Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học thực nghiệm
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cố PGS.TS. Trần Công Yên. Mặc dù thầy không còn nữa nhưng những lời khuyên, những bài học mà thầy dạy dỗ sẽ mãi mãi còn trong tâm trí của em.
Em xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm để giúp em hoàn thành luận văn này. Trong quá trình làm việc, em luôn nhận được những lời nhận xét, góp ý quý báu từ cô để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình. Không những vậy, cô còn luôn dạy em những bài học làm người vô cùng hữu ích.
Em xin cảm ơn TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, mặc dù cô luôn luôn bận rộn nhưng vẫn quan tâm tới em, đưa ra những lời chỉ dẫn trong từng thí nghiệm để giúp em đạt được kết quả tốt nhất. Sự say mê công việc của cô luôn luôn là tấm gương sáng để em mãi noi theo.
Em xin chân thành cảm ơn CN. Bùi Thị Vân Khánh, ThS. Phí Thị Xuyến, toàn bộ các em học viên cao học cũng như sinh viên nhóm Ung thư thực nghiệm đã luôn luôn dành cho em sự quan tâm và giúp đỡ đặc biệt để em có thể hoàn thành công việc của mình.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS. Nguyễn Xuân Phúc, TS. Hà Thị Phương Thư, CN. Phạm Hồng Nam, và các anh chị trong nhóm Nghiên cứu Vật liệu Nano Y sinh, viện Khoa học Vật liệu, trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã cung cấp vật liệu nano từ và nhiệt tình tạo điều kiện giúp em thực hiện các thí nghiệm đốt nhiệt – từ.
Em xin gửi lời cảm ơn tới TS.BS Lâm Khánh, bệnh viện Quân đội Trung ương 108 đã không tiếc thời gian và công sức giúp em hoàn thành thí nghiệm chụp cộng hưởng từ hạt nhân.
Em xin cảm ơn các thầy cô, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm của bộ môn Thổ nhưỡng và Môi trường Đất, khoa Môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã quan tâm và tạo điều kiện để em có thể hoàn thành công việc của mình.
Em xin chân thành cảm ơn nhóm Nghiên cứu về Tế bào gốc, thuộc bộ môn Tế bào – Mô – Phôi và Lý sinh thuộc Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã cung cấp tế bào Fibroblast để em có thể hoàn thành luận văn.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô công tác tại bộ môn Tế bào, Mô phôi và Lý sinh cũng như các thầy cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho em những kiến thức cơ sở để em có thể thực hiện được luận văn thạc sỹ cũng như vận dụng trong công việc sau này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Để hoàn thành luận văn này, em đã nhận được sự hỗ trợ một phần kinh phí từ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ chế tạo các hạt vô cơ, hữu cơ được bọc bởi những polymer tương thích sinh học dung trong y học”, mã số 4/2/472/2009 – HDD – ĐTĐL và để tài cấp bộ (VAST) “Nghiên cứu công nghệ chế tạo một số vật liệu nano có từ tính nền Fe3O4 theo định hướng ứng dụng trong Y sinh” thực hiện năm 2009-2010. Nhân dịp này em xin được cảm ơn lãnh đạo các cấp quản lý và chủ nhiệm các đề tài nêu trên.
Hà Nội, tháng 12 năm 2010
Phạm Thị Hà Giang
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1.Những khái niệm cơ bản về hạt nano từ và ứng dụng 4
1.1.1. Vật liệu nano 4
1.1.2. Hạt nano từ 5
1.1.3. Ứng dụng của hạt nano từ trong lĩnh vực sinh y học 6
1.1.3.1. Tách, phân lập các tế bào và thực thể sinh học ra khỏi một môi trường hỗn hợp 7
1.1.3.2. Dẫn truyền thuốc, gen và các nuclide phóng xạ tới mô đích 9
1.1.3.3. Tăng độ tương phản ảnh trong phương pháp chẩn đoán bằng chụp cộng hưởng từ. 13
1.1.3.4. Liệu pháp nhiệt – từ trong điều trị ung thư 14
1.2.Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 21
1.2.1. Lịch sử phát triển của kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân 21
1.2.2. Nguyên lý và kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 22
1.2.3. Ưu điểm của chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 26
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu 28
2.1.1. Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss 28
2.1.2. Một số dòng tế bào ung thư và tế bào lành 28
2.1.2.1. Các dòng tế bào ung thư 28
2.1.2.2. Tế bào lành Fibroblast 29
2.1.3. Vật liệu nano từ (hay chất lỏng từ) 29
2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 30
2.2.1. Môi trường nuôi cấy 30
2.2.2. Hóa chất 30
2.2.3. Máy móc thiết bị 31
2.2.4. Vật tư tiêu hao 31
2.3. Phương pháp nghiên cứu 32
2.3.1. Phương pháp tạo u rắn dưới da và cơ đùi cho chuột nhắt trắng Swiss bằng cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180 32
2.3.1.1. Tạo u rắn dưới da 32
2.3.1.2. Tạo u đùi 32
2.3.2. Phương pháp khảo sát độc tính của dung dịch nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi 33
2.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 34
2.3.4. Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch 35
2.3.5. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt – từ ex vivo 35
2.3.5.1. Khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt - từ mẫu E6 35
2.3.5.2. Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo 36
2.3.6. Phương pháp khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u của chuột Swiss 37
2.3.6.1. Bằng phương pháp đốt nhiệt từ 37
2.3.6.2. Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 38
2.3.7. Liệu pháp gia nhiệt in vivo 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
3.1. Kết quả gây tạo u rắn dưới da và u đùi trên chuột Swiss 42
3.1.1. Kết quả gây tạo u rắn dưới da 42
3.1.2. Kết quả gây u đùi ở chuột Swiss 43
3.2. Kết quả khảo sát độc tính của chất lỏng nano từ H01 và E6 trên các dòng tế bào ung thư và nguyên bào sợi 44
3.2.1. Kết quả xác định độc tính của H01 44
3.2.2. Kết quả xác định độc tính của E6 47
3.3. Kết quả khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của H01 bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 49
3.4. Kết quả khảo sát liệu pháp đốt nhiệt từ sử dụng mẫu E6 51
3.4.1. Kết quả hiệu ứng đốt nhiệt từ mẫu E6 51
3.4.2. Kết quả gia nhiệt ex vivo bằng hạt từ E6 54
3.4.3. Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u 57
3.4.3.1. Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan bằng phương pháp đốt nhiệt từ 57
3.4.3.2. Kết quả khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 59
3.4.4. Kết quả khảo sát liệu pháp đốt – nhiệt từ in vivo 60
KẾT LUẬN 68
KIẾN NGHỊ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 71
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Một số dòng tế bào ung thư sử dụng trong luận văn và đặc điểm của chúng 29
Bảng 2. Nồng độ hạt từ E6 trong thí nghiệm khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt từ in vitro 36
Bảng 3. Bố trí thí nghiệm gia nhiệt ex vivo khối u rắn dưới da trên chuột Swiss 36
Bảng 4. Bố trí thí nghiệm gia nhiệt in vivo trên 6 chuột thí nghiệm 40
Bảng 5. Tỷ lệ sống (%) của các dòng tế bào ung thư và tế bào lành sau khi ủ với hạt từ H01 tại các nồng độ khác nhau trong 2 giờ 46
Bảng 6. Tỷ lệ sống (%) của dòng tế bào ung thư gan HepG2 và tế bào lành sau khi ủ với hạt từ E6 tại các nồng độ (ng/1 tế bào) khác nhau trong 2 giờ 48
Bảng 7. Giá trị nhiệt độ bão hoà (Tbh) và tốc độ tăng nhiệt độ ban đầu (dT/dt) 52
Bảng 8. Nhiệt độ ban đầu và nhiệt độ bão hòa của từng khối u trong quá trình gia nhiệt 55
Bảng 9. Nhiệt độ bão hòa trong 5 nội quan của chuột A và B sau khi gia nhiệt 30 phút (oC), nhiệt độ ban đầu là 30oC 58
Bảng 10. Hàm lượng sắt có trong 1g mẫu của 5 cơ quan tách ra từ chuột A và chuột B (ngFe/1g mẫu) 60
Hình 1. Minh hoạ nguyên lý sử dụng hạt nano từ và từ trường ngoài để tách các thực thể sinh vật [29] 8
Hình 2. Minh hoạ về nguyên lý vận chuyển và tập trung thuốc [4]. 9
Hình 3. Cấu trúc của một hệ nano – thuốc 10
Hình 4. Minh hoạ về quá trình đốt nhiệt sử dụng hạt nano từ 14
Hình 5. Quá trình phát triển khổi u trên cơ thể chuột trong thí nghiệm của Yanase và các cộng sự [35] 18
Hình 6. Thiết bị MFH-300F (công ty MagForce) dùng trong nhiệt – từ trị [21] 21
Hình 7. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ chẩn đoán ung thư 22
Hình 8. Sự tạo thành vector từ hoá thực 24
Hình 9. Vector từ hoá ngang vuông góc với Oz 24
Hình 10. Chuột nhắt trắng Swiss 28
Hình 11. Ảnh SEM của mẫu E6 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc bằng Copolime poli (axit acrylic – styrene), hạt có kích thước khoảng 100nm 30
Hình 12. Máy chụp cộng hưởng từ 1.5T (MRI 1.5 Gyroscan Philips) 35
Hình 13.Hệ thống máy phát từ trường RDO, moel HFI (Mỹ) 37
Hình 14. Hình ảnh máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) (Shimadzu – Nhật Bản) 39
Hình 15. Hình ảnh khối u rắn dưới da sau 6 ngày (A), 10 ngày (B) và 17 ngày (C) cấy truyền 42
Hình 16. Khối u đùi gây trên chuột Swiss 43
Hình 17. Ảnh hiển vi quang học tế bào MCF7 trước (a) và sau khi bổ sung hạt từ H01 nồng độ 0.1ng/1 tế bào (b) (TK 10 x VK 40 x zoom 5.6) 45
Hình 18. Hình ảnh tế bào HepG2 khi bổ sung hạt từ H01 ở các nồng độ khác nhau (TK 10 x VK 20 x zoom 5.6) 45
Hình 19. Hình ảnh chuột mang u đùi tiêm tĩnh mạch 150µl hạt từ H01 sau 15 ngày 47
Hình 20. Hình ảnh tế bào HepG2 khi bổ sung hạt từ E6 với các nồng độ khác nhau và ủ trong 2 giờ (TK10 x VK 20 x zoom 4x) 48
Hình 21. Ảnh chụp cộng hưởng từ 3 chuột A, B và C, (1) – hình ảnh cắt từ trước ra sau và (2) - hình ảnh cắt từ phải sang trái 50
Hình 22. Hình ảnh khối u của chuột B và C 51
Hình 23. Các đường tăng nhiệt độ của mẫu chất lỏng từ E6 ở các nồng độ khác nhau với cường độ từ trường 60Oe, tần số dòng xoay chiều 236 kHz 53
Hình 24. Các đường tăng nhiệt độ trong các khối u ex vivo tách từ chuột TN với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz 56
Hình 25. Các đường tăng nhiệt độ trong các cơ quan tách từ 2 chuột thí nghiệm A – 60 phút và B – 180 phút với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz 58
Hình 26. Hình ảnh chuột A – Đối chứng sinh học 61
Hình 27. Ảnh chuột B - chuột đối chứng ung thư 62
Hình 28. Hình ảnh chuột đối chứng không tiêm hạt từ nhưng có chiếu từ trường (chuột C) trong 18 ngày theo dõi 63
Hình 29. Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x 3 lần nhưng không dược chiếu từ trường (chuột D) trong 13 ngày theo dõi 64
Hình 30. Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 300µg/lần x 3 lần điều trị bằng liệu pháp gia nhiệt (chuột E) trong 21 ngày theo dõi 65
Hình 31. Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x 3 lần điều trị bằng liệu pháp gia nhiệt (chuột F) trong 22 ngày theo dõi 66
Chia sẻ với bạn bè của bạn: |