Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Linh LỜi cảM ƠN



trang8/12
Chuyển đổi dữ liệu19.07.2016
Kích1 Mb.
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số


Mẫu lá của từng dòng được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến.

  • Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C.

  • Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn.

  • Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800µl CTAB buffer và 60 µl SDS 10%.

  • Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.

  • Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới.

  • Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1). Thu được dịch chiết chứa ADN.

  • Tủa ADN bằng ethanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ.

  • Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.

  • Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE.

  • Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% .

2.2.2. Phản ứng PCR

Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể như sau:



STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

Nước cất hai lần khử ion

3,2

2

Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM

1

3

dNTPs 10mM

1,0

4

Taq ADN polymerase 1U/µl

0,8

5

Mồi xuôi 5µM

1,5

6

Mồi ngược 5µM

1,5

7

ADN 10g/µl

1

Tổng thể tích của một phản ứng

10,0

* Chương trình PCR:

Các bước

Nhiệt độ (oC)

Thời gian

Số chu kỳ

I

94

5 phút

1

II

94

1 phút

35

56

45 giây

72

1 phút

III

72

7 phút

1

Giữ mẫu ở 40C

2.2.3. Điện di sản phẩm PCR

+ Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 12cm):



  • Nước cất khử ion: 22,2ml

  • 10X TBE: 1,5ml

  • Dung dịch acrylamide 40%: 6ml

  • Dung dịch APS 10%: 300µl

  • Dung dịch TEMED: 25µl

  • Tổng thể tích gel: 30ml

Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính.

+ Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker X174 ở điều kiện 150V.

Thời gian điện di khoảng 50-60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.

2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu

Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng lúa, các kết quả thu được từ quá trình điện di sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN.



  • Số 1: các allele có xuất hiện băng ADN

  • Số 0: các allele không xuất hiện băng ADN

  • Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các allele (mất số liệu)

Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi.

- Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau:

PIC =1 - Pi2

Trong đó: Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i

Sau đó, số liệu được chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 để phân tích, tìm ra hệ số tương đồng di truyền (Jaccard) và thành lập cây quan hệ phát sinh.

- Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi giống lúa được tính theo công thức:



Trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện nhiều hơn 1 băng ADN/1 locus SSR.

Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN.

M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu.

- Tính tỷ lệ số mồi không xuất hiện băng ADN (M%) bằng công thức:

Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng AND.

M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu.


: phenotype -> upload -> article
article -> MỤc lục báo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 7)
article -> MỤc lụC ĐẶt vấN ĐỀ
article -> BÁo cáo kết quả thực hiện chuyêN ĐỀ nghiên cứu khoa họC (Chuyên đề 5)
article -> 1. 1 Vài nét sơ lược về cây lú
article -> ĐẶt vấN ĐỀ 2 I. TỔng quan nghiên cứU 3
article -> ĐÁnh giá Đa dạng di truyền tậP ĐOÀn giống lúa có khả NĂng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử ssr
article -> MỤc lụC 1 Triệu chứng bệnh 4
article -> Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng
article -> Xanthomonas oryzea pv oryze, đ
article -> ChuyêN ĐỀ 1 Tách chiết adn với số lượng cực lớn, chất lượng cao của 30 giống lúa


1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   12


Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©hocday.com 2019
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương