Luận văn Thạc sỹ 2007 2009

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu. Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm. Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm. Biện pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử dụng kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi -Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở thành cấp bách. Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic. Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ.

Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng. Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi” với định hướng đưa ra được các giải pháp công nghệ để sản xuất các chế phẩm nói trên bằng các nguyên liệu trong nước. Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản xuất các sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo hướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu.

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic

1.1.1. Lịch sử probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [53].

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53].

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [26].

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [27]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [26]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [27].

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.

1.1.2. Định nghĩa probiotic

Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.

1.2. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi

Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh [36].

Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). Theo thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995). Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500 (Tannock, 1999). Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau (khoảng 10¹-10³; 10¹-10⁴; 10⁵-10⁸ và 10⁹-10¹² cfu/ml chất chứa tương ứng) (Jans, 2005).

Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994). Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005).

1.3.1. Vai trò của probiotic

Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:

- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ.

- Tăng cường khả năng miễn dịch.

- Giảm phản ứng viêm.

- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi.

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.

- Tăng hấp thu chất khoáng.

- Làm giảm cholesterol huyết thanh.

- Làm tăng năng suất vật nuôi.

- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.

Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường. Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng.

1.3.2. Cơ chế tác động

Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006). Minh họa cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1.

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí bám dính. Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella... Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii) không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002). Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển.

Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh các chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số axit hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996).

Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999). Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai. Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas và ctv, 1999). Tuy nhiên, cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ.

1.4. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

1.4.1. Lựa chọn các chủng probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh (colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic [22].

Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:

• 
  Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hoá và sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch của vật chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác.
  
• 
  Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Campylobacteria. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
  

+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.

+ Tạo ra H₂O₂.

+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.

+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.

• 
  Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylaza, proteaza, lysozym…). Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này. Hiện nay các công ty đã khuyến cáo dùng vỏ bọc (microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.
  
• 
  Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1-3% [48]. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và phytaza có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ.
  

• 
  Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và Bifidobacterium.
  

Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis (B. animalis), B. licheniformis, B. longum

• 
  Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae.
  

Như đã trình bày ở phần 1.4.2 có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu phát triển chế phẩm là vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men. Vai trò cũng như cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau [36], cụ thể có trong bảng sau:

1.4.4. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic

Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôi bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia súc, gia cầm [9]. Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môi trường trước khi vào cơ thể động vật. Điều này cho thấy là yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môi trường. Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hoá, bệnh nhiếm khuẩn và các phản ứng phụ. Ngoài ra cần có những thông số phân tích sinh hoá về máu và đánh giá chỉ số coliform trong phân. Đối với con người không cần thiết phải thử nghiệm như trên động vật nhưng cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt (Arturo et al, 2006). Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người và động vật, không mang gen lạ. Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được khuyến cáo sử dụng. Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải được cụ thể hoá các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài. Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Uỷ ban khoa học về dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific committee for animal nutrition) đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ thuật online ((SCAN, 2000).

Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices).

1.4.5. Phân loại vi sinh vật

Yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định danh chính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002). Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại KIT định danh vi sinh vật khác nhau như API 50CH, API-20E... Tuy nhiên các KIT này được phát triển dựa trên các đặc tính sinh lý và sinh hoá của các vi sinh vật đã biết, vì vậy với yêu cầu định danh chính xác cần kết hợp các đặc tính phân loại về hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử. Phương pháp định danh dựa theo sinh học phân tử hiện nay chủ yếu vẫn là dựa theo kỹ thuật giải trình tự đoạn gen mã hoá cho ARN riboxom 16S (đối với vi khuẩn) và đoạn D1D2 của gen mã hoá cho ARN riboxom 28S hoặc vùng ITS (đối với nấm men). Trong những điều kiện cho phép thì người ta tiến hành kỹ thuật lai ADN với các chủng chuẩn để khẳng định vị trí phân loại của chủng nghiên cứu tới loài.

1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam

1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới

Việc sử dụng thực phẩm có probiotic (hoặc như 1 thành phần tự nhiên của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20 (Patterson và ctv, 2003). Những nghiên cứu phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi Savage (1987); Vahjen và ctv (1998); Apajalahti và ctv (1998); Vander Wielen và ctv (2000) đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus. Bằng kỹ thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotic (Patterson và ctv, 2003). Apajialahti và ctv (1998); Netherwood và ctv (1999); Gong và ctv (2002); Zhu và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotic. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson và ctv, 2003). Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotic đối với đời sống động vật như tác động của probiotic đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Myer, 1991; Hersbberg và Mayer, 2000); đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (Glick, 1995; Fontaine và ctv, 1996; Dai và ctv, 2000; McCracken và Lorenz, 2001).

Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic còn rất hạn chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các axit béo bay hơi, các chất giống kháng sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C. Knight và cs, 2009).

Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic trong nghiên cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về sử dụng các sản phẩm probiotic trong chăn nuôi rất khác nhau, đôi khi trái ngược nhau. Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy có đáp ứng tích cực (Henrich và ctv, 2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức ăn...). Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên lợn (Breston và ctv, 1995): không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic (Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn choai và vỗ béo; Navas-Sanchez và ctv (1995): khuyến cáo rằng đối với lợn con sau cai sữa không nên sử dụng các chế phẩm probiotic; Galassi và ctv (2001): không thấy có sự khác nhau về tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lượng ở các nhóm lợn thí nghiệm và đối chứng được ăn thức ăn có và không có bổ sung probiotic...

Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quả nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩm probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ các đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của probiotic có thể là nguyên nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính.

1.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam

Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Lê Thanh Bình và ctv (1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99. Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6%. Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) đã phân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi. Nguyễn Thị Hồng Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 10⁶ CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella. Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng nấm men Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước đầu đã đưa ra quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này. Nguyễn La Anh và ctv (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 10⁸ CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá. Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các enzym -amylaza và proteaza dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi. Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao.

Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

Bảng 3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường

Sản phẩm	Nước sản xuất	Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)
		Vi khuẩn Lactic	Bacillus	Nấm men
BioGuard	Việt Nam	107
E.lac	Hàn Quốc	2 x 107		4 x 107
BioSix	Việt Nam		105	105
Lactacids	Việt Nam	107
Adepro	Việt Nam	107
Lactizym	Việt Nam		6 x 105
Ferment	Trung Quốc		109
Lacto-Sacc	Mỹ	2,5 x 108		4,6 x 106

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Nguồn vi sinh vật

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích từ các nguồn khác nhau: chất chứa trong đường tiêu hóa của lợn, gà; các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các thực phẩm lên men…)

- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng

2.1.2.1. Hóa chất

Glucoza; MgSO₄.7H₂O; NaCl; K₂HPO₄; CaCO₃; FeCl₃.6H₂O; Pepton; cao nấm men; cao malt; Tween 80; cao thịt; KI; I₂ và các hóa chất khác của hãng Merck, Sigma…

Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) – Viện Vi Vinh Vật – Đại học Quốc gia Hà Nội. Bao gồm:

Kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản)

Nồi lên men (Hanil R&D- Hàn Quốc)

Máy sấy phun (Changzou SPD-5, Trung quốc)

Máy ly tâm lạnh C30P (Sigma, Đức)

Máy điện di ADN, máy phát hiện ADN trên gel (Biorad, Mỹ)

Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)

Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ)

Máy PCR Mastercycler gradient (Eppendorf, Đức)

Máy đo quang phổ Ultrospec 3000 pro (Anh)

Tủ cấy vô trùng (Nuaire, Mỹ)

Cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ)

2.1.3. Môi trường nghiên cứu

Thạch 15,0 NaCl 1,0

Pepton 5,0 Nước cất vừa đủ 1000ml

Cao thịt 2,0

pH= 7,0; khử trùng ở 121^oC/15 phút

2.1.3.4. Môi trường YM (g/l):

Glucoza	10,0	Cao nấm men	3,0
Pepton	5,0	Thạch	15,0
Cao malt	3,0	Nước cất vừa đủ	1000 ml
pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút

2.1.3.5. Môi trường Mueller Hinton (g/l):

Cao thịt	2,0	Tinh bột	1,5
Axit casein Hydrolysate	17,5	Thạch	15,0
Nước cất vừa đủ	1000 ml
pH= 7,3; khử trùng ở 121oC/15 phút

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng

Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ. Phương pháp như sau: lấy phần dịch nuôi cấy các chủng phân lập được ly tâm lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong. Nhỏ phần dịch trong vào các giếng trên đĩa thạch đã có CaCO₃, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Khả năng sinh axit của các chủng vi khuẩn được tính đánh giá thông qua đường kính vòng trong phân giải CaCO₃.

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng trong phân giải CaCO₃ (mm).

d: đường kính lỗ thạch (mm).

% axit lactic = V_NaOHtiêu tốn x 0,009 (g/l)

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Phương pháp như sau: môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ trên đĩa Petri (đã chứa vi khuẩn kiểm định), sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ phần dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm) vào các lỗ đã đục, để ở 4⁰C trong 6 giờ, sau đó mang các đĩa thạch để 37⁰C. Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo thành. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn ∆D.

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng vô khuẩn (mm).

d: đường kính lỗ thạch (mm).

Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Phương pháp như sau: Bản thạch thử hoạt tính enzym (cơ chất tinh bột, xenluloza) được đổ trên đĩa Petri, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ dịch enzym vào các lỗ đã đục, để ở 37⁰C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol để vòng phân giải cơ chất hiện rõ. Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường kính vòng ngoài, d là đường kính lỗ nhỏ dịch.

2.2.2. Phương pháp phân lập

2.2.2.1.Vi khuẩn lactic

Để phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, các nguồn khác nhau trong tự nhiên, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước vô trùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng độ 10^-3 và 10^-5 trên đĩa Petri chứa môi trường MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để tạo điều kiện kị khí. Nuôi ở 37⁰C trong 48 giờ. Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần khiết các khuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO₃ tạo vòng trong). Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng. Mỗi mẫu phân lập chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới kính hiển vi.

Mẫu trước khi pha loãng ở nồng độ tương tự như phân lập vi khuẩn lactic được xử lý ở nhiệt độ 80⁰C/30 phút, sau khi pha loãng, dịch mẫu được gạt trên đĩa Petri chứa môi trường thạch thường. Nuôi ở 37⁰C trong 48 giờ. Tách và thuần khiết các khuẩn lạc tạo thành.

Phương pháp làm tương tự như trên, nhưng thay bằng môi trường YM có bổ sung kháng sinh cloramphenicol. Nuôi cấy các đĩa Petri đã gạt mẫu ở 30⁰C. Sau 48 giờ chọn các khuẩn lạc tạo thành và soi dưới kính hiển vi quang học.

2.2.3. Phương pháp tuyển chọn

2.2.3.1. Vi khuẩn lactic

Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn lactic phân lập được, tiến hành tuyển chọn các chủng có khả năng sinh axit lactic cao (định tính) và khả năng sinh bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định.

Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành tuyển chọn các chủng có khả năng sinh enzym amylaza và xenlulaza cao và khả năng kháng vi khuẩn kiểm định.

Tuyển chọn các chủng nấm men phân lập được thông qua đánh giá khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định.

• 
  Phương pháp sinh lý, sinh hóa
  

1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường MRS (vi khuẩn lactic), LB (vi khuẩn Bacillus): L-arabinoza, D-riboza, D-Xyloza, D-fructoza, D-mannoza, D-mannitol, D-sorbitol, lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat.

Môi trường được chia vào các ống nhỏ. Cấy vi sinh vật, để 2 -3 ngày.

Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm được cấy trên các môi trường không chứa nguồn đường nào.

Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalaza âm tính nhưng đặc biệt có một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalaza dương tính gọi là “Catalaza giả” như P. pentosaceus do chúng không nhảy cảm với cyanide và azide và không chứa một nhóm giả của Haem (C₃₄H₃₂0₄N₂Fe).

• 
  Phương pháp sinh học phân tử
  

- Ly tâm 1.5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào.

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE ( TE buffer: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA (pH 7,5)).

- Thêm 0,4 mg lysozym. Trộn đều, ủ 37⁰C/1 giờ. Trộn đều 3 phút.

- Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37⁰C/30 phút.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.

- Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37^oC trong 30 phút.

- Thêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56⁰C.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.

- Thêm 1 thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.

- Thêm 1/ 10 V Natri axetat 3M và 1ml Etanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút. Ly tâm 15000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.

- Rửa tủa bằng Etanol 70%.

- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không.

- Hoà tan ADN trong 50-100l nước hoặc TE.

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di:

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

Thành phần	Thể tích (l)
10X buffer	10
MgCl2	8
dNTP 2.0 mM	10
Primer xuôi (10 pmol/l)	2
Primer ngược (10 pmol/l)	2
Taq polymerase	2
Template	1-2
H2O	cho đủ 100

950C - 3 phút 950C - 30giây 560C - 15 giây 30 chu kỳ 720C - 1 phút 720C - 5 phút 40C - 

Primer xuôi : 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.

Primer ngược: 1525R 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

Tinh sạch sản phẩm PCR.

- Sử dụng bộ kit QIA gen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

+ Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều.

+ Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút .

+ Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

+ Bổ sung 750 l PE buffer lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

+ Đổ bỏ dịch dưới cột

+ Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút

+ Chuyển cột sang ống eppendoft mới

+ Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút

+ Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

+ Lấy dịch phía dưới.

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch: OD₂₆₀/OD₂₈₀ > 1,7

- Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

Buffer 5X 9l

Bigdye Ready Reaction premix 18l

H₂O 9l

- Thành phần phản ứng PCR cho sequence:

Termix 8l

Primer (*) 1l

Template 1l ( nồng độ ADN là 40-60 g/ml)

H₂O 10l

(*) Các loại primer đã sử dụng:

27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.

1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.

780F: 5'- GAATTGATACCCTGGTAG-3.'

350R: 5'- CTGCTGCCTCCCGTAG-3'.

1100F: 5'- GCAACGAGCGCAACCC-3'.

920R: 5'- GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'.

- Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen:

96⁰C-1phút

96⁰C - 10giây

50⁰C - 5 giây 25 chu kỳ

60⁰C - 4 phút

- Chuyển 20l sản phẩm sang ống eppendoft sạch

- Thêm 5l EDTA 125mM và 60l Etanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 15.000v/p, 15phút

- Bỏ dịch, thêm 60l Etanol 70% để rửa, ly tâm 15000v/p, 10 phút

- Làm khô.

- Thêm 10l HiDi Formamide

- Để ở 96⁰C trong 2 phút

- Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho sequence.

- Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant

Đọc trình tự ADN.

Trình tự của rADN của các mẫu được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen, để xác định đến tên loài.

• 
  Phương pháp sinh lý, sinh hóa
  

1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường cơ sở (Bacto yeast nitrogen base 6,7g; Bacto yeast extract 50 mg; Bacto casamino acid 50 mg): L-arabinoza, D-riboza, D-Xyloza, D-fructoza, D-mannoza, D-mannitol, D-sorbitol, lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat.

Môi trường được chia vào các ống nhỏ. Cấy vi sinh vật, sau 2 -3 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng được tuyển chọn.

Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm được cấy trên các môi trường không chứa nguồn đường nào.

Phân vào mỗi ống nghiệm 2 ml môi trường có thành phần như sau:

Cao nấm men 0,5%

Glucoza 2%

Cho vào mỗi ống 1 ống Durham để ngược, sau đó đem khử trùng ở 121^oC trong 15 phút.

Cấy vào mỗi ống một vòng que cấy 1-2 ngày tuổi, quan sát sau 1 tuần nuôi cấy.

• 
  Phương pháp sinh học phân tử
  

- Cho 100 l đệm lysis vào ống nhựa 1,5 ml. Lấy một vòng que cấy mẫu, trộn thật đều bằng máy vortex hoặc nghiền bằng dụng cụ chuyên.

- Đun hỗn hợp 100^oC trong 15 phút. Thêm 100 l kaliaxetat, sau đó trộn đều và đặt trên đá 1 giờ.

- Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4^oC, sau đó lấy phần nổi phía trên.

- Thêm 200 l CHCl₃-Isoamyl alcohol và trộn đều, ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút, sau đó lấy phần nổi phía trên. Làm lại như vậy thêm một lần nữa.

- Thêm 200l 2-propanol (Iso-propanol) và đặt trong đá 20phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 15 phút và lấy phần kết tủa.

- Rửa sạch phần tủa (pellet) bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút và lấy tủa.

- Làm khô bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút.

- Hoà tan tủa trong TE (30-50 l), giữ trong tủ lạnh 4^oC trong 1 ngày.

- Giữ ở -20^oC trước khi sử dụng.

- Hỗn hợp phản ứng:

10X Buffer 10l

dNTP mixture 16l

Mồi xuôi 2l

Mồi ngược 2l

Taq^Tm 1.2 l

Mẫu ADN ( 50 ng) 1 l

Nước cất đến 100l

+ Mồi cho phản ứng PCR các vùng ITS (Internal transcribed spacer)

Mồi xuôi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’

Mồi ngược ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước tiến hành	Nhiệt độ (0C)	Thời gian
1	94	3 phút
2	lặp lại 30 lần chu kỳ sau
	94	1 phút
	52	1 phút 30 giây
	72	2 phút 30 giây
3	72	7 phút
4	4	-

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

- Sử dụng bộ kit QIA (Invitrogen, Đức) thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

+ Thêm dung dịch PB vào mẫu theo thể tích 3:1. Trộn đều, đưa vào cột, ly tâm 13.000 v/p trong 30 giây.

+ Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

+ Bổ sung 500 l PE lên cột. Ly tâm 13.000 v/p trong 30 giây

+ Đổ bỏ dịch dưới cột

+ Ly tâm tiếp 13.000 v/p trong 2 phút

+ Chuyển cột sang ống eppendoft mới

+ Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút

+ Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút

+ Lấy dịch phía dưới.

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch: OD₂₆₀/OD₂₈₀ > 1,7

Phản ứng khuếch đại ADN cho sequencing.

Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem) với hỗn hợp phản ứng như sau :

Terminator Ready Reaction Mix	8 l
Mẫu ADN sau PCR	200 ng/ml
Mồi	1 l
Nước cất	đủ đến 20l

Mồi ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’

- Chu trình nhiệt khuếch đại ADN cho sequencing:

Bước tiến hành	Nhiệt độ (0C)	Thời gian
1	96	1 phút
2	lặp lại 25 lần chu kỳ sau
	96	10 giây
	50	5 giây
	60	4 phút
3	4	-

- Tinh sạch sản phẩm cho sequencing:

Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml. Thêm 5l EDTA 1,25 M, thêm 60l ethanol 100%. Trộn thật nhẹ nhàng. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 100l ethanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút. Làm khô mẫu băng máy cô quay chân không trong 3-5 phút.

Đọc trình tự ADN.

Trình tự của ITS rARN của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen.

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có pH = 7,0, trong máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 40; 45^oC.

Các chủng vi sinh vật probiotic được nuôi riêng rẽ trên môi trường dịch thể phù hợp cho từng vi sinh vật chứa nồng độ muối mật thay đổi (0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4 và 5%) từ đó tìm giới hạn nồng độ muối mật không ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng probiotic lựa chọn.

Sau 48 giờ, tốc độ sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được đánh giá: với vi khuẩn (thông qua mật độ quang OD₆₆₀); với nấm men (thông qua CFU/ml).

2.2.5. Phát triển chế phẩm

Đánh giá tính đối kháng của các chủng thông qua phương pháp cấy vạch.

• 
  Chuẩn bị vi khuẩn và nấm men probiotic:
  

- Tế bào được huyền phù lại trong môi trường dịch thể (MRS cho vi khuẩn lactic, LB cho Bacillus, YM cho nấm men) trước khi tiến hành cho bám dính đạt mật độ 4 x 10⁸ CFU/ml

- Chuẩn bị các mẫu ruột tươi (ruột gà) có cùng kích thước sau đó rửa 3 lần với đệm PBS sao cho tất cả các vi khuẩn không còn trên bề mặt niêm mạc ruột nữa. Rửa lại 1 lần với môi trường dịch thể MRS (LB hoặc YM).

• 
  Tiến hành bám dính:
  

- Rửa tế bào:

+ Rửa mẫu ruột sau khi ủ lần 1 với 2 thể tích muối sinh lý 1%.

+ Rửa 3 lần với 2 thể tích đệm PBS, thu lấy dịch rửa 3 lần, đếm tế số lượng tế bào bám dính trên mẫu.

Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường dịch thể tương ứng (MRS cho vi khuẩn lactic; thạch thường cho vi khuẩn Bacillus và YM cho nấm men) nhưng có bổ sung các thành phần có hoạt tính thường có trong các khẩu phần ăn cho lợn và gia cầm gồm các loại kháng sinh thương mại BMD (50 ppm); Saigon Nox (100 ppm), Colistine 98% (100 ppm), CTC 15% (100 ppm); một số loại khoáng CuSO₄ (250 ppm Cu); ZnSO₄ (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm axit lactic axit, axit formic, axit citric...) với liều 200mg/lít. Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) trong tủ ấm (37^oC). Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48h.

Các chủng vi sinh vật probiotic được sử dụng để phát triển chế phẩm dạng bột theo nghiên cứu trước đây (Trần Quốc Việt và cs, 2007).

- Hai chế phẩm probiotic dạng bột đa chủng gồm PBB1 và PBB2 được sử dụng cho thí nghiệm này. Mật độ các chủng vi sinh vật hữu ích đạt 10⁷ – 10⁸ cfu/g.

- Chín mươi sáu (96) lợn con lai thương phẩm cai sữa 21 ngày tuổi có khối lượng bình quân từ 7-8 kg đã được sử dụng. Lợn được nuôi trong thời gian 50 ngày, trong chuồng nền xi măng, thông thoáng tự nhiên.

- Khẩu phần cơ sở cho lợn thí nghiệm được phối chế từ các nguyên liệu: ngô ép đùn, tấm gạo tẻ, khô dầu đậu tương tách vỏ, bột thay thế sữa (milk replacer), bột sữa whey, premix vitamin-khoáng và các axit amin tổng hợp.

• 
  Phương pháp bố trí thí nghiệm.
  

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích.

Vi sinh vật probiotic chủ yếu là vi khuẩn lactic, Bacillus và nấm men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycess boulardii. Trên thực tế các đối tượng trên có mặt trong hầu hết các mẫu trong tự nhiên, để thu được chúng có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như thực phẩm lên men (rau, củ, nem chua, bún), đất nước, thực phẩm các loại, bánh men... Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật tồn tại trong đường tiêu hoá của vật nuôi (gà, lợn) và một số nguồn khác nhau (đất, các sản phẩm lên men). Việc lấy mẫu phân lập sẽ có nhiều khả năng thu nhận và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có đặc tính probiotic như chịu axit, muối mật, sinh enzym thuỷ phân và bacteriocin kháng khuẩn gây bệnh.

Từ các nguồn khác nhau, 254 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó có 164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn Bacillus và 45 chủng nấm men (bảng 4).

Bảng 4: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau

Nguồn phân lập	Nhóm vi sinh vật đã phân lập
	Vi khuẩn lactic	Bacillus	Nấm men
Chất chứa trong ruột non và ruột già của lợn ngoại	48	20	18
Chất chứa trong ruột non và ruột già của lợn Móng cái	43	16	13
Chất chứa trong ruột non, ruột già của gà Lương Phượng	38	2	5
Chất chứa trong ruột non, ruột già của gà Ri	20	2	2
Các nguồn khác nhau trong tự nhiên	15	5	7
Tổng	164	45	45
Tổng số	254

Trong đó từ chất chứa trong ruột non, ruột già của lợn và gia cầm đã phân lập được 149 chủng vi khuẩn lactic, 40 chủng Bacillus và 38 chủng nấm men. Từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các sản phẩm lên men...), đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn lactic, 5 chủng Bacillus và 7 chủng nấm men.

Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được giữ trong ống nghiệm môi trường (MRS, thạch thường và YM) thạch nghiêng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời các chủng này còn được bảo quản lạnh sâu ở - 80⁰ C nhằm giữ được giống trong thời gian dài.

3.2. Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic

3.2.1. Vi khuẩn lactic.

164 chủng vi khuẩn lactic phân lập được được nuôi cấy lắc trên 20 ml môi trường MRS dịch thể trong 48 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong. Để xác định khả năng sinh axit chúng tôi tiến hành đục thạch và nhỏ dịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có CaCO₃, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Kết quả tuyển chọn khả năng sinh axit được trình bày ở bảng 5.

Kết quả thu được cho thấy khả năng sinh axit của vi khuẩn lactic khá đa dạng, số chủng sinh axit trung bình là 89 chủng chiếm nhiều nhất (54,3%), trong khi đó khả năng sinh axit mạnh có 30 chủng chiếm 18,3%, còn lại là 45 chủng (27,4%). Các chủng sinh axit với hàm lượng cao nhất được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo.

Một trong những đặc tính quan trọng nhất làm căn cứ tuyển chọn các chủng vi khuẩn probiotic là khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định. Trong số 30 chủng sản sinh axit lactic cao nhất, 12 chủng được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 6.

Kết quả ở bảng 6 cho thấy, cả 12 chủng đều có hoạt tính kháng vi khuẩn Salmonella và Shigella. 09 chủng có khả năng ức chế cả 3 loại vi khuẩn kiểm định (Salmonella, E. coli và Shigella). Tuy nhiên, mức độ kháng các vi khuẩn kiểm định của các chủng rất khác nhau. Vòng kháng khuẩn (cả 3 loại vi khuẩn kiểm định) có đường kính lớn thuộc về các chủng 6H2; C3 (D-d ≥10mm đối với cả 3 chủng kiểm định); vòng kháng khuẩn trung bình thấy ở chủng Đ2; Đ7; 1K8; NC1; NC2 và 2M33 (D-d ‹ 10mm). Có 3 chủng 3K2; 5M2 và 5H4 có hoạt tính kháng E. coli không rõ rệt (D-d = 0 mm) (Hình minh họa hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng lactic có trong hình 4, 5 thuộc phụ lục 1).

Hình 2: Sơ đồ minh họa hoạt tính kháng khuẩn của các chủng lactic.

3.2.2. Vi khuẩn Bacillus

3.2.2.1. Đánh giá khả năng sản sinh enzym

Tổng số 45 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được, đã được nuôi lắc trên 20ml môi trường LB dịch thể trong 48 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 10000 vòng/phút lấy dịch enzym. Để xác định khả năng phân giải cơ chất chúng tôi tiến hành đục thạch và nhỏ dịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có cơ chất khác nhau (tinh bột, xenluloza), để ở nhiệt độ 37⁰ C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol và đo vòng phân giải. Kết quả được thể hiện ở bảng 7.

Các chủng có hoạt tính enzym mạnh và trung bình (D-d ≥8mm) với cả 2 cơ chất (11 chủng) được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo. Khả năng sinh enzym của 11 chủng Bacillus được lựa chọn được trình bày trong bảng 8.

Kết quả ở bảng 8 trên cho ta thấy cả 11 chủng vi khuẩn Bacillus được lựa chọn thì hoạt tính enzym amylaza và xenlulaza mạnh nhất thuộc về chủng H3, tiếp đến là các chủng M51, H4 và M73 (đường kính vòng phân giải từ 24-34 mm). (Hình minh họa hoạt tính enzym của một số chủng Bacillus có trong hình 6, 7, 8 thuộc phụ lục 1).

11 chủng có hoạt tính enzym mạnh nhất được lựa chọn để đánh giá tiếp hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định. Các kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của 11 chủng vi khuẩn Bacillus được trình bày ở các bảng 9.

3.2.3. Nấm men

Trong số 45 chủng nấm men đã được phân lập, các chủng được xác định khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định. 01 chủng được xác định là có khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định là chủng SB. Kết quả tóm tắt được trình bày ở bảng 10, 11.

Hoạt tính kháng khuẩn	Số lượng chủng	Tỷ lệ (%)
Có	01	2,2
Không	44	97,8
Tổng	45	100

Các số liệu ở bảng 11 cho thấy, chủng SB chỉ có khả năng kháng Shigella, còn không kháng E.coli và Salmonella. Tuy không có một số đặc tính probiotic như các vi khuẩn lactic và Bacillus, nhưng các chủng nấm men hữu ích tác động có lợi đối với vật nuôi qua một số cơ chế sau: (i) kích hoạt một số enzym thuộc nhóm disacharridaza (surcraza, lactaza, maltaza) làm tăng khả năng tiêu hoá đường đa (Buts và ctv, 1986); (ii) trung hòa một số loại độc tố của vi khuẩn (Castagliuolo và ctv, 1998); (iii) kết dính một số vi khuẩn gây bệnh có roi bám vào biểu mô ruột nhờ các thụ quan mannose và loại chúng ra ngoài theo phân (Czerucka và ctv, 2002); (iv) kích thích hệ miễn dịch, tăng sản xuất IgA (Qamar et al, 2001).

Từ phần tuyển chọn các chủng vi sinh vật 09 chủng lactic (1K8, 2M33, 6H2, C3, Đ2, Đ12, Đ7, NC1 và NC2), 02 chủng vi khuẩn Bacillus (H3 và H4) và 01 chủng nấm men (SB) được dùng trong nghiên cứu tiếp theo.

3.3. Phân loại các chủng được tuyển chọn

3.3.1. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic

Việc phân loại các chủng vi khuẩn được tiến hành căn cứ vào các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích, giải trình tự gen 16S rARN.

3.3.2. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus

Tương tự như đối với vi khuẩn, việc phân loại các chủng nấm men được tiến hành căn cứ vào các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và xác định trình tự gen. Các số liệu được trình bày ở các bảng 16 và 17.

Kích thước đoạn gen đã được đọc (bp)	Gần gũi với loài (BLAST Search)	Tỷ lệ tương đồng (%)
570	Saccharomyces boulardii	100

3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn

3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic

3.4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nuôi lắc 220 vòng/phút 09 chủng vi khuẩn lactic trong bình tam giác chứa 20ml môi trường MRS dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-45⁰C. Sau 48 giờ nuôi cấy thu dịch lên men đo OD và định lượng axit lactic tạo ra. Kết quả được trình bày ở bảng 19.

Kết quả ở bảng 19 cho thấy, khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic thể hiện bằng mật độ quang OD₆₆₀ tăng khi nhiệt độ tăng từ 30^oC lên đến 37^oC. Khi nhiệt độ tăng lên trên 37^oC (40 và 45^oC) mật độ quang giảm rõ rệt. Qui luật này quan sát thấy ở cả 09 chủng vi khuẩn. Các số liệu ở bảng 19 cũng cho thấy, nhiệt độ từ 30^oC đến 37^oC là thích hợp nhất đối với các chủng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, trong vùng nhiệt độ tối thích này, mật độ quang của các chủng cũng rất khác nhau. Khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ 37^oC thể hiện qua chỉ số OD₆₆₀ xếp theo thứ tự cao (OD₆₆₀≥2) gồm 4 chủng (1K8, Đ2, C3, Đ7), trung bình (1,5660<2) gồm 4 chủng (Đ12, 2M33, NC1 và NC2) và thấp (OD₆₆₀ ≤1,5) gồm 1 chủng (6H2).

Khả năng sản sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn cũng có xu hướng tương tự như khả năng sinh trưởng. Nhìn chung, những chủng có khả năng sinh trưởng tốt cũng là những chủng có khả sản sinh axit lactic cao. Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và ctv (2003) cho thấy, khi phân lập từ phân gà tươi 789 chủng vi khuẩn lactic, có hai chủng được lựa chọn (CH₁₂₃ và CH₁₅₆) là có các đặc tính probiotic và cả hai chủng đều có khả năng sinh trưởng ở khung nhiệt độ từ 15 đến 45^oC.

3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH môi trường dịch nuôi cấy

Nuôi lắc 220 vòng/phút các chủng lactic trong môi trường MRS có pH khác nhau từ 2,0 đến 7,0 ở nhiệt độ 37⁰C trong 48 giờ. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 20.

Kết quả ở bảng 20 cho thấy với dải pH rộng: 2; 3; 4; 5; 6 và 7, đáp ứng về sinh trưởng và khả năng sản sinh axit lactic của 09 chủng vi khuẩn lactic là khác nhau. Các số liệu ở bảng 20 cũng cho thấy mật độ quang (OD₆₆₀) ở môi trường có độ pH 4 của 07 chủng là cao nhất (dao động từ 0,58 đến 0,8), riêng chủng NC1 thì tại pH 3 mật độ quang và hàm lượng axit lactic sinh ra là cao hơn cả. Ở môi trường có độ pH cao hơn (từ 5 trở lên) mật độ quang giảm. Khả năng sản sinh axit lactic cũng có xu hướng tương tự. Điều đó chứng tỏ các vi khuẩn lactic chỉ sinh trưởng tốt trong môi trường có độ pH thấp (3-4) và ở môi trường pH cao hơn (pH từ 5-7) tốc độ sinh trưởng của chúng chậm, nhưng chúng vẫn tồn tại. Những kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và ctv (2003) trên hai chủng CH123 và CH156 thuộc các vi khuẩn lactic, hai chủng này cũng chỉ sinh trưởng tốt ở môi trường có độ pH thấp (pH = 4).

Khả năng chịu được muối mật ở các nồng độ khác nhau là một trong những tiêu chí quan trọng để đánh giá các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn đã được lựa chọn. Nồng độ muối mật trong dưỡng chấp của đường tiêu hoá của động vật có vú dao động từ 1 đến 3% (Sameh. H. M, 2003). Các chủng vi khuẩn hữu ích muốn khu trú và phát huy tác dụng được trong đường tiêu hoá của các loài vật nuôi phải sống và sinh trưởng bình thường trong môi trường có hàm lượng muối mật tương tự. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường có hàm lượng muối mật khác nhau đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic được trình bày ở bảng 21.

Kết quả bảng 21 cho thấy, nhìn chung tất cả các chủng đều chịu được nồng độ muối mật 1-3%, đó là nồng độ muối mật bình thường trong dưỡng chấp của ruột non. Tuy nhiên, khả năng chịu muối mật giữa các chủng là không giống nhau. Trong số 09 chủng, có 5 chủng có khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối mật 5%; 4 chủng chịu được nồng độ muối mật 4%. Các chủng có khả năng sinh trưởng trong môi trường muối mật cao (từ 4-5%) là 1K8; 6H2; Đ12; Đ7; NC1; NC2 và C3.

3.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus

3.4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nuôi lắc 02 chủng vi khuẩn Bacillus trong bình tam giác chứa 20ml môi trường LB dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-55⁰C. Sau 24 giờ nuôi cấy thu dịch lên men đo OD và định lượng hàm lượng enzym tạo ra. Kết quả được trình bày ở bảng 22.

Kết quả ở bảng 22 cho thấy, khả năng sinh trưởng của 2 vi khuẩn Bacillus tăng khi nhiệt độ tăng từ 30^oC lên đến 37^oC. Khi nhiệt độ tăng lên trên 37^oC (40 và 45^oC) mật độ quang giảm, tuy nhiên sự giảm này không nhiều như vi khuẩn lactic. Điều này có thể hiểu được vì các chủng Bacillus chịu các điều kiện bất lợi tốt hơn vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho enzym amylaza, xenlulaza hoạt động của chủng H4 là 40⁰C, chủng H3 là 37⁰C. Ở nhiệt độ nuôi cấy cao hơn (45⁰C), hoạt tính của các enzym giảm dần. Do đó, nhiệt độ 37^oC là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và sản sinh enzym của 02 chủng vi khuẩn Bacillus.

Nuôi lắc 220 vòng/phút các chủng Bacillus trong môi trường LB có pH khác nhau từ 2,0 đến 7,0 ở nhiệt độ 37⁰C trong 24 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 2 chủng Bacillus sinh trưởng ở môi trường có pH từ 5-7 tốt hơn khi so với môi trường có pH <5. Tuy nhiên hoạt tính enzym mạnh nhất là khi nuôi cấy tại môi trường có pH 7.

Tương tự như với vi khuẩn lactic, kết quả về sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau được trình bày ở bảng 23.

Kết quả bảng 23 cho thấy, cả 2 chủng đều chịu được nồng độ muối mật 0,2-5% nhưng khả năng chịu muối mật giữa các chủng là không giống nhau. Trong đó chủng H4 sinh trưởng tốt nhất là ở môi trường có nồng độ muối mật 2% còn chủng H3 là 3%. Nói chung, nồng độ muối mật thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng Bacillus là 1-4%.

3.4.3. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của nấm men

3.4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nuôi cấy lắc 120 vòng/phút chủng nấm men SB trong bình tam giác chứa 20ml môi trường YM dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-45⁰C. Sau 24 giờ nuôi cấy, dịch nuôi cấy được đếm số lượng tế bào (CFU/ml). Kết quả được trình bày trong bảng 24.

Nhiệt độ nuôi cấy (oC)	Số lượng tế bào (CFU/ml)
30 oC	2 x 109
37 oC	6 x 107
40 oC	4 x 106
450C	3,8 x 103

Một đặc tính rất quan trọng khác của các vi sinh vật probiotic là khả năng sống trong các môi trường có độ pH khác nhau. Các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng nấm men SB được trình bày ở bảng 25.

Khi thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng chịu muối mật của chủng SB chúng tôi nhận thấy chủng này đều phát triển bình thường (không có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu thí nghiệm có nồng độ muối mật khác nhau (1-5%) và mẫu đối chứng khi không có mặt muối mật).

Trên cơ sở phân loại, đánh giá các đặc tính probiotic, 6 chủng vi sinh vật được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. Các chủng vi sinh vật bao gồm: 4 chủng vi khuẩn lactic (6H2, C3, Đ7, NC1); 1 chủng vi khuẩn Bacillus (H4) và 1 chủng nấm men (SB).

3.5. Phát triển chế phẩm

3.5.1. Kết quả về tính đối kháng của các chủng được lựa chọn

Bằng phương pháp cấy vạch để thử tính đối kháng, kết quả thu được cho thấy 6 chủng nghiên cứu không có tính đối kháng lẫn nhau.

3.5.2. Các kết quả nghiên cứu về tính tương thích của các chủng được lựa chọn với một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong thức ăn

Trong số các yếu tố ảnh hưởng đến sức sống và hoạt tính của các vi sinh vật probiotic thì sự tương tác của chúng đối với các thành phần khẩu phần (chủ yếu là các thành phần có hoạt tính như một số loại muối vô cơ, các chất axit hóa và một số loại kháng sinh) có một ý nghĩa rất quan trọng. Kết quả nghiên cứu về tương thích của các vi sinh vật lựa chọn đối với một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong khẩu phần (gồm các loại kháng sinh thương mại BMD (50 ppm); Saigon Nox (100 ppm), Colistine 98% (100 ppm), CTC 15% (100 ppm); một số loại khoáng CuSO₄ (250 ppm Cu); ZnSO₄ (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm axit lactic axit, axit formic, axit citric...) với liều 200mg/lít) được trình bày ở bảng 26.

Kết quả ở bảng 26 cho thấy, chủng nấm men (SB) và vi khuẩn Bacillus (H4) vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường hiện diện một số loại kháng sinh, các muối sulfat của đồng và kẽm cũng như hỗn hợp một số loại axit hữu cơ với liều tương tự như liều khuyến cáo bổ sung trong khẩu phần. Trong số các vi khuẩn lactic, chủng 6H2 và NC1 sống tốt trong môi trường có BMD, Colistine, CuSO₄.5H₂O và ZnSO₄.5H₂O và hỗn hợp axit hữu cơ, ngoại trừ Saigon Nox và CTC. Hai chủng vi khuẩn lactic còn lại (C3 và Đ7) phát triển yếu trên môi trường có BMD, Saigon Nox và CTC. Qua kết quả đó cho thấy, các chủng vi khuẩn nghiên cứu có tính tương thích cao với các axit hữu cơ, các muối sulfat của đồng và kẽm và một số loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong thức ăn chăn nuôi. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc hướng dẫn sử dụng các sản phẩm probiotic có chứa các chủng trên trong chăn nuôi lợn và gà. Với những sản phẩm probiotic mà các chủng vi sinh vật có tính tương thích càng cao với các thành phần có hoạt tính trong khẩu phần thức ăn thì tính ứng dụng càng lớn. Bởi trong công nghệ chế biến thức ăn chăn nuôi, probiotic chỉ là một chất bổ sung cùng với các thành phần khác vào thức ăn (như một số loại kháng sinh, các muối sulfat của đồng và kẽm cũng như hỗn hợp một số loại axit hữu cơ với tỷ lệ tượng tự như thí nghiệm và kết quả ở bảng 26).

3.5.3. Kết quả đánh giá khả năng bám dính của các chủng probiotic

Khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hoá của 06 chủng sinh vật được trình bày ở bảng 27.

3.5.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung các chế phẩm probiotic vào khẩu phần đến tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con.

Chúng tôi sử dụng 6 chủng cho phát triển sản phẩm thử nghiệm theo 2 tổ hợp khác nhau: tổ hợp PBB1 có hai chủng Bacillus (H4) và nấm men Sacharomyces boulardii (SB) và tổ hợp PBB2 gồm 6 chủng nghiên cứu (4 chủng lactic: 6H2, C3, NC1, Đ7; 01 chủng Bacillus (H4) và chủng nấm men Sacharomyces boulardii (SB)). Theo đánh giá của chúng tôi đây là các chủng tiềm năng nhất.

Kết quả sử dụng chế phẩm PBB1 và PBB2 trên lợn con (trọng lượng 7,7 - 8,1kg) sau 50 ngày thí nghiệm được trình bày trong bảng 28.

Sau 50 ngày thí nghiệm, lợn con ở các lô được ăn khẩu phần có bổ sung colistin và chế phẩm PBB2 có khối lượng cơ thể cao hơn các lô khác (29,8 và 29,9 kg tương ứng). Tốc độ sinh trưởng thể hiện ở chỉ tiêu tăng trọng ngày cao nhất quan sát thấy ở lợn lô 4, cao hơn so với lô đối chứng âm 16,7% (P < 0,05), nhưng cao hơn không đáng kể so với đối chứng dương 1,76% (P >0,05). Ngoại trừ lô 1, 2 và 4, tốc độ sinh trưởng của lợn ở các lô 3 dao động từ 421 đến 434 g/con/ngày và sự chênh lệch này không có ý nghĩa thống kê (bảng 28).

Tỷ lệ chuyển hóa thức ăn tốt nhất quan sát thấy ở lợn lô 2 với mức tiêu tốn là 1,39 kg thức ăn/kg tăng trọng (thấp hơn so với lô 1 9,15%), sau đến là lô 4 (1,42 kg) (thấp hơn so với lô 1 là 7,19%). Sự khác biệt về tiêu tốn thức ăn ở lô 2 và lô 4 so với các lô khác là có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tiêu tốn thức ăn/kg tăng trọng của lợn ở lô 3 là 1,56 kg và sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê.

Thông qua những kết quả về sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn thí nghiệm như đã trình bày ở trên, có thể thấy bổ sung kháng sinh liều thấp (colistin với liều 100g/tấn) và chế phẩm probiotic đa chủng dạng bột đã cải thiện được tốc độ sinh trưởng của lợn con so với đối chứng âm (tăng 16,7%) và hiệu quả chuyển hóa thức ăn (mức tiêu tốn thấp hơn 7,19%).

Mức độ cải thiện năng suất sinh trưởng ở vật nuôi của các sản phẩm probiotic rất khác nhau phụ thuộc vào đặc tính sinh học, mật độ, sức sống, hoạt tính của các chủng vi sinh vật probiotic được sử dụng (Sanders, 2001). Trong trường hợp của nghiên cứu này, một chế phẩm probiotic đa chủng gồm cả vi khuẩn lactic, Bacillus và nấm men ở dạng bột tỏ ra có tác dụng rõ rệt và tương tự các kết quả nghiên cứu trên lợn con sau cai sữa của một số các tác giả khác như Lessard và Brisson (1987) với sản phẩm probiotic gồm 3 chủng vi khuẩn lactic (L. bulgaricus, L. casei và S. thermophilus); Fialho và ctv (1998) với sản phẩm probiotic gồm 2 chủng vi khuẩn lactic và 1 chủng Bacillus (L. acidophilus; Streptococcus faecium và Bacillus toyoi).

Các số liệu ở bảng 28 cũng cho thấy, cùng là chế phẩm dạng bột nhưng chế phẩm PBB1 kém hiệu quả hơn so với PBB2, nguyên nhân rất có thể do trong sản phẩm PBB2 không có các vi khuẩn lactic.

1. Trong 254 chủng được phân lập (164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn Bacillus và 45 chủng nấm men) đã đánh giá, tuyển chọn và phân loại được 12 chủng gồm 9 chủng lactic, 2 chủng Bacillus và 1 chủng nấm men. Kết quả cho thấy chúng thuộc về các loài Enterococcus faecium (6H2); Lactobacillus acidophilus (C3); Lactobacillus plantarum (1K8, Đ2, Đ12, 2M33); Pediococcus pentosaceus (Đ7); Lactobacillus casei (NC2); Lactobacillus fermentum (NC1); Bacillus licheniformic (H3); Bacillus subtilis (H4); Saccharomyces boulardii (SB).

2. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi sinh vật được lựa chọn: vi khuẩn lactic (nhiệt độ nuôi cấy 37⁰C, pH 3-4, nồng độ muối mật 1-3%); vi khuẩn Bacillus (nhiệt độ nuôi cấy 37⁰C, pH 5-7, nồng độ muối mật 1-4%); nấm men (nhiệt độ nuôi cấy 30⁰C, pH 5-6 và nồng độ muối mật 1-5%).

3. Sáu chủng vi sinh vật (4 chủng vi khuẩn lactic (C3, NC1, Đ7 và 6H2), 1 chủng Bacillus (H4) và 1 chủng nấm men (SB)) được dùng để phát triển sản phẩm. Trong đó chủng vi khuẩn Bacillus (H4) và nấm men (S. boulardii) có tính tương thích cao với một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong khẩu phần thức ăn; 4 chủng vi khuẩn lactic có tính tương thích yếu hơn. Sáu chủng này đều có khả năng bám dính tốt vào biểu mô ruột.

Sử dụng chế phẩm probiotic đa chủng dạng bột (PBB2) đã cải thiện được tốc độ sinh trưởng (tăng 16,7% so với lô đối chứng âm), tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn (giảm tiêu tốn thức ăn/kg tăng trọng 7,2%), giảm tỷ lệ tiêu chảy và chi phí kháng sinh điều trị ở lợn con sau cai sữa 31%.

KIẾN NGHỊ

Thử nghiệm các chế phẩm probiotic từ các chủng đã được lựa chọn trên diện rộng và trên nhiều đối tượng vật nuôi khác nhau và từ đó cho sản xuất thử chế phẩm probiotic có hiệu quả nhất.