Kuhn Lederer Winterstein thực hiện điều chế Carotenoid trên cột

1TỔNG QUAN

1.1LỊCH SỬ

- 1931: Kuhn – Lederer – Winterstein thực hiện điều chế Carotenoid trên cột

- 1938: Izmailov & Schraiber xây dựng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên Al₂O₃

- 1941: Martin & Synge đặt nền tảng cho sắc ký phân bố: sắc ký giấy (SKG) và sắc ký khí (SKK)

- 1952: Martin & James viết bài báo đầu tiên về SKK

- 1958: Stahl hoàn thiện phương pháp SKLM

- Cuối năm 1960: sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời

- 1980: Halppap – Sắc ký lớp mỏng pha đảo

- Đầu năm 2005: sắc ký lỏng siêu áp ra đời

1.2 ĐỊNH NGHĨA

Quá trình sắc ký đòi hỏi phải có 2 pha:

- Pha động: chất lỏng hay dòng khí mang

- Pha tĩnh:

• 
  Chất rắn hay chất mang trơ tẩm hay trộn chất lỏng
  
• 
  Tương tác với chất tan theo các cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, ái lực
  

- Nạp mẫu

- Khai triển sắc ký

• 
  Sắc ký khai triển
  
• 
  Sắc ký rửa giải: quá trình rửa giải, dung môi rửa giải (eluent), dung dịch rửa giải (eluate)
  

• 
  Màu của chất
  
• 
  Đèn tử ngoại
  
• 
  Phun thuốc thử
  
• 
  Đầu dò (detector)
  

1.3 PHÂN LOẠI

Theo bản chất vật lý các pha:

- Sắc ký lỏng – lỏng (liquid – liquid chromatography, LLC)

- Sắc ký lỏng – rắn (liquid – solid chromatography, LSC)

- Sắc ký khí – lỏng (gas – liquid chromatography, GLC)

- Sắc ký khí – rắn (gas – solid chromatography, GSC)

Theo phương tiện giữ pha tĩnh:

- Sắc ký trên cột

- Sắc ký lớp mỏng

- Sắc ký giấy

Theo cơ chế tách:

- Sắc ký hấp phụ

- Sắc ký phân bố

- Sắc ký trao đổi ion

- Sắc ký rây phân tử

- Sắc ký ái lực

Thông thường:

- Sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography, CC)

- Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)

- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)

- Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

- Sắc ký lỏng siêu áp (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)

2CÁC PHA TĨNH THÔNG DỤNG TRONG SẮC KÝ

2.1 PHA TĨNH TRONG SẮC KÝ HẤP PHỤ

2.1.1Cơ chế của sắc ký hấp phụ

Sắc ký hấp phụ dựa vào sự khác nhau về:

- Lực hấp phụ giữa bề mặt của pha tĩnh (rắn) và cấu tử

- Lực giải hấp phụ của pha động đối với cấu tử này

Pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ gọi chung là chất hấp phụ. Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel (>90%), nhôm oxit (<5%). Các loại khác như than hoạt, polyamid, florisil, celite, kieselguhr… ít dùng hơn.

2.1.2Silicagel

2.1.2.1Cấu tạo, trạng thái

- Là acid polysilicic dưới dạng vô định hình, có tính acid nhẹ

- Là pha tĩnh và giá mang thông dụng nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong SKLM, SKC cổ điển

- Là chất hấp phụ phân cực, pha thuận

- Các geminal silanol và các silanol lân cận nhau trong không gian có thể nối cầu hydro với nhau tạo các nhóm silanol kết hợp:

• 
  Các mẫu có liên kết hydro thì hấp phụ chủ yếu ở vị trí các silanol tự do
  
• 
  Các mẫu có nhóm –OH thì hấp phụ chủ yếu ở các vị trí các nhóm geminal silanol
  

2.1.2.2Cơ chế hấp phụ và đặc điểm

- Là chất hấp phụ phân cực, pha thuận

- Có nhiều trung tâm xúc tác

- Khả năng hấp phụ tương đối lớn, có thể xảy ra quá trình hấp phụ không thuận nghịch, đặc biệt với các chất phân cực (hợp chất phenol, flavonoid…). Silicagel hấp phụ các chất có tính kiềm hơn là các chất có tính acid.

- Phân tách tốt cho các chất có độ phân cực yếu đến trung bình

- Sử dụng dung môi theo độ phân cực tăng dần, các chất tách ra cũng có độ phân cực tăng dần.

- Lượng nước cao, sử dụng dung môi có nước làm cho Silicagel có thêm cơ chế phân bố, nhiều trường hợp trở thành cơ chế chính

- Khả năng hấp phụ của silicagel phụ thuộc vào:

• 
  Kích thước tiểu phân
  
• 
  Cấu trúc bản silicagel
  
• 
  Số lượng nhóm silanol trên bề mặt: mật độ nhóm silanol càng cao thì khả năng hấp phụ của silicagel càng lớn
  
• 
  Tình trạng ngậm nước của hệ thống
  

Bảng 1. Khả năng hấp phụ của silicagel

T (oC)	Ngậm nH2O	Khả năng hấp phụ	Tính chất	Tình trạng
<70	n = 3	Rất kém	Hoạt hóa được	Bị hút ẩm
~70	n = 2	Kém	Hoạt hóa được	Bị hút ẩm
100-120	n = 1	Tối ưu	Hấp phụ tốt	Được hoạt hóa
200-450	n = 0	Mạnh, không giải hấp được	Phục hồi được	Bắt đầu trơ
450-1100	n = (-1)	Mất hoàn toàn	Hết phục hồi	Hết sử dụng

Nên sấy silicagel ở 105^oC x 2 giờ là đủ, không nên đun nóng quá 450 ^oC

Cần tránh:

- Tránh dùng các dung môi có pH > 8,5 để khai triển cột vì có thể gây hỏng dần cấu trúc silicagel trong cột

- Tránh nhầm lẫn khi cô các phân đoạn có MeOH để lấy cắn vì Silicagel có thể hòa tan trong MeOH.

2.1.2.3Phạm vi ứng dụng

- Trong SKLM, SKC

- Thường áp dụng cho các chất : hydrocarbon, alkaloid, chất màu thực phẩm và lipid…

- Loại tạp polyphenol

- Làm giá mang cho pha tĩnh lỏng, pha liên kết

2.1.2.4Ưu, nhược điểm

- Có thể phục hồi sau khi sử dụng: sau khi tái chế (1 đến 2 lần) hạt silicagel có thể giảm kích thước đôi chút, tốc độ chảy có hơi giảm đi nhưng không gây ảnh hưởng quan trọng.

- Kích thước hạt silicagel thay đổi tùy theo mục đích sử dụng:

• 
  Silicagel SKLM
  

Dạng bột rời: 5-30m

Dạng tráng sẵn

Bản tráng sẵn HPTLC: 2-15 m

• 
  Silicagel SKC
  

Cỡ hạt nhỏ: 15-40m

Cỡ hạt trung bình: 40-63m

Cỡ hạt thô: 63-200m

- Silicagel có thể được thêm các chất phụ gia:

• 
  Có chất dính
  
• 
  Có chất phát huỳnh quang 254 nm (Silicagel F₂₅₄)
  
• 
  Tẩm các chất làm thay đổi tính chất , tính chọn lọc của silicagel: tẩm các pha tĩnh lỏng, tẩm các chất tạo phức (boric, AgNO₃…)
  

2.1.2.5Một số ký hiệu thường gặp

VD: Kieselgel 60 HF_254S, Kieselgel 100 PK_254+365 Mesh 400 – 230 ASTM

- Kieselgel = si-gel = silicagel = silica-gel = gel de silice = silicic acid = SiO₂.nH₂O (tránh nhầm với Kieselguhr là một loại chất hấp phụ khác)

- Số ngay sau chữ Kieselgel (40, 60, 80, 100) chỉ đường kính lỗ xoang của hạt silicagel, tính bằng Angstrom. Thường dùng nhất là silicagel 60.

- Mesh: là đơn vị đo tiêu chuẩn ASTM (American Society for Testing and Materials), cho biết kích thước của hạt. Mesh 200 có nghĩa là hạt (si-gel…) có thể lọt qua 1 rây có 200 lỗ / inch. Số Mesh càng lớn thì cỡ hạt càng nhỏ và ngược lại.

- Số Mesh và đường kính hạt (d) luôn luôn được ghi trên nhãn hộp đựng chất hấp phụ

Số Mesh	400	270	230	200	170	120	100	80	70
d hạt (μm)	38	53	63	75	90	125	150	180	212

- Si-gel G: cỡ hạt mịn (5 – 30 μm), chứa cỡ 13 – 15 % Gypsun (CaSO₄ - chất bám dính) chỉ dùng cho SKLM. Si-gel GF 254: là Si-gel SKLM có trộn chất phát huỳnh quang. Không dùng các loại silicagel G, GF cho SKC thường.

- Si-gel P: cỡ hạt mịn, dùng cho SKLM chế hóa (preparative).

- Si-gel H = Si-gel N: không trộn chất bám dính, cỡ hạt mịn, dùng cho cả SKLM (hơi dính kèm) lẫn SKC (VLC = sắc ký chân không, FC = sắc ký cột nhanh).

- Si-gel F 254: là Si-gel SKC có trộn chất phát huỳnh quang ở 254 nm .Sau số 254 nếu có chữ S (F254 S): cho biết nó bền trong môi trường acid.

2.1.3Oxyd nhôm

2.1.3.1Cấu tạo, trạng thái

- Là oxyd nhôm ngậm nước

- Kích thước hạt thường thô hơn so với silicagel

- Cấu tạo bởi những nguyên tử Al nối với các nguyên tử oxygen thành trạng thái bát diện hay tứ diện

- Mặt ngoài nguyên tử Al được liên kết với những nhóm –OH tự do tạo thành các trung tâm hấp phụ

400^oC x 24h

2.1.3.2Phân loại

- 3 dạng oxyd nhôm : kiềm, trung tính hay acid

- Các dạng này có thể chuyển đổi qua lại bằng cách thêm kiềm hay acid

2.1.3.3Cơ chế hấp phụ

- Hấp phụ mạnh với những chất phân cực mạnh (flavonoid, tannin, các polyphenol khác … ) và giữ chúng lại trên cột. Các chất có độ phân cực yếu đến trung bình ít bị giữ lại hơn sẽ tách ra.

- Khả năng hấp phụ của oxyd nhôm phụ thuộc vào:

• 
  Tình trạng ngậm nước: giảm hoạt tính khi hút ẩm vì vậy cần sấy hoạt hoá trước khi dùng. Nhiệt độ sấy càng cao, oxyd nhôm càng hoạt động. Thường thì phải hoạt hóa ở 120⁰ C trong 1 giờ trước khi dùng (đôi khi hoạt hoá ở nhiệt độ cao hơn và thời gian dài hơn).
  
• 
  Kích thước hạt: hạt càng nhỏ thì tính hấp phụ càng cao và tốc độ chảy chậm. Cỡ hạt thông dụng là: 40-63 và 63-200μm.
  

Hoạt độ oxyd nhôm phụ thuộc vào lượng nước chứa trong nó, lượng nước càng thấp hoạt độ càng cao. Oxyd nhôm được hoạt hoá cao độ khi hoàn toàn mất nước (Độ I)

- Xác định bậc hoạt tính của oxyd nhôm dựa vào giá trị Rf của mẫu chuẩn (amino-azobenzen, Soudan vàng, Soudan đỏ) khi cho chạy lên cột oxyd nhôm.

Bảng 3. Hoạt tính của oxyd nhôm theo Thang hoạt độ Brockmann

Hoạt độ	I	II	III	IV	V
Ngậm nước	0%	3%	6%	10%	15%

2.1.3.4Ứng dụng trong SKLM, SKC

- Áp dụng tách các chất : hydrocarbon, alkaloid, carbonyl, chất màu thực phẩm và lipid…

- Loại tạp polyphenol

2.1.3.5Ưu nhược điểm

- Không tách được các chất phân cực mạnh vì bị giữ chặt vào oxyd nhôm

- Sử dụng được trong sắc ký trao đổi ion vì có tính trao đổi ion lưỡng tính (trao đổi cả cation và anion)

2.1.4Than hoạt

2.1.4.1Cấu tạo, trạng thái

Than hoạt là đơn chất của nguyên tố Carbon ở dạng vô định hình, một phần có dạng tinh thể vụn graphit. Than hoạt hiểu đơn giản là than được “hoạt hoá”, nghĩa là được làm tăng diện tích tiếp xúc lên rất lớn để sử dụng vào mục đích hấp phụ.

2.1.4.2Phân loại

Có 3 loại than: than graphit, than xốp, than hoạt.

- Than graphit

• 
  Là một dạng thụ hình của Carbon trong đó các nguyên tử carbon liên kết với nhau thành thành hình lục giác xếp thành từng lớp, giữa các lớp cũng liên kết với nhau nhưng lỏng lẻo hơn.
  
• 
  Diện tích bề mặt nhỏ nên không được xem là than hoạt
  
• 
  Dùng làm chất hấp phụ hay giá trong sắc ký khí dưới dạng hạt cỡ 30 μm
  

- Than xốp

• 
  Có lỗ xốp nhỏ(13 Å), diện tích bề mặt lớn (1000 m²/g).
  
• 
  Dùng loại bỏ khí trong dung môi của SKL hay khí tạp trong SKK.
  

- Than hoạt

• 
  Là loại than có diện tích bề mặt rất lớn từ 500-2500 m²/g do có cấu trúc xơ rỗng.
  
• 
  Có tính hấp phụ rất mạnh nhờ các vết rỗng, nứt trong cấu trúc.
  
• 
  Hấp phụ được phần lớn các chất hữu cơ, trừ các chất có phân tử lượng nhỏ.
  
• 
  Dạng bột rất ít được sử dụng trong sắc ký cột vì bột có màu sậm và khả năng hấp phụ yếu.
  

2.1.4.3Ứng dụng

- Loại sắc tố tạp ra khỏi dịch chiết dược liệu

- Tinh chế các chất ít bị than hoạt hấp phụ (saponin, alkaloid…)

- “Bẫy” các chất cần nghiên cứu vào than hoạt, sau đó phản hấp phụ bằng một dung môi thích hợp.

2.1.5Polyamid

2.1.5.1Cấu tạo, trạng thái

- Là một loại polymer được tạo thành từ các monomer là các amid, các đơn phân (monomer) liên kết với nhau tạo thành mạng lưới 3 chiều.

Hình:

- Polyamid được sản xuất bằng cách phản ứng ngưng tụ giữa một nhóm amino với một nhóm carboxylic hoặc một nhóm clorur acid.

2.1.5.2Cơ chế hoạt động

- Cơ chế phân bố (cơ chế chính): nhờ các xoang rỗng của polyamid

- Cơ chế hấp phụ: do tạo thành các liên kết hydro thuận nghịch giữa các nhóm chức của mẫu với nhóm Carbonyl (C=O) của polyamid

2.1.5.3Ứng dụng

- Thường dùng để tách sơ bộ các nhóm hợp chất trong các quy trình chiết tách.

- Phân lập các chất như: alkaloid, phenol, sulfonic, carboxylic, amino acid …

- Các Polyamid thông dụng là Polyamid 6 và Polyamid 11.

2.1.6Các chất hấp phụ khác

- MgO.xH₂O

- Kieselguhr (polyamide): là dạng tự nhiên của acid silic, hoạt động bề mặt nhỏ hơn silicagel, thích hợp hấp phụ parafin, dầu silicone, undecane.

- Florisil (silicagel + MgO): kém phân cực và có tính acid yếu hơn so với silicagel, thích hợp tách các hợp chất olefin và hợp chất thơm

- Celite: pha đảo, phân tách được 14 hormon sinh dục nam.

2.1.7Các cải tiến trên pha tĩnh sắc ký

- Silicagel G: hạt mịn, chứa 13-15% Gypsum, chỉ dùng trong SKLM

- Silicagel GF 254: silicagel SKLM có tẩm chất phát quang ở bước sóng 254nm

- Silicagel P: hạt mịn, dùng trong SKLM chế hoá

- Cellulose xử lý với diethyl aminoethyl đóng vai trò như chất trao đổi ion

Каталог: before2015
before2015 -> Nhớ Anh Yêu – Học cho tốt nhe! ÔN tập phân loại thực vật nè em nhóm các ngành quyết và thôNG

tải về 236.63 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn: