây chuyển gen đã hoạt hoá sự biểu hiện của một số gen chức năng sinh ra trong điều kiện hạn [65]. Từ nghiên cứu về khả năng điều khiển tính chịu hạn của nhóm gen NAC trên Arabidopsis, nhóm nghiên cứu của Lizhong Xiong ( Trung tâm Quốc gia về nghiên cứu gen thực vật Trung Quốc) đã phân lập gen OsNAC1 và chuyển vào lúa. Cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và qua phân tích ADN microarray thì sự biểu hiện của gen ngoại sinh OsNAC1 đã hoạt hóa hàng loạt gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn. Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy các cây lúa chuyển gen OsNAC1 cho năng suất cao hơn 22-34% so với các cây đối chứng ở điều kiện hạn [29]. Tương tự nhóm nghiên cứu của Shinozaki đã phân lập và nghiên cứu đặc tính gen OsNAC6 và cho kết quả là các cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn, lạnh. Đặc biệt, ngoài việc tăng cường tính chống chịu với bất lợi thời tiết, cây lúa chuyển gen OsNAC6 còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây đối chứng [42]. Gần đây, gen NAC ở lúa ONAC045 cũng được công bố liên quan đến tính chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường. Gen ONAC045 định vị ở nhân và biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn, mặn, lạnh và xử lý ABA. Cây lúa chuyển gen ONAC045 tăng cường tính chịu hạn, mặn [77].



b. Nhóm nhân tố DREB2

Hai gen DREB2ADREB2B chỉ biểu hiện trong điều kiện hạn và hoạt hoá các gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn của thực vật. Tuy nhiên biểu hiện của các gen DREB2ADREB2B không làm tăng tính kháng hạn ở các cây Arabidopsis chuyển gen chứng tỏ nhóm gen này cần quá trình sửa đổi sau phiên mã ví dụ như qua quá trình phosphoryl hóa để chuyển protein sang dạng hoạt hoá [38]. Gen DREB2A được thay đổi cấu trúc để loại bỏ 30 axit amin tương ứng với trật tự từ 136 đến 165 để tạo ra dạng DREB2ACA. Kết quả, sự biểu hiện của gen DREB2ACA giúp cây chuyển gen Arabidopsis tăng cường đáng kể tính chịu hạn. Các phân tích sử dụng kỹ thuật ADN microarray và Northern blot đã chứng minh là gen DREB2ACA điều khiển sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [56]. Gen ZmDREB2A cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính chi tiết ở ngô. Không giống như ở Arabidopsis (DREB2A), gen ZmDREB2A tạo ra hai dạng phiên mã và qua phân tích RT- PCR thì chỉ có dạng phiên mã có hoạt tính sinh ra đáng kể trong điều kiện hạn. Ngoài ra, qua thí nghiệm phân tích hoạt hoá phiên mã (transactivation assay) ở tế bào trần Arabidopsis thì ZmDREB2A có hoạt tính hoá quá trình phiên mã (transactivation activity) mạnh hơn nhiều DREB2A. Vì vậy quá trình sửa đổi sau dịch mã là không cần thiết trong việc tạo ra protein hoạt tính trong trường hợp gen ZmDREB2A. Sự biểu hiện liên tục gen ZmDREB2A làm tăng cường tính chịu hạn rõ rệt trong các cây chuyển gen. Kết quả này cho thấy có sự khác nhau về cơ chế điều khiển tính chịu hạn trong cùng nhóm gen giữa cây mô hình hai lá mầm (Arabidopsis) và cây một lá mầm [52].

Gần đây, nhóm gen mới ở lúa OsRap2.4A/DBF1 biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn được phân lập bằng phương pháp one hybrid sử dụng mồi là 4 đoạn ADN lặp lại, mỗi đoạn gồm 50 nucleotide chứa trật tự ADN đặc hiệu DRE định vị sau hộp TATA trên promoter JRC2606 (Glutamate dehydrogenase-like proteins).


      1. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN PHỤ THUỘC ABA

a. Nhóm nhân tố ABRE/ABF

Trật tự ADN đặc hiệu ABRE có trình tự lõi là ACGTGGC lần đầu tiên được phát hiện nằm trên đoạn điều khiển gen Em ở lúa mì [25], gen RAB16 ở lúa [40]. Hai nhóm protein điều khiển quá trình phiên mã AREB/ABF bám vào trật tự ADN đặc hiệu ABRE trên các đoạn ADN điều khiển và hoạt hoá sự biểu hiện các gen liên quan đến tính kháng hạn và kết quả là tăng cường tính kháng hạn ở các cây chuyển gen [67]. Trên cây mô hình Arabidopsis, biểu hiện của gen ABF3 hoặc AREB2/ABF4 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn [32], trong khi đó biểu hiện của gen ABF2 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn, mặn và nhiệt độ cao[34].



b. Nhóm nhân tố MYB và MYC

Hai gen điều khiển quá trình phiên mã ở Arabidopsis có tên gọi là AtMYC2AtMYB2 cũng được công bố bám vào trật tự ADN đặc hiệu MYC (CANNTG) và MYB (C/TAACNA/G) trên đoạn điều khiển gen RD22. Gen RD22 mã hóa protein đồng nhất với protein ở hạt và có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein. Biểu hiện các gen AtMYCAtMYB làm cho câyArabidopsis chuyển gen có ngoại hình mẫn cảm với ABA và có tính kháng hạn cao [6].



c. Nhóm nhân tố DREB1/CBF

Trật tự ADN đặc hiệu DRE/CRT có trình tự lõi là A/GCCGAC lần đầu tiên được phát hiện nằm trên đoạn điều khiển gen RD29 ở Arabidopsis[73] và sau này được phát hiện trên rất nhiều đoạn điều khiển gen của các gen sinh ra trong diều kiện hạn và lạnh [9; 64]. Các gen điều khiển quá trình phiên mã thuộc nhóm AP2 (APETALA2)/ethylene-responsive element-binding factor (ERF) bám vào trật tự ADN đặc hiệu DRE và được đặt tên là: DREB1/CBF và DREB2[74]. Trên cây mô hình, biểu hiện của gen DREB1A/CBF3, DREB1B/CBF1, DREB1C/CBF2 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn, mặn và lạnh [26;33; 38]. Trong khi đó, biểu hiện của gen DREB1D/CBF4 dẫn đến cây chuyển gen chỉ tăng cường tính kháng hạn [28]. Các gen DREB1/CBF cũng đã được phân lập ở các cây trồng khác nhau như như đậu tương, súp lơ, cà chua, cỏ linh lăng, thuốc lá, anh đào, dâu tây, lúa mì, lúa, lúa mạch, lúa mạch đen, ngô[76].

Điều thú vị là khi chuyển các gen OsDREB1/CBF ở lúa, ZmDREB1/CBF ở ngô vào cây mô hình Arabidopsis hoặc các gen DREB1/CBF ở Arabidopsis vào lúa cho kết quả tương tự về chức năng của nhóm gen này trong việc tăng cường tính chống chịu của cây chuyển gen với điều kiện thời tiết bất lợi [20;45; 30; 53]. Điều này chứng tỏ có sự tương đồng về chức năng của các gen điều khiển quá trình phiên mã ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm và mở ra triển vọng tốt cho việc tăng cường tính kháng hạn ở thực vật thông qua việc chuyển gen điều khiển từ các đối tượng cây trồng khác nhau. Hiện tại, các gen điều khiển DREB1/CBF đã và đang được sử dụng có hiệu quả trong việc tăng cường tính chống chịu với bất lợi của thời tiết trên nhiều đối tượng cây trồng trong điều kiện nhà kính và sản xuất thử nghiệm trên đồng ruộng như lúa [45; 30], lúa mì [48], khoai tây [13], cà chua [28].


      1. NHÓM CÁC GEN ĐIỀU KHIỂN ĐÁP ỨNG HẠN KHÁC

Gần đây, các nhóm gen điều khiển khác như protein kinase và các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ABA cũng đang được xem là vấn đề thời sự trong các nghiên cứu nhằm tăng cường tính kháng hạn ở thực vật. Các protein kinase xúc tác việc chuyển một nhóm phosphate từ các hợp chất giàu năng lượng như ATP tới các protein trong tế bào thông qua phản ứng phosphoryl hóa và làm cho các protein đó chuyển sang dạng hoạt động. Vì vậy, các protein kinase đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tăng hoặc giảm hoạt tính protein và trong quá trình truyền tín hiệu từ các tín hiệu bề mặt tế bào đến các protein điều khiển, các protein chức năng trong tế bào. Với khía cạnh chịu hạn, các protein kinase truyền tín hiệu hạn từ môi trường đến nhóm gen điều khiển phiên mã và hoạt hóa các gen này. Khi các gen điều khiển quá trình phiên mã hoạt động sẽ hoạt hoá các gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn. Ngoài ra, các protein kinase còn tham gia trực tiếp vào quá trình hoạt hoá các gen chức năng sinh ra trong điều kiện hạn.

Nhóm protein kinase SnRK2 bao gồm 10 thành viên được phát hiện ở Arabidopsis và lúa. OST/SRK2E đóng vai trò trong vận chuyển tín hiệu ABA và kiểm soát hoạt động đóng mở khí khổng, SRK2s hoạt hoá trong điều kiện hạn, mặn và ABA [75; 41]. SRK2C hoạt hóa trong điều kiện hạn, mặn và xử lý ABA, biểu hiện rất mạnh ở đầu rễ và tham gia vào phản ứng của rễ với điều kiện hạn. SRK2C đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc tăng cường tính kháng hạn ở thực vật thông qua việc hoạt hóa các gen tham gia vào tính chịu hạn [66].

Gen OsMAPK5 cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính ở lúa. Biểu hiện gen OsMAPK5 trong cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và lạnh trong khi ức chế sự biểu hiện của gen OsMAPK5 trong cây chuyển gen tăng cường tính kháng cao với các bệnh đạo ôn (Magnaporthe grisea), bệnh thối hạt do vi khuẩn (Burkholderia glumae). Kết quả này mở ra tiềm năng áp dụng gen OsMAPK5 trong các cây chuyển gen nhằm tăng cường tính chống chịu với cả điều kiện sinh học và phi sinh học [71]. ABA là một hoormon thực vật đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng của thực vật với ngoại cảnh bất lợi thông qua việc tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein trong giai đoạn phát triển phôi hạt và các bộ phận già cỗi. Gen mã hoá 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) là enzym đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong sinh tổng hợp ABA, biểu hiện của NCED đã tăng cường tính kháng hạn trong các cây chuyển gen [31]. Gần đây, gen mã hoá ABA 8-hydroxylase là enzym tham gia vào việc phân huỷ ABA trong quá trình hút nước của hạt và chống mất nước cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính [40].

Nhóm protein ADN helicase tương đồng với eIF4A (eukaryote innitiation factor 4A) có hoạt tính mở xoắn ADN/ARN cũng được phát hiện tham gia vào việc tăng cường tính chống chịu với điều kiện thời tiết bất lợi ở thực vật. Gen pdh45 (pea ADN helicase 45 KDa) được phân lập ở đậu Hà Lan; nghiên cứu chi tiết đặc tính sinh lý, hoá sinh và chuyển vào thuốc lá. Kết quả là các cây thuốc lá chuyển gen sinh trưởng, kết hạt và cho năng suất bình thường trong điều kiện mặn liên tục [51, 50]. Gen pdh45 cũng đã được chuyển vào lúa và kết quả là các cây lúa chuyển gen có tính chịu mặn cao và hiện tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử thực vật - Trung tâm kỹ thuật gen và Công nghệ Sinh học Quốc tế đang thử tính chịu hạn với các cây lúa chuyển gen pdh45.



    1. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật. Tuy nhiên những phương pháp có giá trị thực tiễn quan trọng chỉ hạn chế trong hai nhóm phương pháp chính: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium.

1.5.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN TRỰC TIẾP

Chuyển gen trực tiếp là kỹ thuật chuyển gen thông qua tiếp nhận ADN tinh chế vào tế bào trần nhờ sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý.



  1. Chuyển gene trực tiếp bằng súng bắn gene ( gene gun).

Nguyên tắc chung của phương pháp này là ngâm các viên đạn nhỏ ( vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5-1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5-0,9 cm. Đĩa kim loại này được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi bắn áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng sung, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ ( vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với vận tốc lớn tới 1300m/s đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gen chuyển do vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén là helium áp lực cao để bắn gen.



  1. Chuyển gene trực tiếp bằng xung điện ( electroporation).

Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung điện để chuyển gene vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần ( protolast) làm cho ADN bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta chuẩn bị một huyền phù protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gene mong muốn cần chuyển vào thực vật. Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao ( 200-400V/cm) trong khoảng thời gian 4-5 phần nghìn giây. Kết quả là màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập vào hệ gene của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau quá trình xung điện, đem protolast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích hợp, môi trường chọn lọc để tách các protolast đã được biến nạp. Tiếp theo là nuôi cây in vitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gene.



  1. Chuyển gene trực tiếp nhờ kỹ thuật siêu âm.

Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gene vào tế bào trần protoplast. Sau khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gene mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3 mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 miligiây. Số nhịp khoảng từ 6-9 nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 – 900 miligiây. Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong môi trường, chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gene. Nuôi cấy in vitro để tái sinh cây. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường bên ngoài.

  1. Chuyển gene trực tiếp bằng phương pháp hóa học.

Là phương pháp chuyển gene vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylene glycol (PEG). Khi có mặt PEG, màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu nhận ADN ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp chuyển gene bằng hóa chất có thể áp dụng đối với nhiều loài thực vật nhưng khả năng chuyển gene với tần số chuyển gene rất thấp. Tuy nhiên với khả năng tạo ra số lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được hạn chế của phương pháp này.

  1. Chuyển gene trực tiếp qua ống phấn.

Là phương pháp pháp chuyển không qua nuôi cấy mô in vitro. Nguyên tắc của phương pháp này là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đường ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gene là vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh. Theo các tác giả, tốt nhất là sự chuyển gene xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia. Như vậy sự chuyển gene chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất.

  1. Chuyển gene trực tiếp bằng vi tiêm ( microinjection).

Nguyên lý cơ bản của chuyển gen băng vi tiêm giống như chuyển gene bằng vi tiêm ở động vật. Ở thực vật, chuyển gene bằng vi tiêm là chuyển gene trực tiếp vào tế bào protoplast nhờ thiết bị vi thao tác và kim vi tiêm. Phương pháp này cần có thiết bị có độ chính xác cao, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải chính xác.

      1. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP

  1. Chuyển gen gián tiếp nhờ virut

Bên cạnh vi khuẩn Agrobacterium, còn có các hệ thống dùng Virut làm vectơ chuyển gene vào thực vật. Việc sử dụng Virut có một số ưu điểm như: Chúng dễ xâm nhập và lây lan nhanh trong cơ thể thực vật. Đồng thời có thể mang đoạn ADN lớn hơn so với khả năng của các plasmid. Ngoài những ưu điểm trên, chuyển gene trên cơ sở virut có một số hạn chế:

- Các acid nucleic của virut không ghép nối với bộ gene của thực vật, vì vậy ADN tái tổ hợp không di truyền được cho các thế hệ sau thông qua hạt. Do đó nhân giống các cây chuyển gene phải qua con đường vô tính.

- Sự lây nhiễm virut thường làm yếu tế bào thực vật ở các mức độ khác nhau… Vì thế chuyển gen nhờ virut nhìn chung ít được sử dụng.

b. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium


  • Giới thiệu chung về Vi khuẩn Agrobacterium

Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí. Chi Agrobacterium gồm 4 loài, trong đó A. tumerfaciens có khả năng tạo ra khối u trong tế bào thực vật thông qua một loại plasmid đặc hiệu gây nên khối u gọi là Ti-plasmid (tumour inducing) [1], [2]. Ti-plasmid có khả năng chuyển một số gen chúng mang vào cây trồng được coi là hiện tượng chuyển gen tự nhiên. Khi các nhà nghiên cứu thành công trong việc sử dụng đoạn T-ADN của Ti-plasmid để đưa gen thâm nhập vào hệ gen của tế bào thực vật thì việc chuyển gen thông qua Agrobacterium trở thành công cụ rất hữu hiệu trong công nghệ gen thực vật. Sự khám phá này đã mở ra một hướng chuyển gen mới vào thực vật.

Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết cho quá trình chuyển gen:

- Vùng T-ADN: là đoạn ADN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật. Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gen của cây chủ, không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gen có thể biểu hiện trong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [4], [5].

- Vùng gây độc Vir (Virulence Region): gồm 24 gen vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gen. Vùng Vir có vai trò kích thích việc biến nạp của T-ADN. Trong đó Vir A; B; D; G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp ở tế bào thực vật, Vir C; E; F; H có tác dụng làm tăng cường hiệu quả quá trình biến nạp gen [18], [23].

- Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong quá trình biến nạp T- ADN, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với quá trình này. Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, cụ thể giúp tạo ra exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC, chvA, hvB) đồng thời gắn vi khuẩn vào tế bào thực vật (tt gens) … Ngoài ra những gen khác như mia A đóng vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến nạp [23].




AND nhân TB TV




Hình 5. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens

  • Cơ chế chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens

Quá trình chuyển T-ADN được bắt đầu ở vị trí biên phải và kết thúc ở vị trí biên trái. Nếu không có sự định hướng này, hiệu quả của quá tình chuyển gen sẽ rất thấp [5]. Đoạn T-ADN mang gen muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hóa nhờ hoạt động của các gen vir. Hiện tượng này xảy ra khi A. tumerfaciens bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy.

Khi nhận được các phân tử tín hiệu từ vết thương thực vật: hợp chất phenolic (cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-AS), flavonoid, đường đơn hoặc các tín hiệu khác như pH axit (pH 5 - 5,5), phosphat và opine, làm

dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành tế bào thực vật (AS, OH-AS được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy tế bào thuốc lá - giống như những sản phẩm của chuyển hoá phenyl propanoid - một khâu chủ yếu trong chu trình tạo các chất thứ cấp như lignin và các chất thơm. Những chất này rất quan trọng đối với thực vật trong các điều kiện stress và bị thương, ta gọi là hợp chất dẫn dụ). Trong quá trình tiếp xúc giữa tế bào thực vật và Agrobacterium, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ thành bó gắn lên bề mặt tế bào thực vật. Quá trình này làm cảm ứng và hoạt hoá các gen vùng vir. Sự thể hiện gen vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng gồm các sản phẩm của virAvirG. Chính các sản phẩm protein của các gen vir đã làm nhiệm vụ vận chuyển T-ADN. Một số bằng chứng chứng tỏ T-ADN được vận chuyển tới nhân tế bào thực vật và gắn hoá trị vào genome thực vật, sau đó, T-ADN được phiên mã nhờ ARN polymerase II [17], [19].

Quá trình chuyển T-ADN cho tế bào thực vật gồm ba sự kiện quan trọng:

• Sự kiện thứ nhất: Hình thành khối u là quá trình biến đổi tế bào thực vật do xâm nhập và hợp nhất của T-ADN vào tế bào thực vật, sau đó biểu hiện các gen trong vùng T-ADN.

• Sự kiện thứ hai: Các gen nằm trong vùng T-ADN sao chép trong các tế bào bị xâm nhiễm và không có vai trò trong quá trình chuyển.

• Sự kiện thứ ba: Vùng ADN lạ đặt giữa các vùng biên của T-ADN có thể được chuyển cho tế bào cây trồng.





Hình 6. Cấu trúc của Ti-plasmid và T-ADN

Каталог: files -> ChuaChuyenDoi
ChuaChuyenDoi -> ĐẠi học quốc gia hà NỘi trưỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Thị Hương XÂy dựng quy trình quản lý CÁc công trìNH
ChuaChuyenDoi -> TS. NguyÔn Lai Thµnh
ChuaChuyenDoi -> Luận văn Cao học Người hướng dẫn: ts. Nguyễn Thị Hồng Vân
ChuaChuyenDoi -> 1 Một số vấn đề cơ bản về đất đai và sử dụng đất 05 1 Đất đai 05
ChuaChuyenDoi -> Lê Thị Phương XÂy dựng cơ SỞ DỮ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loàI ĐỘng vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứU
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Hà Linh
ChuaChuyenDoi -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền một số MẪu giống lúa thu thập tại làO
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiêN
ChuaChuyenDoi -> TRƯỜng đẠi học khoa học tự nhiên nguyễn Văn Cường

tải về 450.48 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
  1   2   3




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2024
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương