LuËn v¨n th¹c sÜ TrÇn V¨n Kh¸nh



tải về 1.1 Mb.
trang2/9
Chuyển đổi dữ liệu18.08.2016
Kích1.1 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

2.1. Nguyªn liÖu nghiªn cøu

2.1.1. MÉu thÝ nghiÖm


MÉu ph©n, bÖnh phÈm: ph©n lîn con bÞ tiªu ch¶y ë giai ®o¹n tõ s¬ sinh ®Õn 21 ngµy tuæi. Ph©n vµ bÖnh phÈm lîn tõ 22 ®Õn 60 ngµy tuæi m¾c bÖnh phï ®Çu ®· chÕt hoÆc gÇn chÕt gåm: m¸u, dÞch ruét, h¹ch ruét, gan, l¸ch, phæi, ph©n trong trùc trµng.

2.1.2. §éng vËt thÝ nghiÖm


Chuét b¹ch: 18 - 20 gam, kháe m¹nh; chuét lang tr­ëng thµnh; thá: 2,5-3,0 kg, kháe m¹nh, kh«ng m¾c bÖnh ngoµi da; gµ ®Î gièng siªu trøng (Hyline, Leghorn): trung b×nh 2,5-3 kg/con.

2.1.3. C¸c lo¹i hãa chÊt, m«i tr­êng, kh¸ng huyÕt thanh

2.1.3.1. C¸c lo¹i m«i tr­êng


Bao gåm: th¹ch m¸u, th¹ch Mac Conkey, NB (nutrient broth), NA (nutrient agar), m«i tr­êng BHI, m«i tr­êng do h·ng Oxoid (Anh) s¶n xuÊt.

2.1.3.2. C¸c lo¹i hãa chÊt


C¸c lo¹i ®­êng: lactose, sucrose, dulcitol, salicin, sorbitol, arabinose, raffnose, mannitol, rhamnose, xylose, maltose, trehalose.

Thuèc nhuém Gram, dung dÞch PBS, dung dÞch Kowacs, dung dÞch Andrader do h·ng Oxoid s¶n xuÊt.


2.1.3.3 C¸c lo¹i huyÕt thanh chuÈn ®Ó ®Þnh type E. coli


Kh¸ng huyÕt thanh chuÈn x¸c ®Þnh nhãm huyÕt thanh (serogroup) vµ kiÓu huyÕt thanh (serotype) cña E. coli (NhËt B¶n).

2.1.4. ThiÕt bÞ, dông cô

M¸y mãc, thiÕt bÞ: m¸y ly t©m (Eppendorf), m¸y l¾c (NhËt), c©n vi l­îng (Sartorius, §øc), lß vi sãng, m¸y Vortex, nåi lªn men (Trung Quèc), m¸y ®o pH (Mü), m¸y ®o OD, v.v...

Dông cô: pipetman (Eppendorf), ®Çu c«n 1000l, 200l (Greiner Bio-one), èng ly t©m kÝch cì 15ml, 50ml, phiÕn kÝnh, b×nh tam gi¸c thñy tinh c¸c cì, v.v... C¸c dông cô ph¶i ®­îc sÊy hoÆc hÊp v« trïng.

2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu

2.2.1. Ph­¬ng ph¸p lÊy mÉu


MÉu ph©n ®­îc lÊy tõ trùc trµng lîn con bÞ tiªu ch¶y cho vµo èng nghiÖm v« trïng ®em vÒ phßng thÝ nghiÖm trong vßng 6 giê ®Ó nu«i cÊy, ph©n lËp vi khuÈn.

BÖnh phÈm lµ phñ t¹ng lîn ®­îc lÊy b»ng c¸ch ®­a c¶ con lîn bÞ phï ®Çu ®· chÕt hoÆc gÇn chÕt vÒ phßng thÝ nghiÖm, mæ lÊy bÖnh phÈm gåm: m¸u, dÞch ruét, h¹ch ruét, ruét, gan, l¸ch, phæi trong trùc trµng ®Ó nu«i cÊy, ph©n lËp vi khuÈn.


2.2.2. Ph©n lËp, gi¸m ®Þnh vµ x¸c ®Þnh c¸c yÕu tè g©y bÖnh cña E. coli

2.2.2.1. Ph­¬ng ph¸p ph©n lËp vµ gi¸m ®Þnh E.coli


Quy tr×nh ph©n lËp vµ gi¸m ®Þnh E. coli ®­îc tr×nh bµy theo s¬ ®å 1.

CÊy 0,2 ml huyÔn dÞch ph©n, bÖnh phÈm ë ®é pha lo·ng 10-5 trªn th¹ch Istrati. Sau khi cÊy vµ båi d­ìng ë 370C trong 24 giê ®Õm khuÈn l¹c. Chän khuÈn l¹c cã d¹ng S, cã mµu vµng ®Æc tr­ng trªn m«i tr­êng th¹ch Istrati cÊy sang m«i tr­êng Mac Conkey vµ m«i tr­êng Brilliant green agar båi d­ìng ë 370C trong 24 giê lÊy ra quan s¸t tÝnh chÊt mäc, mµu s¾c khuÈn l¹c, ®é tinh khiÕt. NÕu thuÇn khiÕt, cÊy gi÷ gièng trªn th¹ch m¸u ®Ó tiÕn hµnh kiÓm tra h×nh th¸i vµ gi¸m ®Þnh c¸c tiªu chuÈn kh¸c.



S¬ ®å 1: Ph©n lËp vµ gi¸m ®Þnh E. coli tõ ph©n vµ bÖnh phÈm



2.2.2.2. Gi¸m ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt hãa häc cña c¸c chñng E. coli ph©n lËp ®­îc b»ng ph­¬ng ph¸p th­êng quy


Tõ c¸c gièng E. coli ph©n lËp ®· ®­îc thuÇn khiÕt, tiÕn hµnh gi¸m ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt hãa häc c¬ b¶n nh­ ®Æc tÝnh h×nh th¸i, tÝnh chÊt nu«i cÊy vµ c¸c ph¶n øng lªn men ®­êng.

- KiÓm tra h×nh th¸i häc: tõ gièng ph©n lËp gi÷ trªn th¹ch m¸u cÊy chuyÓn ra n­íc thÞt hoÆc th¹ch nghiªng, lµm tiªu b¶n nhuém Gram ®Ó kiÓm tra.

- KiÓm tra kh¶ n¨ng di ®éng: cÊy chÝch s©u vi khuÈn vµo th¹ch mÒm hoÆc xem di ®éng cña vi khuÈn trùc tiÕp trªn kÝnh hiÓn vi b»ng tiªu b¶n giät treo.

- KiÓm tra tÝnh chÊt mäc b»ng c¸ch nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr­êng: n­íc thÞt, th¹ch th­êng, th¹ch m¸u, c¸c m«i tr­êng ®Æc biÖt nh­: Istrati, Mac Conkey, Brilliant green agar. Quan s¸t tÝnh chÊt mäc, h×nh th¸i, kÝch th­íc vµ mµu s¾c khuÈn l¹c.

- KiÓm tra c¸c ®Æc tÝnh lªn men ®­êng cña E. coli:


  • Trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng KIA (Kligler Iron Agar)

Kü thuËt cÊy: Dïng que cÊy v« trïng chÊm vµo khuÈn l¹c ®Þnh kiÓm tra, ria mét ®­êng ë phÇn th¹ch nghiªng vµ c¾m que cÊy th¼ng xuèng phÇn th¼ng ®øng nh­ng kh«ng ch¹m vµo ®¸y èng, båi d­ìng ë 370C trong 24 giê. §äc kÕt qu¶ (chËm nhÊt lµ 48 giê).

M«i tr­êng KIA cho phÐp ®äc c¸c tÝnh chÊt:

Kh¶ n¨ng lªn men ®­êng lactose: Vi khuÈn cã kh¶ n¨ng lªn men ®­êng lactose lµm cho phÇn th¹ch nghiªng chuyÓn sang mµu vµng, ng­îc l¹i th× gi÷ nguyªn mµu.

Kh¶ n¨ng lªn men ®­êng glucose: Vi khuÈn cã kh¶ n¨ng lªn men ®­êng glucose th× chuyÓn phÇn th¹ch ®øng tõ mµu hång sang mµu vµng râ, vi khuÈn kh«ng lªn men ®­êng glucose th× gi÷ nguyªn mµu. NÕu sinh h¬i th× phÇn th¹ch ®øng bÞ nøt hoÆc t¹o thµnh bät khÝ bªn trong th¹ch ®øng, cã thÓ ®Èy toµn bé phÇn th¹ch lªn cao, ë d­íi lµ h¬i.



  • Kh¶ n¨ng lªn men c¸c lo¹i ®­êng kh¸c

Trong m«i tr­êng dinh d­ìng Nutrient Broth ®· bæ sung thªm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cån vµ c¸c lo¹i dung dÞch ®­êng cÇn kiÓm tra, cÊy vi khuÈn vµo, båi d­ìng trong tñ Êm 370C/24 giê ®äc kÕt qu¶. Ph¶n øng d­¬ng tÝnh khi m«i tr­êng chuyÓn mµu hång, ©m tÝnh khi m«i tr­êng vÉn gi÷ nguyªn mµu s¾c ban ®Çu.

Trong m«i tr­êng dinh d­ìng Nutrient Broth, cÊy E. coli cÇn kiÓm tra, båi d­ìng ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 43 - 470C/24 giê, nhá thuèc thö Kowacs vµo. Ph¶n øng d­¬ng tÝnh khi mét vßng trßn ®á xuÊt hiÖn ë trªn cïng èng m«i tr­êng nu«i cÊy. Ph¶n øng ©m tÝnh khi vßng trßn ®á kh«ng xuÊt hiÖn.

2.2.2.3. X¸c ®Þnh serotype cña E. coli b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh theo ph­¬ng ph¸p th­êng quy


- VËt liÖu dïng x¸c ®Þnh:

  • C¸c chñng E. coli ®­îc l­u gi÷ trªn th¹ch m¸u.

  • Kh¸ng huyÕt thanh chuÈn (nhãm vµ ®¬n gi¸), n­íc muèi sinh lý 0,85%, phiÕn kÝnh s¹ch.

- E. coli cã nhiÒu serotype, v× vËy ®Ó x¸c ®Þnh serotype E. coli, tiÕn hµnh lµm ph¶n øng víi kh¸ng huyÕt thanh nhãm (serogroup), sau ®ã míi tiÕn hµnh x¸c ®Þnh serotype víi kh¸ng huyÕt thanh ®¬n gi¸ thuéc nhãm kh¸ng huyÕt thanh ®· ng­ng kÕt. C¸ch tiÕn hµnh nh­ sau:

  • Trªn mét phiÕn kÝnh s¹ch, ë hai ®Çu nhá hai giät n­íc sinh lý. Dïng que cÊy v« trïng lÊy khuÈn l¹c E. coli cÇn x¸c ®Þnh serotype mäc trªn th¹ch Mac Conkey hoÆc th¹ch m¸u hßa tan vµo hai giät n­íc muèi sinh lý ë hai ®Çu cña phiÕn kÝnh.

  • Dïng que cÊy v« trïng lÊy mét vßng que cÊy kh¸ng huyÕt thanh nhãm trén ®Òu vµo mét bªn huyÔn dÞch vi khuÈn, huyÔn dÞch vi khuÈn bªn kia phiÕn kÝnh kh«ng trén huyÕt thanh ®a gi¸ nhãm (®èi chøng ©m). §Ó yªn tõ 1-2 phót ë nhiÖt ®é phßng, ®äc kÕt qu¶ ph¶n øng. Ph¶n øng d­¬ng tÝnh khi trong giät huyÔn dÞch kh¸ng huyÕt thanh vµ vi khuÈn xuÊt hiÖn nh÷ng h¹t ng­ng kÕt lÊm chÊm, møc ®é ng­ng kÕt ®­îc ®¸nh gi¸ theo thang bËc: +, ++, +++, ++++. Ph¶n øng ©m tÝnh khi huyÔn dÞch vi khuÈn vµ kh¸ng huyÕt thanh vÉn ®ôc ®Òu kh«ng cã h¹t ng­ng kÕt xuÊt hiÖn nh­ bªn ®èi chøng ©m.

  • Chän nh÷ng khuÈn l¹c cã ng­ng kÕt víi kh¸ng huyÕt thanh nhãm, tiÕn hµnh lµm ng­ng kÕt víi tõng kh¸ng huyÕt thanh ®¬n gi¸ thuéc nhãm nh­ ®· tiÕn hµnh víi nhãm. NhËn xÐt kÕt qu¶ nh­ ®èi víi kh¸ng huyÕt thanh nhãm. NÕu mét vi khuÈn ng­ng kÕt chÐo víi nhiÒu nhãm, hoÆc nhiÒu kh¸ng huyÕt thanh ®¬n gi¸ th× ph¶i tiÕn hµnh pha lo·ng kh¸ng huyÕt thanh thµnh c¸c ®é pha lo·ng kh¸c nhau theo hÖ sè 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,...), råi lµm ph¶n øng víi tõng ®é pha lo·ng.

  • Serotype nµo ng­ng kÕt ë hiÖu gi¸ pha lo·ng kh¸ng huyÕt thanh cao nhÊt th× ®ã lµ serotype cña vi khuÈn.



1   2   3   4   5   6   7   8   9


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương