LuËn v¨n th¹c sÜ TrÇn V¨n Kh¸nh
tải về 1.1 Mb.
|
- Điều hướng trang này:
- 2.1.2. §éng vËt thÝ nghiÖm
- 2.1.3.1. C¸c lo¹i m«i trêng
- 2.1.3.3 C¸c lo¹i huyÕt thanh chuÈn ®Ó ®Þnh type E. coli
- 2.2. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu
- 2.2.2. Ph©n lËp, gi¸m ®Þnh vµ x¸c ®Þnh c¸c yÕu tè g©y bÖnh cña E. coli
- 2.2.2.2. Gi¸m ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt hãa häc cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®îc b»ng ph¬ng ph¸p thêng quy
- 2.2.2.3. X¸c ®Þnh serotype cña E. coli b»ng ph¶n øng ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh theo ph¬ng ph¸p thêng quy
2.1. Nguyªn liÖu nghiªn cøu2.1.1. MÉu thÝ nghiÖmMÉu ph©n, bÖnh phÈm: ph©n lîn con bÞ tiªu ch¶y ë giai ®o¹n tõ s¬ sinh ®Õn 21 ngµy tuæi. Ph©n vµ bÖnh phÈm lîn tõ 22 ®Õn 60 ngµy tuæi m¾c bÖnh phï ®Çu ®· chÕt hoÆc gÇn chÕt gåm: m¸u, dÞch ruét, h¹ch ruét, gan, l¸ch, phæi, ph©n trong trùc trµng. 2.1.2. §éng vËt thÝ nghiÖmChuét b¹ch: 18 - 20 gam, kháe m¹nh; chuét lang trëng thµnh; thá: 2,5-3,0 kg, kháe m¹nh, kh«ng m¾c bÖnh ngoµi da; gµ ®Î gièng siªu trøng (Hyline, Leghorn): trung b×nh 2,5-3 kg/con. 2.1.3. C¸c lo¹i hãa chÊt, m«i trêng, kh¸ng huyÕt thanh2.1.3.1. C¸c lo¹i m«i trêngBao gåm: th¹ch m¸u, th¹ch Mac Conkey, NB (nutrient broth), NA (nutrient agar), m«i trêng BHI, m«i trêng do h·ng Oxoid (Anh) s¶n xuÊt. 2.1.3.2. C¸c lo¹i hãa chÊtC¸c lo¹i ®êng: lactose, sucrose, dulcitol, salicin, sorbitol, arabinose, raffnose, mannitol, rhamnose, xylose, maltose, trehalose. Thuèc nhuém Gram, dung dÞch PBS, dung dÞch Kowacs, dung dÞch Andrader do h·ng Oxoid s¶n xuÊt. 2.1.3.3 C¸c lo¹i huyÕt thanh chuÈn ®Ó ®Þnh type E. coliKh¸ng huyÕt thanh chuÈn x¸c ®Þnh nhãm huyÕt thanh (serogroup) vµ kiÓu huyÕt thanh (serotype) cña E. coli (NhËt B¶n). 2.1.4. ThiÕt bÞ, dông cô M¸y mãc, thiÕt bÞ: m¸y ly t©m (Eppendorf), m¸y l¾c (NhËt), c©n vi lîng (Sartorius, §øc), lß vi sãng, m¸y Vortex, nåi lªn men (Trung Quèc), m¸y ®o pH (Mü), m¸y ®o OD, v.v... Dông cô: pipetman (Eppendorf), ®Çu c«n 1000l, 200l (Greiner Bio-one), èng ly t©m kÝch cì 15ml, 50ml, phiÕn kÝnh, b×nh tam gi¸c thñy tinh c¸c cì, v.v... C¸c dông cô ph¶i ®îc sÊy hoÆc hÊp v« trïng.
2.2.1. Ph¬ng ph¸p lÊy mÉuMÉu ph©n ®îc lÊy tõ trùc trµng lîn con bÞ tiªu ch¶y cho vµo èng nghiÖm v« trïng ®em vÒ phßng thÝ nghiÖm trong vßng 6 giê ®Ó nu«i cÊy, ph©n lËp vi khuÈn. BÖnh phÈm lµ phñ t¹ng lîn ®îc lÊy b»ng c¸ch ®a c¶ con lîn bÞ phï ®Çu ®· chÕt hoÆc gÇn chÕt vÒ phßng thÝ nghiÖm, mæ lÊy bÖnh phÈm gåm: m¸u, dÞch ruét, h¹ch ruét, ruét, gan, l¸ch, phæi trong trùc trµng ®Ó nu«i cÊy, ph©n lËp vi khuÈn. 2.2.2. Ph©n lËp, gi¸m ®Þnh vµ x¸c ®Þnh c¸c yÕu tè g©y bÖnh cña E. coli2.2.2.1. Ph¬ng ph¸p ph©n lËp vµ gi¸m ®Þnh E.coliQuy tr×nh ph©n lËp vµ gi¸m ®Þnh E. coli ®îc tr×nh bµy theo s¬ ®å 1. CÊy 0,2 ml huyÔn dÞch ph©n, bÖnh phÈm ë ®é pha lo·ng 10-5 trªn th¹ch Istrati. Sau khi cÊy vµ båi dìng ë 370C trong 24 giê ®Õm khuÈn l¹c. Chän khuÈn l¹c cã d¹ng S, cã mµu vµng ®Æc trng trªn m«i trêng th¹ch Istrati cÊy sang m«i trêng Mac Conkey vµ m«i trêng Brilliant green agar båi dìng ë 370C trong 24 giê lÊy ra quan s¸t tÝnh chÊt mäc, mµu s¾c khuÈn l¹c, ®é tinh khiÕt. NÕu thuÇn khiÕt, cÊy gi÷ gièng trªn th¹ch m¸u ®Ó tiÕn hµnh kiÓm tra h×nh th¸i vµ gi¸m ®Þnh c¸c tiªu chuÈn kh¸c. S¬ ®å 1: Ph©n lËp vµ gi¸m ®Þnh E. coli tõ ph©n vµ bÖnh phÈm 
2.2.2.2. Gi¸m ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt hãa häc cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®îc b»ng ph¬ng ph¸p thêng quyTõ c¸c gièng E. coli ph©n lËp ®· ®îc thuÇn khiÕt, tiÕn hµnh gi¸m ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt hãa häc c¬ b¶n nh ®Æc tÝnh h×nh th¸i, tÝnh chÊt nu«i cÊy vµ c¸c ph¶n øng lªn men ®êng. - KiÓm tra h×nh th¸i häc: tõ gièng ph©n lËp gi÷ trªn th¹ch m¸u cÊy chuyÓn ra níc thÞt hoÆc th¹ch nghiªng, lµm tiªu b¶n nhuém Gram ®Ó kiÓm tra. - KiÓm tra kh¶ n¨ng di ®éng: cÊy chÝch s©u vi khuÈn vµo th¹ch mÒm hoÆc xem di ®éng cña vi khuÈn trùc tiÕp trªn kÝnh hiÓn vi b»ng tiªu b¶n giät treo. - KiÓm tra tÝnh chÊt mäc b»ng c¸ch nu«i cÊy trªn c¸c m«i trêng: níc thÞt, th¹ch thêng, th¹ch m¸u, c¸c m«i trêng ®Æc biÖt nh: Istrati, Mac Conkey, Brilliant green agar. Quan s¸t tÝnh chÊt mäc, h×nh th¸i, kÝch thíc vµ mµu s¾c khuÈn l¹c. - KiÓm tra c¸c ®Æc tÝnh lªn men ®êng cña E. coli:
Kü thuËt cÊy: Dïng que cÊy v« trïng chÊm vµo khuÈn l¹c ®Þnh kiÓm tra, ria mét ®êng ë phÇn th¹ch nghiªng vµ c¾m que cÊy th¼ng xuèng phÇn th¼ng ®øng nhng kh«ng ch¹m vµo ®¸y èng, båi dìng ë 370C trong 24 giê. §äc kÕt qu¶ (chËm nhÊt lµ 48 giê). M«i trêng KIA cho phÐp ®äc c¸c tÝnh chÊt: Kh¶ n¨ng lªn men ®êng lactose: Vi khuÈn cã kh¶ n¨ng lªn men ®êng lactose lµm cho phÇn th¹ch nghiªng chuyÓn sang mµu vµng, ngîc l¹i th× gi÷ nguyªn mµu. Kh¶ n¨ng lªn men ®êng glucose: Vi khuÈn cã kh¶ n¨ng lªn men ®êng glucose th× chuyÓn phÇn th¹ch ®øng tõ mµu hång sang mµu vµng râ, vi khuÈn kh«ng lªn men ®êng glucose th× gi÷ nguyªn mµu. NÕu sinh h¬i th× phÇn th¹ch ®øng bÞ nøt hoÆc t¹o thµnh bät khÝ bªn trong th¹ch ®øng, cã thÓ ®Èy toµn bé phÇn th¹ch lªn cao, ë díi lµ h¬i.
Trong m«i trêng dinh dìng Nutrient Broth ®· bæ sung thªm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cån vµ c¸c lo¹i dung dÞch ®êng cÇn kiÓm tra, cÊy vi khuÈn vµo, båi dìng trong tñ Êm 370C/24 giê ®äc kÕt qu¶. Ph¶n øng d¬ng tÝnh khi m«i trêng chuyÓn mµu hång, ©m tÝnh khi m«i trêng vÉn gi÷ nguyªn mµu s¾c ban ®Çu.
Trong m«i trêng dinh dìng Nutrient Broth, cÊy E. coli cÇn kiÓm tra, båi dìng ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 43 - 470C/24 giê, nhá thuèc thö Kowacs vµo. Ph¶n øng d¬ng tÝnh khi mét vßng trßn ®á xuÊt hiÖn ë trªn cïng èng m«i trêng nu«i cÊy. Ph¶n øng ©m tÝnh khi vßng trßn ®á kh«ng xuÊt hiÖn. 2.2.2.3. X¸c ®Þnh serotype cña E. coli b»ng ph¶n øng ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh theo ph¬ng ph¸p thêng quy- VËt liÖu dïng x¸c ®Þnh:
- E. coli cã nhiÒu serotype, v× vËy ®Ó x¸c ®Þnh serotype E. coli, tiÕn hµnh lµm ph¶n øng víi kh¸ng huyÕt thanh nhãm (serogroup), sau ®ã míi tiÕn hµnh x¸c ®Þnh serotype víi kh¸ng huyÕt thanh ®¬n gi¸ thuéc nhãm kh¸ng huyÕt thanh ®· ngng kÕt. C¸ch tiÕn hµnh nh sau:
Каталог: jspui -> bitstream -> 123456789 123456789 -> Nguyễn Ngọc Lý Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu về Môi trường và Cộng đồng 123456789 -> Vò Quúnh Thu Cao häc K18 123456789 -> Khoa Báo chí Đhkhxh&NV 123456789 -> Acknowledgements 123456789 -> Danh mục chữ viết tắT 123456789 -> Chương TỔng quan vật liệu mao quản trung bình (mqtb) trật tự 1 Giới thiệu chung 123456789 -> Khoa hóa họC (141 142 báo cáo) tải về 1.1 Mb. Chia sẻ với bạn bè của bạn:
|