LuËn v¨n th¹c sÜ TrÇn V¨n Kh¸nh


Nghiªn cøu m«i tr­êng vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy thÝch hîp ®Ó s¶n sinh ®éc tè E. coli



tải về 1.1 Mb.
trang5/9
Chuyển đổi dữ liệu18.08.2016
Kích1.1 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

3.2.2. Nghiªn cøu m«i tr­êng vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy thÝch hîp ®Ó s¶n sinh ®éc tè E. coli.

Song song víi nghiªn cøu ®éng th¸i sinh tr­ëng cña vi khuÈn, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö ®éc lùc cña dÞch nu«i cÊy theo tõng c«ng thøc vµ m«i tr­êng kh¸c nhau b»ng c¸ch tiªm cho chuét b¹ch.



Chóng t«i ®· chÕ t¹o 9 lo¹i m«i tr­êng víi c¸c chØ tiªu dinh d­ìng kh¸c nhau (phï hîp víi yªu cÇu dinh d­ìng cña E. coli trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nh©n t¹o) nh»m t×m kiÕm mét m«i tr­êng thÝch hîp cho sù sinh tr­ëng vµ s¶n sinh ®éc tè cña E. coli. ChØ tiªu dinh d­ìng cña c¸c lo¹i m«i tr­êng ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 12.

B¶ng 12: ChØ tiªu dinh d­ìng cña c¸c m«i tr­êng nu«i cÊy

M«i tr­êng

§¹m amin (mg/ml)

Tryptophan (mg%)

Pepton (gr%)

NaCl

(%)

pH

MT1

1.297

17.5

2.1

0.351

7.15

MT2

2.330

50.0

2.8

1.390

7.00

MT3

1.760

25.0

2.2

0.769

7.13

MT4

0.440

11.0

2.4

0.910

7.26

MT5

1.205

34.0

2.6

0.806

7.40

MT6

2.160

20.0

3.0

0.720

7.22

MT7

2.820

15.0

3.0

0.860

6.97

MT8

1.650

24.0

3.0

0.430

7.04

MT9

1.360

20.9

2.07

0.183

7.27

Víi 9 lo¹i m«i tr­êng ë trªn, chóng t«i nu«i cÊy chñng Hanco 3 víi c¸c c«ng thøc nu«i cÊy kh¸c nhau ®Ó theo dâi sù liªn quan gi÷a ®éng th¸i sinh tr­ëng víi ®éc lùc cña n­íc läc canh trïng (®éc tè) trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm

Sau khi nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr­êng cã c¸c c«ng thøc nu«i cÊy kh¸c nhau, dÞch nu«i cÊy sèng ®­îc ly t©m ë 7000g/15 phót, thu phÇn n­íc trong, läc qua mµng läc cã kÝch th­íc lç läc 0,2 μm, dung dÞch thu ®­îc sau khi läc gäi lµ dÞch chøa ®éc tè, ký hiÖu lµ T2, chóng t«i tiÕn hµnh tiªm dÞch qua läc T2 cho chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®éc lùc giÕt chuét ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 13.



B¶ng 13: §éc lùc cña dÞch nu«i cÊy ®­îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch tiªm dÞch qua läc T2

M«i tr­êng

Tû lÖ chÕt/ tiªm

§­êng tiªm

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

CT6

CT7

CT8

CT9

MT1

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

0/4

0/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

1/4

1/4

0/4

1/4

MT2

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

1/4

1/4

0/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

1/4

0/4

1/4

0/4

MT3

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

MT4

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

0/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

1/4

0/4

1/4

0/4

MT5

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

0/4

1/4

0/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

1/4

1/4

0/4

MT6

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

1/4

1/4

0/4

1/4

MT7

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

0/4

MT8

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

1/4

1/4

0/4

1/4

MT9

DD

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

FX

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

1/4

1/4

1/4

1/4

TM

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

2/4

2/4

1/4

2/4

Qua b¶ng 13 chóng t«i thÊy ®éc tè nµy yÕu, tiªm d­íi da kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc (chuét kh«ng chÕt) mµ chØ ph¸t hiÖn ®­îc b»ng tiªm phóc xoang hoÆc tÜnh m¹ch. Còng tõ kÕt qu¶ trªn, chóng t«i thÊy m«i tr­êng 9 lµ m«i tr­êng mµ E. coli s¶n sinh ®éc tè m¹nh nhÊt. C¸c c«ng thøc nu«i cÊy 5, 6, 7, 8, 9 lµ nh÷ng c«ng thøc nu«i cÊy mµ E. coli cã thÓ s¶n sinh ®éc tè. Chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm lÆp l¹i nh÷ng c«ng thøc nµy trªn m«i tr­êng 9. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 14.

B¶ng 14: §éc lùc ®­îc x¸c ®Þnh víi liÒu tiªm vµ ®­êng tiªm kh¸c nhau

Tû lÖ chuét chÕt

C«ng thøc

Tiªm phóc xoang

Tiªm tÜnh m¹ch

sè chuét chÕt /chuét tiªm

0,2ml

0,4ml

0,2ml

0,4ml

CT5

1/4

2/4

1/4

3/4

7/12

CT6

0/4

1/4

0/4

2/4

3/12

CT7

0/4

1/4

1/4

2/4

4/12

CT8

0/4

1/4

0/4

1/4

2/12

CT9

0/4

1/4

0/4

2/4

3/12

§C

0/4

0/4

0/4

0/4

0/16

Ghi chó: §C - §èi chøng lµ m«i tr­êng v« trïng

Qua b¶ng 14 chóng t«i thÊy víi c«ng thøc 5 E. coli s¶n sinh ®éc tè m¹nh nhÊt. LÆp l¹i vµ më réng, chóng t«i chÕ t¹o dÞch nu«i cÊy ®éc tè víi tõng chñng E. coli b»ng m«i tr­êng 9 vµ nu«i cÊy theo c«ng thøc 5, sau ®ã kiÓm tra ®éc lùc dÞch nu«i cÊy víi tõng chñng vµ ®a chñng (trén 10 chñng) b»ng c¸ch: tiªm 0,4 ml/con dÞch qua läc T2 vµo tÜnh m¹ch chuét b¹ch, theo dâi tû lÖ chuét chÕt/tiªm. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 15.



B¶ng 15: §éc lùc cña ®éc tè T­2 do c¸c chñng E. coli riªng rÏ vµ kÕt hîp t¹o ra

Gièng Hanco

§­êng tiªm/ liÒu tiªm (ml)

Sè chuét TN

(con)

Sè chuét èm/tiªm

Tû lÖ èm (%)

Sè chuét chÕt/tiªm

Tû lÖ chÕt (%)

Hanco 1

TM/0.4

5

4/5

80

0/5

0

Hanco 2

TM/0.4

5

5/5

100

0/5

0

Hanco 3

TM/0.4

5

5/5

100

1/5

20

Hanco 4

TM/0.4

5

5/5

100

2/5

40

Hanco 5

TM/0.4

5

5/5

100

2/5

40

Hanco 6

TM/0.4

5

5/5

100

5/5

100

Hanco 7

TM/0.4

5

5/5

100

2/5

40

Hanco 8

TM/0.4

5

5/5

100

2/5

40

Hanco 9

TM/0.4

5

5/5

100

2/5

40

Hanco 10

TM/0.4

5

4/5

80

0/5

0

Poly (§a gi¸)

TM/0.4

5

5/5

100

4/5

80

§èi chøng

TM/0.4

5

0/5

0

0/5

0

Ghi chó: §C - §èi chøng lµ m«i tr­êng v« trïng

chuét èm” lµ chuét sau khi tiªm rÊt mÖt, thë m¹nh, thë dèc, l«ng dùng lªn, n»m gôc, kh«ng muèn ho¹t ®éng, tô thµnh tõng ®¸m, bá ¨n. Cã con thØnh tho¶ng bÞ co dËt, cã con ®iªn cuång, ch¹y lung tung, cã con liÖt ch©n sau, ®i kÐo lª trªn sµn. Tr­íc khi chuét chÕt cã thÓ co dËt hoÆc kh«ng; còng cã tr­êng hîp chuét chÕt nhanh, co dËt mÊy lÇn råi chÕt, sau 48 giê con nµo kh«ng chÕt th× håi phôc dÇn.

KÕt qu¶ cho thÊy tõng chñng cã ®éc lùc cña ®éc tè kh¸c nhau, tõng chñng cã thÓ lµm chuét chÕt hoÆc èm kh¸c nhau (chuét ®èi chøng kh«ng cã hiÖn t­îng nµy). Nh­ng ë ®éc tè poly (trén nhiÒu chñng) th× ®éc lùc thÓ hiÖn râ rÖt. §ã lµ sù céng h­ëng cña c¸c ®éc tè.

V× vËy, môc tiªu cña chóng t«i lµ chÕ t¹o kh¸ng nguyªn cã chøa hçn hîp ®éc tè cña nhiÒu chñng E. coli, ®Ó kh¸ng thÓ thu ®­îc cã thÓ ®èi phã víi tÝnh phøc t¹p cña E. coli vµ tÝnh ®a d¹ng bÖnh cña nã g©y ra còng nh­ dÞch tÔ häc cña c¸c bÖnh nµy trong thùc tÕ ch¨n nu«i.

3.3. Nghiªn cøu ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn

3.3.1. Nghiªn cøu ph­¬ng ph¸p lµm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc

KÕ thõa nh÷ng nghiªn cøu tr­íc ®©y vÒ E. coli vµ ®éc tè E. coli, chóng t«i tiÕn hµnh thö nghiÖm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p sau:

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ë nhiÖt ®é 700C trong 30 phót.

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 3 0/00.

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng phenol 5 0/00.

+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng thiomersal 0,40/00.

M«i tr­êng sau khi nu«i cÊy ®¹t tiªu chuÈn ®­îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè, ®­îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p trªn. DÞch nu«i sau khi xö lý, ®­îc ®Æt trong tñ Êm 370C trong 24h.

Sau ®ã chóng t«i tiÕn hµnh kiÓm tra v« trïng theo th­êng quy trªn c¸c m«i tr­êng kh¸c nhau ®Ó xem ë ®iÒu kiÖn ®ã cã bÊt ho¹t ®­îc vi khuÈn hay kh«ng. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 16.



B¶ng 16: KÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t

Canh trïng xö lý

KÕt qu¶ kiÓm tra trªn m«i tr­êng

KÕt qu¶

NA

NB

BA

SA

Thio

700C/30 phót

-

-

-

-

-

§¹t

Formol 3 0/00

-

-

-

-

-

§¹t

Phenol 5 0/00

-

-

-

-

-

§¹t

Thiomersal 0.4 0/00

-

-

-

-

-

§¹t

(-): kh«ng cã vi khuÈn mäc (+): cã vi khuÈn mäc

B»ng kÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng chóng t«i nhËn thÊy c¶ 4 ph­¬ng ph¸p v« ho¹t vµ gi¶i ®éc trªn ®Òu cã kh¶ n¨ng bÊt ho¹t E. coli.

TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra hiÖu qu¶ gi¶i ®éc cña c¸c ph­¬ng ph¸p trªn b»ng c¸ch ly t©m dÞch nu«i cÊy sau khi bÊt ho¹t, lÊy n­íc trong läc qua mµng 0,2 m thu ®­îc dÞch läc gäi lµ “gi¶i ®éc tè”, sau ®ã tiªm gi¶i ®éc tè ®ã cho chuét b¹ch 18 - 20 gam víi liÒu tiªm 0,4 ml vµo tÜnh m¹ch vµ so s¸nh víi tiªu chuÈn ®éc tè ë trªn (tiªu chuÈn ®Ó ®¸nh gi¸ ®éc tè E. coli ®ã lµ cø 0,4ml ®éc tè khi tiªm tÜnh m¹ch cho chuét 18 – 20g, ph¶i g©y chÕt Ýt nhÊt lµ 40% tæng sè chuét ®­îc tiªm). NÕu gi¶i ®éc tè g©y chÕt tíi 40% sè chuét thÝ nghiÖm th× ®éc tè ®ã ch­a ®­îc gi¶i ®éc, tøc lµ ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc ®ã kh«ng ®¹t vµ ng­îc l¹i. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 17.

B¶ng 17: TÝnh an toµn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc


Ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t

LiÒu tiªm (ml)

§­êng tiªm

Tû lÖ chuét chÕt/chuét tiªm

% chuét chÕt

HiÖu qu¶ gi¶i ®éc

700C/30 phót

0,4

TM

2/10

20%

§¹t

Formol 3 0/00

0,4

TM

1/10

10%

§¹t

Phenol 5 0/00

0,4

TM

6/10

60%

Kh«ng ®¹t

Thiomersal 0,40/00

0,4

TM

10/10

100%

Kh«ng ®¹t

KÕt qu¶ trªn cho thÊy:

  • Ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng phenol vµ thiomersal kh«ng nh÷ng kh«ng mang l¹i hiÖu qu¶ gi¶i ®éc mµ cßn lµm t¨ng tÝnh ®éc cña ®éc tè, do ®ã kh«ng thÓ dïng hai hãa chÊt nµy ®Ó gi¶i ®éc ®­îc.

  • Ph­¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 vµ 700C/30 phót cã hiÖu qu¶ gi¶i ®éc t­¬ng ®èi tèt.

3.3.2. KiÓm tra tÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i cÊy sau khi bÊt ho¹t

TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra tÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 vµ 700C/30 phót. Chóng t«i dïng dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®ù¬c bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ®Ó tiªm miÔn dÞch cho chuét b¹ch 18 - 20 gam liÒu 0,4 ml/con vµo d­íi da. Sau tiªm 21 ngµy lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh kiÓm tra hiÖu gi¸ ng­ng kÕt. KÕt qu¶ tr×nh bµy ë b¶ng 18.



B¶ng 18: TÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i ch­a ®éc tè sau khi ®· bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc

Ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t

§­êng tiªm

LiÒu tiªm (ml)

Sè l­îng (con)

HiÖu gi¸ ng­ng kÕt

HGKT trung b×nh

Formol 30/00

DD

0.4

5

1/128 1/64 1/64 1/256 1/128

1/128

700C/30 phót

DD

0.4

5

1/128 1/32 1/64 1/64 1/32

1/64

* “DD”: d­íi da

Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy chuét tiªm dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®­îc xö lý b»ng formol nång ®é 30/00 cho hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao h¬n (trung b×nh 1/128). Nh­ vËy ph­¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 ë 37oC trong 24h cã hiÖu qu¶ tèt nhÊt. DÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc, ®éc lùc gi¶m ®i nh­ng vÉn cã tÝnh kh¸ng nguyªn.



3.3.3. X¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña gi¶i ®éc tè

§éc tè cña E. coli lµ mét yÕu tè quan träng tham gia vµo qu¸ tr×nh g©y bÖnh tiªu ch¶y vµ s­ng phï ®Çu ë lîn. V× vËy, sau khi ®· chÕ t¹o ®­îc dÞch nu«i chøa gi¶i ®éc tè nh­ trªn, cÇn x¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña gi¶i ®éc tè trong dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· gi¶i ®éc.



3.3.3.1. Nghiªn cøu ®¸p øng miÔn dÞch cña gi¶i ®éc tè

Chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®¸p øng miÔn dÞch cña gi¶i ®éc tè trªn ®èi t­îng lµ chuét b¹ch víi ph­¬ng ph¸p nh­ sau:



  • ChÕ t¹o gi¶i ®éc tè E. coli (Kh¸ng nguyªn ®éc tè T2): dÞch nu«i cÊy chøa ®éc tè (hçn hîp 10 chñng E. coli) ®­îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè E. coli ®a gi¸ ®­îc gi¶i ®éc b»ng focmol 30/00 ë 37oC/24h, ly t©m víi tèc ®é 7000g/15phót, lÊy n­íc trong läc qua mµng läc cã kÝch th­íc lç läc 0,2 μm, thu dÞch läc, dÞch läc ®ã gäi lµ gi¶i ®éc tè ­ E. coli ®a gi¸ (hçn hîp gi¶i ®éc tè 10 chñng E. coli). NÕu chÕ t¹o víi mét chñng E. coli th× gäi lµ gi¶i ®éc tè T2 chñng E. coli ®ã.

  • ChÕ t¹o kh¸ng huyÕt thanh:

Chuét b¹ch ®­îc tèi miÔn dÞch b»ng gi¶i ®éc tè ®a gi¸ theo quy tr×nh sau:

LÇn tiªm

1

2

3

4

5

6

§­êng tiªm

DD

DD

FX

DD

FX

DD

LiÒu tiªm (ml)

0.5

0.8

0.4

1.0

0.8

1.2

Mçi mòi ®­îc tiªm c¸ch nhau 1 tuÇn. 21 ngµy sau khi tiªm mòi cuèi cïng th× tiÕn hµnh lÊy m¸u, ch¾t huyÕt thanh.

KiÓm tra sù ®¸p øng miÔn dÞch b»ng ph­¬ng ph¸p kiÓm tra kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh chuét miÔn dÞch b»ng c¸c ph¶n øng huyÕt thanh häc sau:

3.3.3.2. Ph¶n øng kÕt tña trong èng nghiÖm gi÷a gi¶i ®éc tè víi huyÕt thanh cña chuét miÔn dÞch gi¶i ®éc tè

HuyÕt thanh ®­îc ly t©m (tèi thiÓu 4500g/phót) lo¹i hÕt cÆn (nÕu cã). HuyÕt thanh ®­îc pha lo·ng theo cÊp sè 2 nh­ th­êng quy, bæ sung kh¸ng nguyªn ®éc tè vµo huyÕt thanh ®· pha lo·ng theo tû lÖ thÓ tÝch 1:1. HiÖu gi¸ ®­îc x¸c ®Þnh lµ ®é pha lo·ng huyÕt thanh cao nhÊt mµ vÉn thÊy kÕt tña. KÕt tña xuÊt hiÖn râ sau 36 – 48 giê vµ kÕt luËn ë 72 giê sau ph¶n øng. KÕt qu¶ cña ph¶n øng ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 18.





H×nh 3: Ph¶n øng kÕt tña trªn èng nghiÖm gi÷a ®éc tè T2 víi kh¸ng huyÕt thanh

B¶ng 18: Ph¶n øng kÕt tña trong èng nghiÖm gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè ®¬n gi¸

vµ ®a gi¸ E. coli víi huyÕt thanh chuét tiªm gi¶i ®éc tè E. coli ®a gi¸

(hiÖu gi¸ huyÕt thanh ®a gi¸ kh¸ng ®éc tè E. coli)

Kh¸ng nguyªn

§Þnh tÝnh

§Þnh l­îng

§èi chøng 1

§èi chøng 2

T2Hanco 1

+

1/16

-

-

T2Hanco 2

+

1/8

-

-

T2Hanco 3

+

1/4

-

-

T2Hanco 4

+

1/4

-

-

T2Hanco 5

+

1/8

-

-

T2Hanco 6

+

1/2

-

-

T2Hanco 7

+

1/4

-

-

T2Hanco 8

+

1/8

-

-

T2Hanco 9

+

1/4

-

-

T2Hanco 10

+

1/16

-

-

T2 Poli

+

1/16

-

-

§èi chøng 1: HuyÕt thanh kh¸ng E. coli + M«i tr­êng

§èi chøng 2: HuyÕt thanh ©m tÝnh + §éc tè

Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy, ph¶n øng gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸ E. coli víi huyÕt thanh chuét ®Òu cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh, ngoµi ra cßn x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè, tøc lµ ®· cã sù kÕt hîp gi÷a ®éc tè vµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu t­¬ng øng. §iÒu nµy chøng tá kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli ®· g©y ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch.



3.3.3.3. Ph¶n øng kÕt tña khuÕch t¸n kÐp trong th¹ch (ADP) gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè víi huyÕt thanh chuét ®­îc miÔn dÞch gi¶i ®éc tè.

§Ó ph©n tÝch thªm vÒ ®éc tè E. coli trong hçn hîp ®éc tè, chóng t«i tiÕn hµnh ph¶n øng ADP theo kü thuËt Owchterlony. Thµnh phÇn tham gia ph¶n øng gåm cã, kh¸ng nguyªn ®éc tè ®­îc bè trÝ ë giÕng trung t©m, cßn c¸c giÕng xung quanh lµ huyÕt thanh chuét miÔn dÞch ®­îc pha lo·ng theo cÊp sè 2. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 19.



B¶ng 19: Ph¶n øng ADP gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸
víi huyÕt thanh chuét miÔn dÞch gi¶i ®éc tè E. coli
(hiÖu gi¸ huyÕt thanh ®a gi¸ kh¸ng ®éc tè E. coli)


Kh¸ng nguyªn

§Þnh tÝnh

HiÖu gi¸ kÕt tña

§èi chøng 1

§èi chøng 2

T2Hanco 1

+

1/4

-

-

T2Hanco 2

+

1/8

-

-

T2Hanco 3

+

1/4

-

-

T2Hanco 4

+

1/8

-

-

T2Hanco 5

+

1/4

-

-

T2Hanco 6

+

1/8

-

-

T2Hanco 7

+

1/4

-

-

T2Hanco 8

+

1/8

-

-

T2Hanco 9

+

1/4

-

-

T2Hanco 10

+

1/8

-

-

T2 Poli

+

1/16

-

-

* §èi chøng 1: HuyÕt thanh kh¸ng E. coli + M«i tr­êng

§èi chøng 2: HuyÕt thanh ©m tÝnh + §éc tè






H×nh 4. Ph¶n øng ADP gi÷a ®éc tè T2 víi kh¸ng huyÕt thanh

Ph¶n øng ADP d­¬ng tÝnh mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n vÒ tÝnh kh¸ng nguyªn cña ®éc tè, ngoµi ra ta cßn x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ kÕt tña, nghÜa lµ kh¸ng nguyªn ®éc tè g©y miÔn dÞch m¹nh.

KÕt qu¶ cña c¸c ph¶n øng huyÕt thanh trªn cho thÊy:



  • Gi¶i ®éc tè E. coli cã tÝnh kh¸ng nguyªn tèt, ®· kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch.

  • Kh¸ng ®éc tè trong huyÕt thanh chuét ®­îc miÔn dÞch gi¶i ®éc tè cã thÓ ®­îc ph¸t hiÖn qua ph¶n øng kÕt tña víi kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli trong èng nghiÖm, qua ph¶n øng ADP trong gel th¹ch. Qua hai ph¶n øng ®ã cã thÓ x¸c ®Þnh ®­îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè.

  • Mçi chñng E. coli cã kh¶ n¨ng s¶n sinh ®éc tè víi hµm l­îng kh¸c nhau. §éc tè ®a gi¸ m¹nh h¬n vµ g©y miÔn dÞch tèt h¬n ®éc tè ®¬n gi¸.

3.4. Nghiªn cøu c¸c chÊt bæ trî lµm t¨ng miÔn dÞch

Chóng t«i sö dông c¸c chÊt bæ trî: ISA vµ IMS cña h·ng Septic, Al(OH)3 vµ alum cña SPI Pharma. Mçi chÊt bæ trî ®­îc bæ sung vµo dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®­îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc (gäi lµ t¾t lµ kh¸ng nguyªn) víi tû lÖ thÝch hîp. Tr­íc tiªn chóng t«i tiÕn hµnh thö an toµn trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm lµ chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ thu ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 20.



B¶ng 20: TÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn cã chøa c¸c chÊt bæ trî kh¸c nhau

Kh¸ng nguyªn cã chÊt bæ trî

Tû lÖ chuét chÕt/tiªm theo ®­êng tiªm

KÕt luËn

D­íi da (1 ml)

Phóc xoang (0,5)

Nhò hãa ISA

6/10

7/10

Kh«ng ®¹t

Nhò hãa IMS

4/10

4/10

Kh«ng ®¹t

AL(OH)­3

0/10

0/10

§¹t

Alum

0/10

0/10

§¹t

Tõ kÕt qu¶ thö an toµn, chóng t«i nhËn thÊy 2 s¶n phÈm cã bæ trî Al(OH)3 vµ alum khi bæ sung vµo kh¸ng nguyªn E. coli an toµn h¬n so víi s¶n phÈm cã bæ trî dÇu kho¸ng ISA, IMS. Tõ ®©y chóng t«i sö dông 2 s¶n phÈm nµy ®Ó tiÕp tôc nghiªn cøu hiÖu lùc trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm lµ chuét b¹ch.

Chóng t«i tiÕp tôc nghiªn cøu hiÖu lùc cña hai s¶n phÈm trªn b»ng c¸ch miÔn dÞch liÒu 0,4ml/con theo ®­êng tiªm d­íi da trªn chuét b¹ch vµ so s¸nh víi ®èi chøng (®èi chøng lµ chuét miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî). Sau khi tiªm 21 ngµy, tiÕn hµnh lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh, kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh. KÕt qu¶ cô thÓ nh­ sau:



B¶ng 21: KiÓm tra tÝnh miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn cã bæ sung c¸c chÊt bæ trî

ChÊt bæ trî

Nång ®é

HiÖu gi¸ tõng con

HiÖu gi¸ trung b×nh

Al(OH)3­­­­

10/00

1/128 1/64 1/128 1/128 1/128

1/115,2

20/00

1/256 1/128 1/256 1/256 1/128

1/204,8

30/00

1/128 1/256 1/128 1/256 1/128

1/179,2

40/00

1/128 1/256 1/128 1/256 1/64

1/166,4

Alum

0.50/00

1/128 1/64 1/128 1/128 1/64

1/102,4

10/00

1/256 1/128 1/128 1/256 1/128

1/179,2

20/00

1/128 1/512 1/128 1/256 1/128

1/230,4

30/00

1/128 1/256 1/128 1/256 1/64

1/166,4

§èi chøng (kh«ng cã chÊt bæ trî)

1/128 1/64 1/64 1/128 1/128

1/102,4

Nh×n chung chuét ®­îc miÔn dÞch b»ng kh¸ng nguyªn cã chÊt bæ trî cã hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao h¬n so chuét ®èi chøng, cô thÓ:

§èi víi chÊt bæ trî lµ Al(OH)­ ë mçi nång ®é kh¸c nhau th× g©y ra ®¸p øng miÔn dÞch kh¸c nhau trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm. Trong ®ã nång ®é 20/00 cho kÕt qu¶ tèt nhÊt thÓ hiÖn qua hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cña huyÕt thanh chuét lµ cao nhÊt (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/204,8). Nång ®é tèi ­u cña chÊt bæ trî alum còng lµ 20/00 (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/230,4).

Tõ nh÷ng kÕt qu¶ trªn, chóng t«i quyÕt ®Þnh chän alum bæ sung víi nång ®é 2 0/00 lµm chÊt bæ trî cho kh¸ng nguyªn vµ sö dông cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo.
3.5. Nghiªn cøu tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn

Sau khi ®· chän ®­îc chÊt bæ trî thÝch hîp lµ alum 20/00 chóng t«i s¶n xuÊt 3 l« liªn tôc ®Ó kh¶o s¸t tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn nµy trªn nhiÒu lo¹i ®éng vËt kh¸c nhau: chuét lang 250 - 300 gam , thá 1800 - 2000 gam vµ b¶n ®éng vËt lµ gµ hËu bÞ. Mçi loµi ®éng vËt cã mét liÒu l­îng kh¸ng nguyªn kh¸c nhau, ®­êng ®­a thuèc vµo lµ tiªm d­íi da, riªng ®èi víi gµ ®­êng ®­a thuèc vµo lµ tiªm b¾p. Sau khi tiªm, chóng t«i tiÕn hµnh theo dâi c¸c ph¶n øng cña ®éng vËt thÝ nghiÖm vµ sè l­îng ®éng vËt bÞ chÕt trªn tæng sè ®éng vËt ®­îc tiªm. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®­îc thèng kª ë b¶ng 22.



Qua b¶ng kÕt qu¶, chóng t«i thÊy r»ng víi c«ng thøc chÕ t¹o lµ kh¸ng nguyªn + alum 2 0/00, khi tiÕn hµnh thö an toµn víi ba l« s¶n xuÊt kh¸c nhau, ®Òu cho kÕt qu¶ an toµn trªn c¸c ®éng vËt thÝ nghiÖm. Cô thÓ lµ kh«ng cã tr­êng hîp nµo ®éng vËt thÝ nghiÖm bÞ chÕt hoÆc hoÆc ph¶n øng víi chÕ phÈm.

B¶ng 22: KÕt qu¶ thö tÝnh an toµn cña c¸c l« kh¸ng nguyªn trªn ®éng vËt

L« thÝ nghiÖm

Sè chuét lang ph¶n øng /sè tiªm

Sè thá ph¶n øng/sè tiªm

Sè gµ ph¶n øng/sè tiªm

LiÒu dd (ml)

LiÒu dd (ml)

LiÒu dd (ml)

LiÒu tiªm b¾p (ml)

1,0

2,0

3,0

1,0

2,0

3,0

2,0

3,0

4,0

2,0

3,0

4,0

L« 1

0/10

0/10

0/10

0/10

0/10

0/10

0/7

0/8

0/8

0/8

0/8

0/7

§C l« 1

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/4

0/4

0/4

0/4

0/5

0/4

L« 2

0/10

0/10

0/10

0/10

0/10

0/10

0/6

0/6

0/7

0/7

0/7

0/7

§C l« 2

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/3

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

L« 3

0/10

0/10

0/10

0/10

0/10

0/10

0/8

0/8

0/8

0/8

0/8

0/9

§C l« 3

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

Tæng TN

0/30

0/30

0/30

0/30

0/30

0/30

0/21

0/22

0/23

0/23

0/23

0/23

Tæng §C

0/15

0/15

0/15

0/15

0/15

0/15

0/11

0/12

0/12

0/12

0/13

0/12

Ghi chó: §éng vËt kh«ng cã ph¶n øng khi ®­îc tiªm chÕ phÈm.

§èi chøng:M«i tr­êng + formol 30/00 + alum 20/00

3.6. Nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn vµ nghiªn cøu thêi gian s¶n sinh miÔn dÞch sau khi tiªm

§Ó nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch, chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm trªn chuét b¹ch 18-20 gam, víi sè l­îng lµ 40 con cho mét lÇn thÝ nghiÖm. Cø mét tuÇn sau khi miÔn dÞch, tiÕn hµnh lÊy m¸u 10 con ®Ó kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u cña c¸c chuét thÝ nghiÖm. ThÝ nghiÖm ®­îc lÆp l¹i 3 lÇn. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cô thÓ nh­ sau:

B¶ng 23: TÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch


Tiªm d­íi da 0,4ml/con

HGKT trung b×nh trong huyÕt thanh chuét sau tiªm

1 tuÇn

2 tuÇn

3 tuÇn

4 tuÇn

HGKT thÝ nghiÖm lÇn 1

-

1/32

1/218

1/230

HGKT thÝ nghiÖm lÇn 2

-

1/34

1/230

1/230

HGKT thÝ nghiÖm lÇn 3

-

1/28

1/205

1/218

HGKT chuét ®èi chøng (chuét tiªm kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî)

-

1/28

1/128

1/115

B¶ng 23 vµ h×nh 5 cho thÊy sau khi miÔn dÞch mét tuÇn c¸c chuét thÝ nghiÖm ch­a cã sù ®¸p øng miÔn dÞch, sang tuÇn thø hai trong huyÕt thanh chuét ®· b¾t ®Çu cã kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i kh¸ng nguyªn E. coli nh­ng hiÖu gi¸ vÉn cßn thÊp (kho¶ng 1/32). ë tuÇn thø ba thø t­ hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ lµ cao nhÊt (kho¶ng 1/128 – 1/256).



KÕt qu¶ trªn cho thÊy, kh¸ng huyÕt thanh cña nh÷ng ®éng vËt thÝ nghiÖm ®­îc miÔn dÞch kh¸ng nguyªn cã thªm chÊt bæ trî alum 2 0/00 cã hiÖu gi¸ cao h¬n so víi huyÕt thanh cña nh÷ng con ®èi chøng (®­îc miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî). §iÒu nµy chøng tá kh¸ng nguyªn cã bæ sung thªm chÊt bæ trî alum 2 0/00 cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch tèt.



1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương